一種適于PCR的植物內(nèi)生真菌DNA提取方法及應(yīng)用

李瑞平宋瑩瑩李麗莉?qū)O康文門興元尹淑艷

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東 濟(jì)南 250100)

植物內(nèi)生真菌(plant endophytes)是指其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物組織和器官內(nèi)部，但不使其宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的一類真菌[1，2]。它們資源豐富、分布廣泛，自然界中幾乎每種植物都含有內(nèi)生真菌，僅近十幾年就分離鑒定了超過5 000個(gè)種，隸屬于171個(gè)屬[2－4]。目前鑒定內(nèi)生真菌的主要方法為形態(tài)學(xué)和ITS(internal transcribed spacer)間隔測序[1，4]。

ITS核苷酸序列分析的基礎(chǔ)為內(nèi)生真菌DNA提取。傳統(tǒng)的DNA提取方法主要包含CTAB法[4－12]、SDS法[9，12－20]、尿 素 法[21，22]、氯 化 芐法[22－27]、Chelex－100法[23，28－31]等，上述方法提取的模板質(zhì)量雖然很高，但操作步驟復(fù)雜、效率低下、價(jià)格昂貴，有些還涉及到大量有機(jī)溶劑的使用，增加了對試驗(yàn)人員的健康危害和環(huán)境污染。ITS間隔測序僅需要進(jìn)行一次簡單的約600 bp的PCR擴(kuò)增，對模板的質(zhì)量要求極低。因此，有必要開發(fā)一種快速、簡單、高效、安全的DNA提取方法，用于滿足內(nèi)生真菌大規(guī)模分子檢測的需要。

堿裂解法最早用于大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取，隨后由Wang等[32]成功用于植物DNA的快速提取。然而該方法在真菌DNA的快速提取中鮮見報(bào)道，僅限絲核菌屬(Rhizoctonia)和蟲草屬(Cordyceps)[33，34]。由于植物內(nèi)生真菌資源豐富，且不同種類間存在細(xì)胞壁成分以及次生代謝物的差異，因此有必要評估堿裂解法在不同種屬真菌的應(yīng)用效果。本研究在堿裂解法的基礎(chǔ)上，利用組織破碎儀快速研磨后高溫處理，篩選出合適的NaOH濃度，評估了樣本的存儲條件，進(jìn)而優(yōu)化了DNA提取流程，并成功將其應(yīng)用于68個(gè)屬內(nèi)生真菌快速鑒定。本試驗(yàn)證實(shí)了堿裂解法能夠用于植物內(nèi)生真菌PCR模板的快速制備，為進(jìn)一步拓展該方法在整個(gè)真菌界的應(yīng)用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共計(jì)773株，其中白僵菌為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株，用于提取條件優(yōu)化測試；其余772株為2021年7月在山東省130個(gè)縣采集的健康玉米、大豆、棉花等植株葉片采用表面消毒培養(yǎng)法分離[35]、挑取尖端菌絲純化獲得[36]。

1.2 試劑與引物

NaOH、Tris等生化試劑購置于生工生物工程(上海)股份有限公司，研磨珠(3 mm)購置于濟(jì)南博拓斯生物科技有限公司，PCR試劑(AG12206)購置于艾科瑞生物工程有限公司。NaOH溶液先配制成1.000 mol/L母液，隨后用無菌水分別稀釋為0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008 mol/L(編號為N1～N8)。Tris50為0.05 mol/L的Tris·HCl(pH 8.0)，簡寫為T50，其他試劑均為分析純常用試劑。引物ITS1、ITS4、LR0R、LR3R、LR7、LR5序列來源于Vilgalys Lab(https://sites.duke.edu/vilgalyslab/rdna＿primers＿for＿fungi/，表1)，由北京擎科生物科技有限公司青島分公司合成。

表1 擴(kuò)增ITS間隔和細(xì)胞核編碼的核糖體大亞基rDNA(nLSU)引物序列

1.3 提取方法

(1)1.5 mL離心管中放入兩個(gè)3 mm研磨珠，隨后加入提取緩沖液NaOH 100 μL；(2)超凈工作臺中用牙簽挑取少量菌絲(或菌苔、或菌塊)于上述離心管中；(3)采用RETSCH MM400組織研磨儀于25 Hz破碎2 min，瞬時(shí)離心；(4)置于90℃金屬浴中3～5 min(時(shí)間過長需排氣)，瞬時(shí)離心；(5)加入300 μL的T50，即為制備的PCR模板，－20℃或室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系(25 μL):ApexHF HS DNA Polymerase FS Master Mix(AG12206)12.5 μL，引物(0.3 μmol/L)0.75 μL，模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)在BioRAD MyCycler型PCR儀上進(jìn)行，ITS擴(kuò)增程序:94℃2 min；進(jìn)行12個(gè)循環(huán)的Touchdown PCR，條件為98℃10 s，60℃(－0.5℃/Cycler)10 s，72℃10 s；98℃10 s，54.5℃10 s，72℃10 s，共34個(gè)循環(huán)；最后72℃2 min，10℃保存。nLSU(LROR/LR3R/LR5/LR7)擴(kuò)增程序:94℃2 min；98℃10 s，49℃10 s，72℃30 s，共34個(gè)循環(huán)；72℃2 min，10℃保存。

1.5 檢測方法

采用1.2% TAE瓊脂糖電泳(6 V/cm，30 min)進(jìn)行檢測，EB染色，UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照。PCR產(chǎn)物委托青島蔚來生物科技有限公司進(jìn)行Sanger測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同緩沖液制備DNA溶液的狀態(tài)

以白僵菌為試材，采用11種提取緩沖液按照1.3進(jìn)行DNA提取，其中樣本溶液狀態(tài)、固體懸浮物量以及懸浮物狀態(tài)觀察點(diǎn)為1.3中第(3)步驟瞬時(shí)離心前，而離心后沉淀狀態(tài)為第(4)步瞬時(shí)離心后。結(jié)果(表2)表明，N1和N2兩種緩沖液裂解菌體后呈現(xiàn)均一狀態(tài)，其他緩沖液裂解不徹底，特別是N5、N6、N7、N8、T50、TE、DDW裂解菌體后存在大量組織碎片。因此，N1和N2兩種緩沖液裂解菌體效果最好，本著節(jié)約成本考慮，后續(xù)測試選擇N2緩沖液。

表2 不同緩沖液制備DNA模板樣本的狀態(tài)

2.2 NaOH濃度對PCR擴(kuò)增的影響

為了探索NaOH濃度對于PCR擴(kuò)增的抑制程度，進(jìn)而明確堿裂解樣本的稀釋倍數(shù)，不同濃度NaOH制備的DNA樣本不使用T50稀釋，直接進(jìn)行ITS擴(kuò)增。由圖1可知，0.250 mol/L(N3)及以上(N1、N2)的NaOH濃度可完全抑制PCR反應(yīng)，0.125～0.008 mol/L(N4－N8)的NaOH對PCR擴(kuò)增無影響。結(jié)合前述樣本的裂解程度及溶液狀態(tài)，選擇0.500 mol/L NaOH制備的樣本T50稀釋4倍(0.125 mol/L NaOH)作為PCR模板。

圖1 NaOH濃度對PCR擴(kuò)增效果的抑制作用檢測

2.3 不同緩沖液制備模板對PCR擴(kuò)增效果的影響

按照1.3方法制備樣本，其中T50、TE、DDW粗提樣本不稀釋直接使用，并取少量菌絲體直接PCR。由圖2可知，0.500～0.008 mol/L(N2～N8)的NaOH經(jīng)T50稀釋后以及T50、TE、DDW粗提樣本均可產(chǎn)生有效擴(kuò)增；1.000 mol/L(N1)的NaOH制備樣本無擴(kuò)增產(chǎn)物；菌絲體直接PCR擴(kuò)增條帶極其微弱。該結(jié)果進(jìn)一步表明0.500 mol/L的NaOH粗提樣本稀釋后，可用于真菌快速PCR鑒定。

圖2 ITS1/ITS4引物對11種緩沖液制備樣本及菌絲體的PCR檢測

2.4 模板存儲溫度對PCR擴(kuò)增的影響

為了明確制備樣本的保存時(shí)間和溫度對于PCR擴(kuò)增的影響，將DNA樣本分別存放于－20℃和室溫(25℃)，14 d后再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。與新制備樣本(圖2)相比，－20℃存儲樣本對PCR擴(kuò)增無明顯影響(圖3A)，室溫存放結(jié)果顯示N2～N7和TE擴(kuò)增效果不變，而N8、T50以及DDW出現(xiàn)了彌散(圖3B)。

圖3 制備的DNA樣本在不同存儲溫度下的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 優(yōu)選方法

依據(jù)制備樣本的PCR擴(kuò)增效果、存儲狀況以及樣本溶液的狀態(tài)，確立了內(nèi)生真菌ITS檢測中模板DNA的快速制備流程:1.5 mL離心管中放入兩個(gè)3 mm研磨珠，隨后加入0.500 mol/L的NaOH提取緩沖液100 μL，在超凈工作臺中用牙簽挑取少量菌絲于上述離心管中，采用組織研磨儀于25 Hz破碎2 min，瞬時(shí)離心后90℃金屬浴中3～5 min，再次瞬時(shí)離心后加入300 μL的0.05 mol/L的Tris·HCl(pH 8.0)，即為制備的PCR模板，－20℃或室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 優(yōu)選方法對68個(gè)屬真菌的分類鑒定。

應(yīng)用優(yōu)選方法對本實(shí)驗(yàn)室保存的白僵菌以及分離于玉米、大豆、棉花、地瓜植株的772個(gè)菌株進(jìn)行擴(kuò)增測試，結(jié)果表明711個(gè)可產(chǎn)生有效擴(kuò)增，62個(gè)無帶或擴(kuò)增較弱，擴(kuò)增成功率為91.98%。Sanger測序結(jié)果顯示706個(gè)為單峰，5個(gè)菌株測序圖為雙峰，序列經(jīng)本地Blastn(NT)比對鑒定后分布于68屬199種，圖4展示了68個(gè)屬的擴(kuò)增結(jié)果，圖5為其中一個(gè)樣本的Sanger測序峰圖。

圖4 優(yōu)選方法對68個(gè)屬真菌的PCR鑒定

圖5 PCR產(chǎn)物的Sanger測序

2.7 核糖體大亞基引物擴(kuò)增測試

為了明確ITS引物擴(kuò)增失敗的62個(gè)樣本是否與模板制備有關(guān)，利用nLSU引物(LROR/LR5擴(kuò)增條帶大小939 bp、LR3R/LR5擴(kuò)增條帶大小327 bp、LR3R/LR7擴(kuò)增條帶大小782 bp)再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖6可知，3對引物均可產(chǎn)生清晰擴(kuò)增，該結(jié)果進(jìn)一步表明ITS擴(kuò)增失敗并非樣本制備問題。

圖6 nLSU核糖體3對引物在ITS擴(kuò)增失敗的8個(gè)隨機(jī)樣本中的擴(kuò)增

3 討論與結(jié)論

堿裂解法已廣泛應(yīng)用于植物DNA快速提取，該方法的最大優(yōu)勢在于DNA樣本制備高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保[37]，然而用該方法提取真菌DNA鮮見報(bào)道。本研究改進(jìn)了堿裂解法并對其在真菌DNA快速提取中的應(yīng)用及適用范圍進(jìn)行了詳細(xì)闡述，優(yōu)化了提取流程，拓展了該方法在植物內(nèi)生真菌PCR檢測中的范圍。

針對白僵菌的測試中，DNA樣本粗提液(不稀釋)和稀釋后PCR的結(jié)果均證明，DNA樣本溶液中NaOH的濃度大于等于0.250 mol/L時(shí)，可完全抑制PCR反應(yīng)，而不高于0.125 mol/L可正常進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這一結(jié)果與徐宗昌等[38]的一致，其原因可能為高濃度的NaOH(≥0.250 mol/L)pH值≥13.4(https://www.osgeo.cn/app/s1678)，該pH值超出了PCR緩沖液的緩沖容量，導(dǎo)致PCR無法進(jìn)行。DNA溶液不稀釋直接進(jìn)行PCR，低濃度的NaOH、T50、TE、DDW雖然無法徹底裂解白僵菌，但仍可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其原因可能為高溫導(dǎo)致部分DNA的釋放，滿足了PCR擴(kuò)增對模板的要求，這為某些種屬真菌的裂解產(chǎn)物不稀釋直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增提供了條件支持。但是由于NaOH濃度較低，其適用范圍可能具有一定的限制，需要進(jìn)行單獨(dú)測試。DNA樣本的存儲試驗(yàn)表明，低濃度的NaOH、T50及DDW制備樣本在儲存過程中出現(xiàn)了部分降解現(xiàn)象，而高濃度的NaOH(N2－N7)和TE溶液擴(kuò)增效果未發(fā)現(xiàn)彌散，其原因可能為高濃度的NaOH及微量的EDTA均可抑制核酸酶的活性。

3對nLSU引物PCR成功擴(kuò)增，表明62個(gè)樣本的擴(kuò)增失敗并非DNA樣本制備問題，而是由于ITS1/ITS4引物匹配率不高。其片段長度測試則顯示了該方法可進(jìn)行1 000 bp以下的快速PCR檢測，完全可以滿足ITS間隔約600 bp測序的要求。

本研究利用0.500 mol/L的NaOH和0.05 mol/L的Tris·HCl(pH8.0)優(yōu)化了內(nèi)生真菌DNA快速提取方法，該方法簡便快捷、所需樣本極少、不需要液氮及手工研磨、不使用有機(jī)溶劑且室溫下可長期儲存，并成功應(yīng)用于68個(gè)屬199個(gè)種的內(nèi)生真菌鑒定，極大拓展了堿裂解法在內(nèi)生真菌PCR分類鑒定中的適用種屬范圍，可滿足大規(guī)?？焖僬婢b定的需要。