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    草莓種苗根腐病病原菌鑒定及對14種殺菌劑的敏感性

    2022-02-08 11:58:40姜莉莉延義琳宗曉娟王曉芳田中一久武沖
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:孢菌原藥根腐病

    姜莉莉,延義琳,宗曉娟,王曉芳,田中一久,武沖

    (1.山東省果樹研究所/山東省現(xiàn)代設(shè)施果樹技術(shù)創(chuàng)新中心,山東 泰安 271000;2.金鄉(xiāng)縣高河街道辦事處,山東 金鄉(xiāng) 272212)

    草莓(Fragaria ananassaDuch.)為薔薇科草莓屬宿根性多年生草本植物。其果實(shí)汁多味美、營養(yǎng)豐富,深受消費(fèi)者喜愛,素有“水果皇后”的美譽(yù)。我國草莓種植面積和產(chǎn)量均位居世界首位,其中山東、河北、遼寧、江蘇和四川是我國主要草莓產(chǎn)地[1]。在我國北方,草莓以設(shè)施栽培為主,高濕和連作易導(dǎo)致多種病害發(fā)生,嚴(yán)重影響草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展。根腐病是危害草莓的重要根部病害之一,屬于典型的土傳病害,防治難度較大。草莓根腐病具有較強(qiáng)的潛伏特性,癥狀一旦發(fā)生則蔓延迅速,導(dǎo)致草莓植株大面積死亡[2]。

    生產(chǎn)上草莓主要通過種苗抽生匍匐莖苗進(jìn)行無性繁殖[3]。種苗繁育是草莓生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。種苗的健壯與否直接決定了草莓生產(chǎn)苗繁育數(shù)量,以及后期草莓的生長、產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。目前,對于草莓病害的研究多集中在生產(chǎn)階段,關(guān)于種苗病害的研究報道較少。草莓種苗根腐病的發(fā)生直接影響草莓生產(chǎn)苗品質(zhì),進(jìn)而影響定植后收益。

    本研究從山東省沂源縣采集‘章姬’草莓種苗根腐病病苗,對根腐病病原菌進(jìn)行分離、純化和菌種鑒定,同時評價其對14種常用殺菌劑的敏感性,以期為草莓種苗安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試感病植株

    2022年3月1日,在山東省沂源縣某草莓種苗繁育基地選取穴盤種苗30株,品種為‘章姬’。

    1.2 供試藥劑

    95%氟硅唑原藥、96%啶酰菌胺原藥、95%咯菌腈原藥,山東濰坊潤豐化工股份有限公司;95%丙硫菌唑原藥,山東海利爾化工有限公司;97%氟環(huán)唑原藥、98%咪鮮胺原藥、95%葉菌唑原藥,安道麥輝豐(江蘇)有限公司;98%氟醚菌酰胺原藥、94%腈菌唑原藥、96%嘧菌酯原藥、98%肟菌酯原藥、98%吡唑醚菌酯原藥、95%己唑醇原藥、97%苯醚甲環(huán)唑原藥,山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司。

    氟硅唑原藥以環(huán)己酮溶解,其余13種原藥以丙酮溶解,制備濃度為10×104mg/L的母液,于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 病原菌的分離、純化

    采用病組織分離法[5]:將草莓種苗根部以無菌手術(shù)刀縱向剖開,切取病健交界組織(圖1),75%乙醇消毒10~15 s,無菌水沖洗3次。無菌濾紙吸干水分后,接種于PDA培養(yǎng)基平板上,25℃黑暗培養(yǎng)3 d。待菌落形成后,挑取邊緣菌絲,接種于新的PDA培養(yǎng)基平板,進(jìn)行菌株純化。

    圖1 草莓種苗根腐病病部

    根據(jù)柯赫氏法則[6],將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌株連帶培養(yǎng)基一同接種至‘章姬’草莓穴盤種苗莖基部,以無菌水處理為對照。進(jìn)行常規(guī)管理,觀察植株發(fā)病癥狀。

    1.4 病原菌鑒定

    取培養(yǎng)7 d的根腐病菌菌絲0.1 g,采用CTAB法提取基因組DNA,以ITS引物(ITS1/ITS4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收、純化后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST比對,并采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。

    1.5 室內(nèi)毒力測定

    采用生長速率法進(jìn)行14種殺菌劑對草莓種苗根腐病菌的室內(nèi)毒力測定。

    在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對供試藥劑母液進(jìn)行梯度稀釋??┚娴脑囼?yàn)濃度為0.025、0.050、0.100、0.250、0.500 mg/L,咪鮮胺的試驗(yàn)濃度為0.100、0.250、0.500、1.000、2.500 mg/L,其余藥劑的試驗(yàn)濃度均為0.500、1.000、2.500、5.000、10.000 mg/L。

    在超凈工作臺上,取1.0 mL各濃度藥液于49mL滅菌后冷卻至50~60℃的PDA培養(yǎng)基中,混勻后制備3個含藥平板。待平板完全凝固后,以直徑7 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅,倒置接種于PDA平板中央,以無菌水處理為對照。25℃黑暗培養(yǎng),待對照菌落長至培養(yǎng)皿1/2~2/3時,以十字交叉法測定各處理菌落直徑。按照如下公式計算各濃度藥劑處理的菌絲生長抑制率(%)。

    抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100。

    采用SPSS 18.0軟件計算各藥劑的菌絲生長EC50值和95%置信限。以抑菌活性最低藥劑的EC50值為基準(zhǔn),計算各藥劑的相對毒力指數(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 草莓種苗根腐病病原菌分離

    從草莓種苗病根髓心部位共分離得到12株真菌,根據(jù)菌落形態(tài)合并為5類,數(shù)量分別為7、2、1、1、1株,對其中菌落形態(tài)相同且數(shù)量占絕對優(yōu)勢的菌株(GF-1)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),純化后在PDA培養(yǎng)基平板生長的菌落形態(tài)如圖2所示。菌落呈白色棉絮狀,較厚實(shí),有同心輪紋。菌絲生長速度中等,7 d左右菌落直徑可至9 cm。后期產(chǎn)生褐色至黑色顆粒狀分生孢子角,培養(yǎng)時間越長,分生孢子角越多。與溫浩等[8]報道的草莓新擬盤多毛孢菌菌落形態(tài)相似。

    圖2 草莓種苗根腐病病原菌GF-1菌落形態(tài)

    將純化后的病原菌回接至‘章姬’草莓穴盤種苗上,14 d后葉片變紅、植株長勢弱(圖3),與原始癥狀相同。

    圖3 草莓種苗根腐病菌GF-1回接癥狀

    2.2 草莓種苗根腐病病原菌分子生物學(xué)鑒定

    采用ITS通用引物ITS1/ITS4對GF-1菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到長度為543 bp的DNA序列。將其在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對,發(fā)現(xiàn)其與類擬盤多毛孢菌(Neopestalotiopsis)同源性最高,采用MEGA 5.0構(gòu)建ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4),發(fā)現(xiàn)其與Neopestalotiopsis mesopotamica(類擬盤多毛孢菌)聚在一枝。該菌株最早于1969年發(fā)現(xiàn)于伊拉克境內(nèi)的土耳其松[9],在草莓植株上為首次報道。

    圖4 草莓種苗根腐病菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

    2.3 14種殺菌劑對草莓種苗根腐病菌菌絲生長的抑制率

    由表1可以看出,咯菌腈對草莓根腐病菌的抑制活性最高,濃度為0.025~0.500 mg/L時,抑制率為22.21%~93.49%;其次為吡唑醚菌酯和苯醚甲環(huán)唑,濃度為0.500~10.000 mg/L時,抑制率分別為29.82%~96.95%和23.94%~89.00%。咪鮮胺濃度為0.100~2.500 mg/L時,抑制率為30.83%~75.18%。濃度為0.500~10.000 mg/L時,氟硅唑和氟環(huán)唑的抑制率分別為16.44%~92.01%和8.90%~89.29%;氟醚菌酰胺、葉菌唑和己唑醇的抑制率分別為17.84%~73.60%、13.56%~78.75%和11.70%~73.31%;丙硫菌唑、啶酰菌胺、肟菌酯、嘧菌酯和腈菌唑的抑制率分別為24.06%~63.63%、10.39%~70.31%、13.19%~68.41%、15.56%~65.24%和7.01%~71.58%。

    表1 14種殺菌劑對草莓種苗根腐病菌菌絲生長的抑制率

    表1(續(xù))

    2.4 14種殺菌劑對類擬盤多毛孢菌的室內(nèi)毒力

    由表2可以看出,在14種供試殺菌劑中,腈菌唑?qū)︻悢M盤多毛孢菌菌絲生長的室內(nèi)毒力最低,EC50值為4.549 mg/L。以其為基準(zhǔn),計算其它藥劑的相對毒力指數(shù),咯菌腈對草莓種苗類擬盤多毛孢菌的室內(nèi)毒力最高,EC50值僅為0.070 mg/L,較腈菌唑的相對毒力指數(shù)為64.986。吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺和氟硅唑的室內(nèi)毒力也較高,EC50值分別為1.009、1.499、1.606、1.797 mg/L,相對毒力指數(shù)分別為4.508、3.035、2.833和2.531。氟環(huán)唑、氟醚菌酰胺、葉菌唑和己唑醇的EC50值分別為2.457、2.719、2.874、3.268 mg/L,相對毒力指數(shù)分別為1.851、1.673、1.583和1.392。丙硫菌唑、啶酰菌胺、肟菌酯和嘧菌酯對類擬盤多毛孢菌的室內(nèi)毒力相對較低,EC50值分別為3.794、4.013、4.407、4.514 mg/L,相對毒力指數(shù)分別為1.199、1.134、1.032和1.008。

    表2 14種殺菌劑對類擬盤多毛孢菌菌絲生長的室內(nèi)毒力

    3 討論與結(jié)論

    草莓種苗繁育高峰期主要集中在5—8月,高溫多雨極易引起病害蔓延。草莓根腐病是由土傳病原真菌侵染引起的重要根部病害之一[10]。本研究從‘章姬’草莓種苗根腐病病根髓心部位分離得到多株病原菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,該病原菌為類擬盤多毛孢菌(Neopestalotiopsis mesopotamica)。

    類擬盤多毛孢菌的寄主范圍較廣,可侵染月季、牛油果、碧根果等。侵染草莓可引起紅葉病,發(fā)病初期葉片為紅色,后期整株萎蔫、死亡,對‘甜查理’等品種的危害尤其嚴(yán)重[11]。近年來,該屬病原菌危害草莓的報道逐漸增多,可引起草莓葉斑病、根腐病、莖腐病等多種病害[12,13],但在‘章姬’種苗上為首次報道。

    目前,化學(xué)殺菌劑仍是防治草莓病害的主要手段。然而,《中國農(nóng)藥信息網(wǎng)》顯示,防治草莓根腐病的產(chǎn)品僅包括熏蒸劑棉隆和生防菌劑,尚無獲得登記的化學(xué)藥劑。本研究選取14種常用化學(xué)殺菌劑,對分離得到的類擬盤多毛孢菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測定,發(fā)現(xiàn)咯菌腈的抑菌活性最高,EC50值僅為0.070 mg/L,較腈菌唑的相對毒力指數(shù)為64.986;吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺和氟硅唑的室內(nèi)毒力也較高,EC50值分別為1.009、1.499、1.606、1.797 mg/L。

    咯菌腈屬于苯吡咯類殺菌劑,為假單胞菌代謝產(chǎn)物硝吡咯菌素的類似物,其殺菌譜較廣,但不具有內(nèi)吸性[14]。吡唑醚菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑,通過阻礙真菌線粒體呼吸而抑制病原菌孢子萌發(fā)和菌絲生長[15]。苯醚甲環(huán)唑和氟硅唑均為三唑類殺菌劑,具有保護(hù)、治療和內(nèi)吸活性。其中,苯醚甲環(huán)唑通過干擾病原菌細(xì)胞C14脫甲基化作用、抑制病原菌麥角甾醇的生物合成、破壞細(xì)胞膜的生理作用從而導(dǎo)致真菌死亡[16];氟硅唑具有較強(qiáng)的滲透性[17]。生產(chǎn)上,上述藥劑均可用于草莓種苗根腐病的防治,但需合理輪用和混用,以延緩抗藥性的產(chǎn)生。

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