枯草芽孢桿菌對鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)、幼苗生長及其生理特性的影響

安明哲，張巖，張妤，徐敬業(yè)，王洋

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130033；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，吉林 長春 130033；3.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生研究所，吉林 公主嶺 136100)

土壤鹽堿化是限制種子萌發(fā)、植株生長和降低果實品質(zhì)的主要非生物脅迫因素之一[1]，世界范圍內(nèi)近7%的土地面積和30%的農(nóng)田受到土壤鹽漬化影響[2]。我國東北地區(qū)的鹽堿地是世界三大蘇打鹽堿土集中區(qū)之一，土壤鹽漬化已經(jīng)對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成巨大危害。隨著鹽漬土面積的不斷擴(kuò)大[3]，如何有效利用和改良鹽漬土地資源成為亟待解決的重大問題。

吉林省高粱種植面積連年超過9萬hm2，出口量超過7 000 t/年，出口額超過300萬美元/年，排名全國第二[4]。另外，高粱還是東北三省重要的雜糧作物之一，在農(nóng)作物生產(chǎn)體系中具有不可替代的優(yōu)勢，因其具有一定的耐鹽堿、耐旱能力且水分利用率高而成為種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中重要的替代作物。然而，較多的研究表明，高粱種子萌發(fā)期和幼苗期對土壤高鹽含量較敏感，且不同高粱品種表現(xiàn)出較大差異，土壤含鹽量超過一定濃度時種子萌發(fā)率會明顯降低，成苗率下降，且嚴(yán)重影響后期出穗能力，大幅降低產(chǎn)量[5，6]。因此，在鹽堿地上種植高粱時，通過一定方法提高種子萌發(fā)期和幼苗期的耐鹽能力是提高產(chǎn)量的首要問題。

芽孢桿菌(Bacillus)是一類重要的根際微生物，大量的芽孢桿菌具有促生和防病作用[7，8]。研究表明，一些芽孢桿菌具有提高植物耐鹽堿、耐干旱、耐低溫的能力，可長期定殖在植物根系，誘導(dǎo)建立耐鹽體系，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育體系和一系列生理變化，從而提高植物的耐鹽能力，保證正常生長:Hafsa等[9]研究發(fā)現(xiàn)，定殖在小麥根系的枯草芽孢桿菌D7能夠大量分泌生長素吲哚乙酸(IAA)，促進(jìn)小麥根系生長，并進(jìn)一步與體內(nèi)的耐鹽物質(zhì)結(jié)合來提高小麥的耐鹽能力；Ouhaddou等[10]研究表明，根際促生菌可侵染生菜根系，通過提高生菜體內(nèi)抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來緩解鹽脅迫；Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，耐鹽芽孢桿菌能夠通過調(diào)節(jié)植物激素水平、調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化、積累甜菜堿和排除體內(nèi)Na＋來誘導(dǎo)小麥的應(yīng)激反應(yīng)，從而促進(jìn)小麥生長，提高其耐鹽脅迫能力。因此，篩選耐鹽堿根際促生菌并利用其提高作物的耐鹽堿能力、促進(jìn)作物生長、提高作物產(chǎn)量是鹽堿地綜合治理和利用的重要研究方向。

本研究以前期課題組篩選獲得的一株根際枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，編號:SN3)為試驗菌株，以高粱品種吉雜319為試材，通過測定SN3對鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)指標(biāo)、幼苗生長指標(biāo)以及苗期根系滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性的影響，探究其對鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)和幼苗的促生作用，以期初步解釋枯草芽孢桿菌(SN3)對鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)和幼苗生長的作用機(jī)制，為鹽堿地高粱種植提供技術(shù)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試枯草芽孢桿菌菌株(Bacillus subtilis，編號:SN3)從吉林鹽堿地(125.12156°E，42.5675°N)土壤中分離得到，保存于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所。供試高粱品種吉雜319來源于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所。通用營養(yǎng)土購自申之北園藝旗艦店，有機(jī)質(zhì)含量為324 g/kg、總氮10.1 g/kg、有效磷24.06 mg/kg、速效鉀364 mg/kg，pH 6.29。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體制備 取甘油保存的SN3試管種，劃線培養(yǎng)于固體LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24 h，次日接種于液體LB培養(yǎng)基(250 mL錐形瓶，裝LB培養(yǎng)液100 mL)中，37℃、140 r/min搖床培養(yǎng)48 h，5 000 r/min離心10 min，分離收集菌體，分離后的發(fā)酵液4℃保存。之后，菌體用無菌蒸餾水振蕩清洗3次，相同條件下離心并收集干凈菌體，用無菌水稀釋并調(diào)整水量使菌懸液在600 nm下的OD值為0.8，4℃保存。

1.2.2 不同濃度NaCl脅迫下的種子萌發(fā)試驗試驗于2022年2—7月在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所溫室大棚內(nèi)進(jìn)行。將低溫保存的高粱種子于25℃下放置24 h，再選取顆粒飽滿一致、無蟲眼的種子，用無菌水沖洗3次、浸泡12 h，去掉漂浮種子后用0.2%高錳酸鉀溶液浸種20 min，無菌水沖洗3遍，備用。NaCl溶液配制:分別用無菌水配制出0、50、100、150、200、250、300 mmol/L的NaCl溶液，121℃滅菌15 min，冷卻至室溫備用。將高粱種子置于底部鋪有2層濾紙的發(fā)芽盤中，每盤20粒，分別加入不同濃度NaCl溶液15 mL，每個濃度處理重復(fù)3次。發(fā)芽盤置于人工氣候箱中，28℃、LED光/暗為14 h/10 h下培養(yǎng)。

1.2.3 菌株SN3對鹽脅迫下種子萌發(fā)的影響試驗 將篩選并經(jīng)消毒后的種子分別進(jìn)行以下4個浸泡處理。其中，A處理:菌株發(fā)酵液(不含菌體)；B處理:菌懸液(不含發(fā)酵液)；C處理:LB液體培養(yǎng)液(不含菌體和發(fā)酵液)；D處理:無菌蒸餾水。高粱種子在不同處理液下浸泡8 h，然后置于底部鋪有2層濾紙的發(fā)芽盤中，每個發(fā)芽盤20粒，每個處理6盤。配制出0、150 mmol/L NaCl溶液。每個處理分成兩組，分別在2組發(fā)芽盤中倒入15 mL兩種NaCl溶液，各3盤，置于人工氣候箱中28℃、LED光/暗為14 h/10 h下培養(yǎng)。濾紙2天更換1次，同時倒入NaCl溶液15 mL。每隔12 h觀察高粱種子的發(fā)芽情況，用游標(biāo)卡尺測量胚芽、胚根長度。具體試驗組別見表1。

1.2.4 菌株SN3對鹽脅迫下高粱幼苗生長的影響試驗 采用盆栽法在人工氣候室中進(jìn)行試驗，幼苗生長條件為:28℃、LED光/暗為14 h/10 h、空氣濕度65%～75%。加侖盆高12cm，直徑16cm。每盆裝入營養(yǎng)土600 g，播10粒種子。設(shè)置8個處理，每個處理3盆，組別見表1。每天觀察種子萌發(fā)情況，當(dāng)大部分幼苗高度大于3 cm時，開始進(jìn)行鹽脅迫試驗，同時去掉弱苗，每盆留苗5株。第1天，每盆加入對應(yīng)處理的SN3發(fā)酵液、SN3菌懸液、LB液體培養(yǎng)液、無菌蒸餾水50 mL，記為灌根處理第1次；5天后灌根第2次，常規(guī)管理；之后3天進(jìn)行0、150 mmol/L NaCl溶液50 mL灌根處理，繼續(xù)常規(guī)管理。鹽脅迫15天時取幼苗，洗凈根部，分別測量苗高、莖粗。將幼苗地上、地下部分開，洗凈后用濾紙吸干表面水分，放入烘箱中105℃處理20 min后75℃烘干至恒重，分別稱取地上干重和地下干重。采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定高粱幼苗根系活力[12]。

表1 鹽脅迫下高粱幼苗生長處理

1.3 測定項目及方法

1.3.1 高粱種子萌發(fā)指標(biāo)測定 當(dāng)胚根長度大于種子長度一半時，認(rèn)定為該種子萌發(fā)。第一粒種子發(fā)芽后連續(xù)觀察10天，于第2天、第5天、第10天記錄種子的胚芽和胚根長度。

發(fā)芽率(%)＝10天發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100；

發(fā)芽勢(%)＝5天發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100；

發(fā)芽指數(shù)＝Σ(第n天發(fā)芽種子數(shù)/相應(yīng)種子發(fā)芽天數(shù))；

活力指數(shù)＝發(fā)芽指數(shù)×(胚根長度＋胚芽長度)。

1.3.2 高粱幼苗生理生化指標(biāo)測定 取幼苗根系，洗凈后用濾紙吸干表面水分。各組均稱取樣品0.1 g，放入1.5 mL離心管中，再分別加入4℃保存的磷酸鹽緩沖液0.9 mL，－80℃預(yù)凍8 h后在研磨器下制備成勻漿，再12 000 r/min低溫離心5min，吸取上清液用于相關(guān)指標(biāo)測定?？扇苄蕴恰⒏彼?Pro)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性采用南京建成生物工程研究所試驗盒測定。

1.3.3 高粱根系離子含量測定 取烘干幼苗根系，研磨后稱取粉末0.5 g，經(jīng)過微波消煮、灰化制備成待測樣品，用電感耦合等離子體法測定根系Na＋、K＋含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗各項指標(biāo)數(shù)據(jù)均測定3次，采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行處理，SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，Graphpad prism 8.0軟件作圖，單因素方差分析差異顯著性(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl脅迫對高粱種子發(fā)芽率的影響

由圖1可見，無菌蒸餾水處理種子發(fā)芽率達(dá)到93.78%，鹽脅迫顯著降低種子發(fā)芽率，且隨著NaCl濃度的增加發(fā)芽率降幅逐步增大，150 mmol/L NaCl處理下發(fā)芽率為57.67%，200 mmol/L NaCl時發(fā)芽率呈現(xiàn)斷崖式下降，300 mmol/L NaCl時發(fā)芽率僅為1.75%。通過SPSS回歸分析得到鹽脅迫下種子發(fā)芽率的IC50值為144.66 mmol/L，為便于統(tǒng)計，后續(xù)試驗選擇的NaCl脅迫濃度為150 mmol/L。

圖1 不同濃度NaCl脅迫對高粱種子發(fā)芽率的影響

2.2 菌株SN3對鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)的影響

從表2可知，非鹽脅迫下，菌株發(fā)酵液＋水處理的高粱種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均顯著高于其它處理(P＜0.05)，菌懸液＋水、LB液體培養(yǎng)液＋水、水＋水處理之間的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均無顯著差異，可見，SN3發(fā)酵液具有促進(jìn)種子萌發(fā)的作用。

表2 不同處理高粱種子萌發(fā)情況

鹽脅迫下，菌株發(fā)酵液＋NaCl、菌懸液＋NaCl、LB液體培養(yǎng)液＋NaCl、水＋NaCl處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均顯著降低，可見，鹽脅迫顯著抑制高粱種子萌發(fā)。與水＋NaCl處理相比，菌懸液＋NaCl、LB液體培養(yǎng)液＋NaCl處理的種子萌發(fā)指標(biāo)均無顯著差異，而菌株發(fā)酵液＋NaCl處理的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)分別提高44.23%、41.91%、86.70%、84.48%(P＜0.05)。推測菌株SN3在發(fā)酵培養(yǎng)過程中產(chǎn)生某些活性物質(zhì)，有助于提高種子的萌發(fā)率，而單獨(dú)的菌懸液浸種因浸泡時間較短，菌株產(chǎn)生的活性物質(zhì)含量低，未達(dá)到促進(jìn)種子萌發(fā)的程度。

2.3 菌株SN3對鹽脅迫下高粱幼苗生長和根系活力的影響

由表3可以看出，非鹽脅迫下，LB液體培養(yǎng)液＋水、水＋水處理之間幼苗株高、莖粗、地上干重、地下干重均無顯著差異，可見，在本試驗條件下LB液體培養(yǎng)液對幼苗生長沒有明顯影響。與水＋水處理相比，菌株發(fā)酵液＋水、菌懸液＋水處理均顯著提高幼苗株高、莖粗、地上干重和地下干重，表明菌株發(fā)酵液和菌懸液對幼苗生長具有促進(jìn)作用。與菌株發(fā)酵液＋水處理相比，菌懸液＋水處理進(jìn)一步顯著提高株高、地上干重和地下干重，表明菌株發(fā)酵液中的活性物質(zhì)只能短期促進(jìn)幼苗生長，而SN3在高粱幼苗根系土壤中成功定殖后可不斷產(chǎn)生促生物質(zhì)。

表3 SN3對鹽脅迫下高粱幼苗生長的影響

鹽脅迫下，菌株發(fā)酵液＋NaCl、菌懸液＋NaCl、LB液體培養(yǎng)液＋NaCl、水＋NaCl處理幼苗株高、莖粗、地上干重、地下干重均受到顯著抑制。與水＋NaCl相比，菌株發(fā)酵液＋NaCl、菌懸液＋NaCl處理幼苗株高、莖粗、地上干重、地下干重均顯著提高，分別提高32.62%、21.86%、62.69%、23.68%和66.90%、42.21%、77.99%、34.21%。與菌株發(fā)酵液＋NaCl相比，菌懸液＋NaCl處理幼苗生長指標(biāo)進(jìn)一步提高，說明菌懸液對幼苗的促生作用顯著大于單獨(dú)的菌株發(fā)酵液。

由圖2可知，4個鹽脅迫處理幼苗的根系活力均顯著低于非鹽脅迫處理。非鹽脅迫下，菌株發(fā)酵液＋水和菌懸液＋水處理的根系活力顯著高于LB液體培養(yǎng)液＋水和水＋水處理。鹽脅迫下，菌懸液＋NaCl處理幼苗的根系活力最高，其次是菌株發(fā)酵液＋NaCl處理，均顯著高于LB液體培養(yǎng)液＋NaCl、水＋NaCl處理。雖然鹽脅迫下菌株發(fā)酵液和菌懸液均能提高幼苗的根系活力，但仍難以恢復(fù)到非鹽脅迫水平。

圖2 不同處理對高粱幼苗根系活力的影響

2.4 菌株SN3對鹽脅迫下高粱幼苗根系細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

可溶性糖和脯氨酸作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物受到非生物脅迫時會大量積累，降低細(xì)胞滲透勢，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，緩解外界環(huán)境造成的脅迫作用[13]。由圖3可知，非鹽脅迫下，高粱幼苗根系中兩種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量維持在一個較低水平，菌株發(fā)酵液＋水、LB液體培養(yǎng)液＋水與水＋水處理間無顯著差異，而菌懸液＋水一定程度上提高兩種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量。

圖3 不同處理高粱幼苗根系的可溶性糖和脯氨酸含量

鹽脅迫下，菌株發(fā)酵液＋NaCl、菌懸液＋NaCl、LB液體培養(yǎng)液＋NaCl、水＋NaCl處理可溶性糖和脯氨酸含量顯著高于對應(yīng)的非鹽脅迫處理，可見，NaCl溶液灌根對幼苗產(chǎn)生嚴(yán)重的脅迫作用，導(dǎo)致根系可溶性糖和脯氨酸含量顯著上升。菌株發(fā)酵液＋NaCl、LB液體培養(yǎng)液＋NaCl、水＋NaCl處理根系脯氨酸含量不存在顯著差異，而菌株發(fā)酵液＋NaCl處理可溶性糖含量顯著高于LB液體培養(yǎng)液＋NaCl。與水＋NaCl相比，菌懸液＋NaCl處理可溶性糖和脯氨酸含量顯著上升，分別提高26.37%、37.25%。表明菌株SN3在高粱幼苗根系土壤中定殖產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物能刺激鹽脅迫下根系中可溶性糖和脯氨酸積累，從而降低滲透脅迫損傷，增強(qiáng)抗逆性。

2.5 菌株SN3對鹽脅迫下高粱幼苗根系中離子含量的影響

從表4中可知，非鹽脅迫下，菌株發(fā)酵液＋水、菌懸液＋水、LB液體培養(yǎng)液＋水、水＋水處理間高粱幼苗根系的K＋含量、Na＋含量、K＋/Na＋值均無顯著差異，K＋含量均大于24 mg/kg，Na＋含量均低于5 mg/kg，K＋/Na＋值均大于5。說明，非鹽脅迫下這4個處理的高粱幼苗根系中K＋、Na＋水平維持在一個平衡狀態(tài)，菌株發(fā)酵液、菌懸液灌根對根系離子平衡沒有顯著影響。

表4 不同處理高粱幼苗根系的離子含量

鹽脅迫下，菌株發(fā)酵液＋NaCl、菌懸液＋NaCl、LB液體培養(yǎng)液＋NaCl、水＋NaCl處理根系Na＋含量均顯著上升，K＋含量則顯著下降，K＋－Na＋平衡被嚴(yán)重打破，說明鹽脅迫對高粱幼苗根系產(chǎn)生嚴(yán)重的離子毒性。與水＋NaCl相比，菌株發(fā)酵液＋NaCl、菌懸液＋NaCl處理根系K＋含量顯著升高，分別提高33.29%、102.84%；Na＋含量則顯著降低，分別降27.74%、43.44%；K＋/Na＋比同樣顯著升高。表明鹽脅迫下SN3菌懸液和發(fā)酵液灌根均具有緩解鹽脅迫下根系離子失衡的作用，而菌懸液灌根效果更佳。

2.6 菌株SN3對鹽脅迫下高粱幼苗根系ROS、MDA含量的影響

從圖4可知，鹽脅迫處理(菌株發(fā)酵液＋NaCl、菌懸液＋NaCl、LB液體培養(yǎng)液＋NaCl、水＋NaCl)幼苗根系超氧陰離子(O2·－)產(chǎn)生速率和MDA含量均顯著高于非鹽脅迫處理(菌株發(fā)酵液＋水、菌懸液＋水、LB液體培養(yǎng)液＋水、水＋水)。

圖4 不同處理高粱幼苗根系的ROS、MDA含量

鹽脅迫下，與水＋NaCl相比，LB液體培養(yǎng)液＋NaCl處理根系O2·－產(chǎn)生速率和MDA含量無顯著差異，菌株發(fā)酵液＋NaCl、菌懸液＋NaCl處理O2·－產(chǎn)生速率和MDA含量顯著降低，分別降20.52%、22.93%和38.53%、51.53%。與菌株發(fā)酵液＋NaCl相比，菌懸液＋NaCl處理O2·－產(chǎn)生速率和MDA含量顯著降低，分別降22.66%和37.11%。表明SN3菌懸液和菌株發(fā)酵液灌根一定程度上能緩解鹽脅迫對高粱幼苗根系細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激作用，以SN3菌懸液的效果更好。

2.7 菌株SN3對鹽脅迫下高粱幼苗根系抗氧化酶活性的影響

圖5顯示，鹽脅迫下，菌株發(fā)酵液＋NaCl、菌懸液＋NaCl、LB液體培養(yǎng)液＋NaCl、水＋NaCl處理根系SOD、POD活性均顯著高于對應(yīng)的非鹽脅迫處理，而CAT活性均低于對應(yīng)的非鹽脅迫處理。非鹽脅迫下，菌株發(fā)酵液＋水、LB液體培養(yǎng)液＋水、水＋水處理之間SOD、CAT、POD活性無顯著差異，但均顯著低于菌懸液＋水處理?？梢?，SN3定殖在幼苗根系或土壤中，可以提高植株的抗氧化活性，從而降低鹽脅迫損傷。

圖5 不同處理高粱幼苗根系的抗氧化酶活性

無論鹽脅迫還是非鹽脅迫下，菌懸液處理的SOD、POD、CAT活性均顯著高于菌株發(fā)酵液、LB液體培養(yǎng)基及水處理，其次為菌株發(fā)酵液處理，表明菌株發(fā)酵液和菌懸液均能提高鹽脅迫下高粱幼苗根系的酶活性，且菌懸液的作用更強(qiáng)。

2.8 高粱幼苗根系氧化應(yīng)激指標(biāo)與根系活力、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的相關(guān)性分析

從表5可以看出，根系活力、K＋與SOD、CAT、POD、MDA、ROS呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。高粱幼苗在受到NaCl脅迫時根系K＋含量會顯著降低，ROS大量積累對根系細(xì)胞造成氧化損傷，導(dǎo)致MDA含量增加，根系活力下降，此時體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)被激活，SOD、CAT、POD活性升高，從而清除過多的氧自由基，維持細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化平衡。SOD、POD、ROS與脯氨酸呈極顯著或顯著正相關(guān)，SOD、CAT、POD、MDA、ROS與可溶性糖、Na＋間均呈顯著或極顯著正相關(guān)，說明鹽脅迫會導(dǎo)致根系Na＋含量顯著上升，破壞根系離子平衡，植株會通過提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(脯氨酸、可溶性糖)含量和抗氧化酶活性來提高抗逆性。

表5 高粱幼苗根系氧化應(yīng)激指標(biāo)與根系活力、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌SN3對鹽脅迫下高粱幼苗的抗鹽促生作用

研究表明，枯草芽孢桿菌對非生物脅迫(高鹽、干旱、水淹等)具有較強(qiáng)的耐受性，且能協(xié)同提高根際植物的抗逆性[14，15]。陸葉[16]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對鹽脅迫下的紫花苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長具有明顯的促進(jìn)作用；Hamid等[17]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Y16可通過提高鹽脅迫下向日葵的K＋與Na＋比來緩解鹽脅迫作用；Qi等[18]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可以通過提高黃瓜體內(nèi)抗氧化酶活性來減輕鹽脅迫作用，這些研究結(jié)果均表明枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的緩解植物鹽脅迫的作用。本研究結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌SN3的發(fā)酵液能夠顯著提高高粱種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)；菌株發(fā)酵液和菌懸液都能促進(jìn)高粱幼苗生長，顯著提高根系活力。其原因可能是SN3在發(fā)酵和土壤定殖過程中產(chǎn)生了某些生物活性物質(zhì)，如生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素等，激活了種子的休眠，促進(jìn)根系生長，從而提高種子和幼苗的抗逆性。李麗艷等[19]研究表明，從鹽地堿蓬篩選獲得的耐鹽促生芽孢桿菌具有較強(qiáng)的分泌生長素能力，從而促進(jìn)燕麥生長；高亞慧[20]篩選獲得的芽孢桿菌可通過分泌生長素、水楊酸、赤霉素對煙草產(chǎn)生促生作用。另有原因可能是，SN3在土壤中具有溶磷、解鉀、分泌鐵載體等作用，可為植株生長提供更全面的營養(yǎng)元素，進(jìn)而促進(jìn)幼苗生長[21，22]。

3.2 枯草芽孢桿菌SN3對鹽脅迫下高粱幼苗根系的滲透調(diào)節(jié)作用

鹽脅迫對植物的毒害作用之一就是使根系細(xì)胞內(nèi)滲透勢增強(qiáng)，導(dǎo)致根系水分吸收受阻，進(jìn)而影響植物的新陳代謝能力[23]?？扇苄蕴?、脯氨酸作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，鹽脅迫時會起著重要的調(diào)節(jié)作用。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下玉米幼苗體內(nèi)可溶性糖和脯氨酸含量會顯著上升，以此起著緩解鹽脅迫作用；Rashedy等[25]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下葉面噴施脯氨酸溶液可提高石榴植株的滲透調(diào)節(jié)作用，從而提高產(chǎn)量。另有研究表明，鹽脅迫下植株體內(nèi)積累的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可降低細(xì)胞內(nèi)的滲透勢，使根系吸收的水分朝植物生長方向運(yùn)輸，進(jìn)而調(diào)節(jié)植株適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境的能力，提高抗逆性[26，27]。本研究結(jié)果顯示，鹽脅迫下高粱幼苗根系可溶性糖、脯氨酸含量均顯著高于非鹽脅迫處理，枯草芽孢桿菌SN3發(fā)酵液和菌懸液灌根后根系滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量進(jìn)一步提高，且后者的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量顯著高于前者。這表明菌株SN3在根系或土壤中成功定殖后誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量活性代謝產(chǎn)物，繼而使高粱幼苗表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗?jié)B透脅迫能力。

植物生長發(fā)育離不開N、P、K等元素，這些營養(yǎng)元素不僅可以為植物合成各種代謝物質(zhì)提供碳骨架，還在滲透調(diào)節(jié)中起著重要作用。鹽脅迫會導(dǎo)致根系吸收大量的Na＋，Na＋是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生離子毒害的主要離子，細(xì)胞質(zhì)中大量的Na＋會排斥其它離子如K＋，嚴(yán)重影響植物吸收其它礦質(zhì)元素，從而使植株出現(xiàn)缺素癥。研究表明，植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)K＋含量高低與植物的耐鹽性呈顯著相關(guān)性，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)K＋/Na＋值越高，植株的耐鹽性越強(qiáng)[28，29]。本研究結(jié)果顯示，鹽脅迫下高粱幼苗根系Na＋含量顯著升高，K＋含量顯著降低，K＋/Na＋值隨之降低；用枯草芽孢桿菌SN3發(fā)酵液和菌懸液灌根后，幼苗根系K＋含量顯著上升，Na＋含量降低，K＋/Na＋值隨之升高，說明兩處理具有調(diào)節(jié)根系離子平衡的作用，可提高植株的耐鹽性。

3.3 枯草芽孢桿菌SN3對鹽脅迫下高粱幼苗根系氧化應(yīng)激的作用

研究表明，鹽脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧(ROS)對細(xì)胞造成氧化損傷，通過攻擊植物體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、脂肪等產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)，而MDA又會進(jìn)一步使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致膜的通透性增大，大量有害物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)，從而使植物的生理代謝功能發(fā)生紊亂[30]。為了維持細(xì)胞的氧化平衡，植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)會被激活，表現(xiàn)為:SOD活性增強(qiáng)，將超氧陰離子(O2·－)分解成H2O2；CAT和POD活性也隨之增強(qiáng)，將產(chǎn)生的H2O2進(jìn)一步氧化分解成水，從而消除細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[31]。研究表明，鹽脅迫下植物體內(nèi)ROS、MDA含量和抗氧化酶活性均會明顯提高，施加外源芽孢桿菌菌劑后，體內(nèi)抗氧化酶活性會進(jìn)一步提高，而ROS、MDA含量會顯著降低，從而緩解鹽脅迫作用[32]；Ali等[33]研究顯示，鹽脅迫下添加芽孢桿菌(PM25)可進(jìn)一步提高玉米幼苗體內(nèi)抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)，使抗氧化酶水平顯著升高，從而緩解鹽脅迫造成的細(xì)胞氧化損傷；Azeem等[34]研究表明，耐鹽芽孢桿菌(PM22)顯著提高鹽脅迫下玉米植株的抗氧化酶活性，降低H2O2、MDA含量。本研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌SN3發(fā)酵液和菌懸液均能顯著降低根系O2·－的產(chǎn)生速率和MDA含量，還顯著提高根系SOD、CAT、POD活性，繼而降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用，提高高粱的鹽脅迫抗性；且鹽脅迫下SN3菌懸液灌根的作用效果顯著高于發(fā)酵液，說明SN3可在150 mmol/L NaCl脅迫土壤中成功定殖，可作為生物菌劑在鹽堿地區(qū)用于提高植物的耐鹽性。

4 結(jié)論

本研究表明，150 mmol/L NaCl脅迫會嚴(yán)重抑制高粱種子萌發(fā)和幼苗生長，且鹽濃度越高，抑制作用越強(qiáng)；鹽脅迫下幼苗根系活力顯著降低，ROS、MDA含量則顯著上升，根系K＋－Na＋平衡被打破，雖激活了抗氧化酶系統(tǒng)，促進(jìn)了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，但無法抵御鹽脅迫損傷，導(dǎo)致幼苗的生理代謝受阻?？莶菅挎邨U菌SN3發(fā)酵液和菌懸液灌根則能顯著提高鹽脅迫下高粱幼苗的根系活力，促進(jìn)根系可溶性糖、脯氨酸的積累，提高K＋/Na＋值，降低根系的滲透脅迫，維持細(xì)胞內(nèi)外生理平衡，同時，還顯著降低根系ROS、MDA含量，提高抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性，從而有效緩解鹽脅迫損傷，提高高粱幼苗的抗鹽性，促進(jìn)其生長。