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    抗氧化活性最佳佛手酵素正交法優(yōu)化制備

    2022-02-07 08:56:58閻怡平
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2022年24期
    關(guān)鍵詞:佛手酵素酵母菌

    邱 遷,廖 蕓,孟 琦,周 鋒,閻怡平,張 華,2

    (1.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,重慶 404120;2.重慶市渝東北特色生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心,重慶 404120)

    佛手屬于蕓香科柑橘屬植物[1],是一種藥食同源植物,其花、葉、果均可入藥,具有疏肝理氣、和胃止痛的作用[2]。食品方面可加工成佛手蜜餞、佛手茶和佛手酒等。佛手主要功能成分包括揮發(fā)油、多糖、氨基酸、黃酮類化合物、香櫞脂類等化合物[3-5]。酵素是一種以水果、蔬菜為原材料,利用酵母菌、乳酸菌及其他益生菌發(fā)酵而形成的一種液體或固體食物,所含營養(yǎng)成分非常較多,包括脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶等,具有抗炎、抗菌、抗氧化、增強免疫力、降脂、解酒、保肝、美白及改善腸道微環(huán)境的功能[6-8]。由于其天然特性和無副作用而受到人們的廣泛追捧。目前,佛手主要通過售賣佛手果和盆景來獲得一定的經(jīng)濟(jì)效益。與國外相比,我國佛手果深加工產(chǎn)品較少[9]。因此,試驗以佛手為原材料,通過優(yōu)化試驗條件,以羥基自由基清除率為考查指標(biāo),研究具有羥基自由基活性最佳佛手酵素制備工藝,為佛手的進(jìn)一步深加工和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

    1 材料

    1.1 樣本與主要試劑

    野生新鮮成熟佛手果,外表金黃、皺而有光澤、購自自重慶市萬州區(qū)龍沙鎮(zhèn)。

    無水乙醇、七水硫酸亞鐵、30%過氧化氫溶液,中國重慶川東化工集團(tuán)有限公司提供;水楊酸,成都市科龍化工試劑廠提供;無水葡萄糖,購自當(dāng)?shù)厮幍?;果膠酶,山東圣斯德食品添加劑有限公司提供;安琪活性干酵母,安琪酵母(伊犁)有限公司提供;紅棉純正紅糖,廣州市華僑糖廠提供;水為超純水,實驗室自制。

    1.2 主要儀器

    722型可見分光光度計,上海欣茂儀器有限公司產(chǎn)品;FA1004型號電子天平,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;HH.S型精密恒溫水浴鍋,江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品;低速離心機,安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;FW80型高速試樣粉碎機,河北省黃市新興電器廠產(chǎn)品;ZXFD-5250型十段編程鼓風(fēng)干燥箱,上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品;AIphal1-2 LDplus型真空冷凍干燥機,德國Christ公司產(chǎn)品。

    2 試驗方法

    2.1 樣品預(yù)處理

    將新鮮佛手果切成薄片,置于60℃恒溫干燥箱中干燥4 d,粉碎后過40目篩,密封干燥保存。

    2.2 酵母菌的活化

    準(zhǔn)確稱安琪活性干酵母粉5 g加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的葡萄糖溶液50 mL,于30℃條件下進(jìn)行活化3~5 h。

    2.3 酵素制備

    2.3.1 工藝流程

    佛手液的制備(佛手干粉1 g∶蒸餾水20 mL)→添加果膠酶反應(yīng)→煮沸糖化→滅菌→接種酵母菌→離心取上清液→真空冷凍干燥。

    2.3.2 操作要點

    準(zhǔn)確稱取5 g過40目篩的佛手果干粉,加入蒸餾水,料液比為1∶20(g∶mL),之后加入果膠酶0.21 g,作用15 min后,煮沸糖化1.5 h,加入不同量的紅糖,搖勻,然后放入滅菌鍋,在115℃條件下滅菌30 min。滅菌冷卻后在無菌環(huán)境下按不同接種量接種已活化的安琪高活性干酵母,放入恒溫箱中進(jìn)行發(fā)酵[10]。發(fā)酵后獲得酵素液,并通過測定羥基自由基的活性作為評價酵素功能的檢測指標(biāo)。

    2.4 單因素試驗

    2.4.1 酵母菌接種量的確定

    設(shè)定糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%,發(fā)酵時間36 h,發(fā)酵溫度30℃,分別考查不同酵母接種量(體積分?jǐn)?shù))2%,4%,6%,8%,10%所得酵素的羥基自由基清除率。

    2.4.2 糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

    設(shè)定發(fā)酵時間36 h,發(fā)酵溫度30℃,酵母接種量2%,分別考查不同糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(質(zhì)量分?jǐn)?shù))10%,15%,20%,25%,30%所得酵素的羥基自由基的清除率。

    2.4.3 發(fā)酵時間的確定

    設(shè)定糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%,發(fā)酵溫度30℃,酵母接種量2%,分別考查不同發(fā)酵時間36,60,84,108,132 h所得酵素的羥基自由基清除率。

    2.4.4 發(fā)酵溫度的確定

    設(shè)定糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%,發(fā)酵時間36 h,酵母接種量2%,分別考查不同發(fā)酵溫度26,28,30,32,34℃所得酵素的羥基自由基清除率。

    2.5 正交試驗

    在酵母菌接種量(A)、糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、發(fā)酵時間(C)、發(fā)酵溫度(D)4個單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行L9(34)正交試驗,設(shè)計四因素三水平試驗,取3個考查水平,分別以發(fā)酵時間36,60,84 h和糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%,15%,20%,酵母菌接種量4%,6%,8%和發(fā)酵溫度28,30,32℃對比試驗。以所得酵素的羥基自由基的清除率為評價指標(biāo),確定酵母菌發(fā)酵的最佳工藝條件,每一次試驗稱取佛手干粉為5 g。

    正交試驗的因素與水平設(shè)計見表1。

    表1 正交試驗的因素與水平設(shè)計

    2.6 測定羥基自由基的清除率

    2.6.1 試劑配制

    (1)9 mmol/L乙醇-水楊酸。精確稱取水楊酸1.243 g,然后用乙醇溶解,將溶解液移入100 mL容量瓶中用乙醇定容,然后取出部分在另一容量瓶中稀釋10倍。

    (2)9 mmol/L硫酸亞鐵。精確稱取FeSO4·7H2O溶液2.502 g,加入蒸餾水溶解,將溶解液移入100 mL容量瓶中定容,然后取出部分在10 mL另一容量瓶中稀釋10倍。

    (3)8.8 mmol/L H2O2。精確稱取30%的H2O2溶液9.926 g在小燒杯中,加入蒸餾水,然后移入100 mL容量瓶中定容,然后取1 mL置于另一100 mL容量瓶中稀釋100倍。

    2.6.2 試驗方法

    取出一支10 mL試管,依次加入9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL和9 mmol/L水楊酸溶液1 mL,再加入稀釋后的佛手酵素液1 mL,最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL。充分搖晃均勻后,置于37℃熱水中水浴反應(yīng)30 min,取出冷卻,然后充分搖晃,于510 nm波長處測定其吸光度為A1,此為試驗組,不加樣品為空白組測得的數(shù)值為A,不加H2O2的為對照組,測得的數(shù)值為A0[11]。

    式中:A——空白對照的吸光度;

    A1——加樣品的吸光度;

    A0——不加顯色劑H2O2。

    2.7 真空冷凍干燥

    將發(fā)酵液可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃縮到30%,通過真空冷凍干燥得到水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于5%的佛手果渣酵素粉。真空冷凍干燥條件為冷凍溫度-20℃,真空度10~20 Pa,冷阱溫度-45℃[12]。

    2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    每組試驗設(shè)置3個重復(fù),數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,差異顯著者進(jìn)行Ducan's多重比較。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,顯著水平設(shè)置為p=0.05。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 單因素試驗結(jié)果

    3.1.1 不同酵母菌接種量對佛手酵素液羥基自由基清除率的影響

    酵母菌接種量與酵素羥基自由基清除率關(guān)系見圖1。

    圖1 酵母菌接種量與酵素羥基自由基清除率關(guān)系

    由圖1可知,酵母菌接種量為6%時,所獲得的羥基自由基清除率最大,最高可達(dá)到43.79%。達(dá)到最高清除自由基能力之后,隨著接種量的增加,羥基自由基清除能力逐漸降低。

    3.1.2 不同糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對佛手酵素液羥基自由基清除率的影響

    糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酵素羥基自由基清除率關(guān)系見圖2。

    由圖2可知,當(dāng)糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時有一個峰值,在糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%時一個最低值,之后隨著糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高,又有上升趨勢。總體清除自由基能力差別為27%~29%,差別較小??紤]成本等因素,認(rèn)為當(dāng)糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時為最佳。其他研究也表明,懷山藥酵素液SOD活性隨著糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加先升高再降低,糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時SOD活性最高[13]。

    圖2 糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酵素羥基自由基清除率關(guān)系

    3.1.3 不同發(fā)酵時間對佛手酵素液羥基自由基清除率的影響

    發(fā)酵時間與酵素羥基自由基清除率關(guān)系見圖3。

    圖3 發(fā)酵時間與酵素羥基自由基清除率關(guān)系

    由圖3可知,最佳發(fā)酵時間為108 h,此時對羥基自由基的清除率最大,為28.34%。其次為60 h和132 h,羥基自由基清除率為23.27%和22.86%。分析原因可能是發(fā)酵菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了一些諸如SOD等抗氧化酶類清除活性氧。另一方面可能是酵菌本身就具有一定的抗氧化能力。例如,有研究發(fā)現(xiàn)酵母菌的細(xì)胞壁多糖能夠清除羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)等活性氧,起到抗氧化的功效[10]。但是隨著發(fā)酵時間增多,發(fā)酵原料物質(zhì)的消耗殆盡,便開始呈現(xiàn)下降或是平穩(wěn)趨勢[14]??紤]到試驗效率,選取60 h為最佳發(fā)酵時間。

    3.1.4 不同發(fā)酵溫度對佛手酵素液羥基自由基清除率的影響

    發(fā)酵溫度與酵素羥基自由基清除率關(guān)系見圖4。

    圖4 發(fā)酵溫度與酵素羥基自由基清除率關(guān)系

    由圖4可知,發(fā)酵溫度與酵素羥基自由基清除率關(guān)系研究結(jié)果表明,最佳發(fā)酵溫度為30℃,羥基自由基清除率最高達(dá)到34.4%,是最低值的1.36倍??赡苁谴藭r的溫度是適合生存酵母菌的最佳溫度,有利于酵素的形成,酵素的含量增高[13]。

    3.2 正交試驗

    正交試驗見表2,L9(34)正交試驗結(jié)果方差分析見表3。

    表2 正交試驗

    表3 L9(34)正交試驗結(jié)果方差分析

    通過表2可以判斷出各因素對試驗結(jié)果的影響的主次關(guān)系并確定最佳工藝提取條件。4個因素的極差順序為RD>RC>RA>RB,說明發(fā)酵溫度對制備酵素對羥基自由基清除率的影響最大,酵母菌接種量次之,發(fā)酵時間再次之,糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對其影響最小。根據(jù)總和的比較,發(fā)酵時間K2>K3>K1,糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)K3>K2>K1,酵 母 菌 接 種 量K3>K2>K1,發(fā) 酵 溫 度K1>K2>K3得 到 的 制 備 佛 手 酵 素 的 最 優(yōu) 方 案 為A2B3C3D1,即發(fā)酵時間為60 h,糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%,酵母菌接種量為8%,發(fā)酵溫度為28℃時,對羥基自由基的清除率為26.33%±8.20%。

    由表3可知,發(fā)酵溫度對佛手酵素羥基自由基清除率的影響差異極顯著,發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度影響差異顯著。

    3.3 驗證試驗

    在分析正交試驗結(jié)果后,以得出的最佳提取工藝基礎(chǔ)上進(jìn)行驗證試驗,在最佳提取工藝條件下,即發(fā)酵時間60 h,糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%,酵母菌接種量8%,發(fā)酵溫度28℃時平行試驗3次,測定酵素液的羥基自由基活性,結(jié)果表明,26.25%±2.99%與正交最優(yōu)組合26.33%±8.20%基本一致。所以綜合以上因素,A2B3C3D1提取工藝條件較為理想,結(jié)果穩(wěn)定、合理。

    3.4 佛手酵素制備

    試驗最后將最佳工藝所獲得成品濃縮至30%后,經(jīng)真空冷凍干燥后保存于-80℃冰箱中[12]。

    4 結(jié)論

    以佛手果為試驗對象,依據(jù)羥基自由基抗氧化活性強弱制備酵素,分別考查了酵母菌接種量、發(fā)酵時間、糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度4個單因素,并進(jìn)行了正交試驗優(yōu)化。試驗表明佛手酵素具備羥基自由基清除能力,查閱文獻(xiàn)未見佛手酵素相關(guān)研究,但是與其他藥食同源食品酵素類似,具有ABTS和DPPH自由基清除能力[15]。試驗選出的最佳發(fā)酵時間為60 h,與已有報道相符。在不同的原料、菌種,不同的的發(fā)酵工藝及目標(biāo)產(chǎn)物顯示酵素發(fā)酵的時間存在較大差異。例如,王俊偉等人[16]研究糙米發(fā)酵只需2 h,就可以產(chǎn)生γ-氨基丁酸含量較高的酵素。李豆[17]在新型水果酵素的研制過程中,發(fā)酵時間為1~3個月。郭偉峰等人[18]研制桑葚酵素飲料發(fā)酵所需時間24 h,SOD酶活力明顯提高??傮w而言,最終選出抗氧化活性最佳的佛手酵素發(fā)酵工藝的最佳因素為發(fā)酵時間60 h,糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%,酵母菌接種量8%,發(fā)酵溫度28℃。同時,將得到的發(fā)酵液滅菌濃縮后通過真空冷凍干燥,制成佛手果渣酵素粉狀產(chǎn)品。

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