硝酸鹽緩解油菜銨毒害的生理機制

王雪茹 陳海飛 張振華

（湖南農業(yè)大學資源環(huán)境學院/南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，410128，湖南長沙）

氮是植物生長發(fā)育不可缺少的大量營養(yǎng)元素，是組成蛋白質、酶和核酸等重要大分子的成分，廣泛參與植物生長代謝等諸多生物過程。然而農業(yè)生產中氮肥過量和不合理施用，造成氮大量流失，導致土壤環(huán)境與水體污染，威脅生物多樣性，破壞生態(tài)平衡。硝態(tài)氮（NO3-）和銨態(tài)氮（NH4+）是大多數植物氮的主要來源，占植物對陰離子和陽離子吸收的70%[1]。最近研究[2]表明，隨著全球CO2濃度的升高，C3植物中NO3-的還原被抑制，NH4+的同化不受影響，因此增加NH4+的施用對糧食生產至關重要。

低濃度的NH4+能促進大多數植物的生長[3-4]，然而高濃度NH4+作為唯一氮源抑制植物根系和地上部的生長。當銨轉化為氨基酸和酰胺的總速率低于氨基酸分解代謝、硝酸鹽還原、苯基丙類代謝和光呼吸對銨的吸收和細胞產生的速率時，植物組織中銨會積累[5]，植株出現根系停止生長、葉片枯黃萎焉等銨毒害癥狀[6]。研究[7]表明，氨毒害發(fā)生是由于細胞內NH4+水平的升高破壞了植物激素穩(wěn)態(tài)，導致光電傳遞效率下降和活性氧物質爆發(fā)、細胞質酸化、膜結構破壞及陰陽離子失衡等問題。其中，谷氨酰胺合成酶（GS）是調控銨同化的關鍵酶，在植物體中存在2種同工酶，分別是GS1和GS2。最近的研究[8]表明，擬南芥根部GS1的編碼基因Gln1;2正調控植株的銨耐受性，但是地上部GS2的編碼基因Gln2負調控植株的銨耐受性，說明植物氨毒害發(fā)生可能受到多種生理途徑的綜合影響。

油菜是世界上重要的油料作物，對氮肥的需求量很大且利用率低[9-10]。此外，過量的氮會降低油菜的含油量，因此合理施用氮肥對油菜提質增效至關重要[10-12]。在南方稻油復種的水田中銨態(tài)氮含量較高，而油菜等十字花科植物對銨態(tài)氮敏感，限制了油菜生長。而硝銨混合營養(yǎng)可緩解植物的銨毒害癥狀，恢復植物的正常生長，但其作用機理尚不清楚。因此，本研究通過同時添加不同濃度的硝酸鹽和5mmol/L銨態(tài)氮水培試驗，探究硝酸鹽緩解油菜銨毒害和提高油菜氮利用效率的生理機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2020年9月在湖南農業(yè)大學第八教學樓進行。采用水培試驗，選擇油菜品種Bn60為供試材料。將油菜種子播種于塑料盒內鋪設的紗布上，用去離子水浸泡。6d后選取長勢一致的幼苗移植到55cm×37cm×8cm的水培盒中，每盆含4L營養(yǎng)液。試驗采用完全隨機區(qū)組設計。每升營養(yǎng)液由5.0mmol/L KNO3、5.0mmol/L Ca(NO3)2·4H2O、2.0mmol/L MgSO4·4H2O、1.0mmol/L KH2PO4、50μmol/L Fe-EDTA、9μmol/LMnCl2·4H2O、0.8μmol/L ZnSO4·7H2O、0.3μmol/L CuSO4·5H2O、0.1μmol/L NaMoO4·2H2O 和 50μmol/L H3BO3組成。每 5d 更換1次營養(yǎng)液，適應性培養(yǎng)5d后再處理15d。試驗設置5個銨態(tài)氮處理，在5mmol/L NH4+的條件下，NO3-濃度分別為 0、0.1、0.3、0.6和 1.0mmol/L[13]，均采用 NH4Cl和 Ca(NO3)2處理，并設置 1盆5mmol/L硝態(tài)氮培養(yǎng)油菜進行對照（CK）。為了避免Ca2+濃度不同帶來的影響，使用CaCl2將所有處理的Ca2+濃度調整一致，共6盆，每盆15株。每次試驗的各個處理設置3次生物學重復，2個平行試驗。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 生物量 處理15d后每個處理取整株，根部用蒸餾水沖洗3～4次，用濾紙擦干表面的水分，烘干至恒重后于萬分之一天平稱重。

1.2.2 全氮含量 各供試材料在處理15d后，植株樣品按地上、地下部位經105℃殺青0.5h，然后在70℃下烘干至恒重并剪碎。稱取0.1g干樣置于150mL消煮瓶中，用H2SO4-H2O2消煮至透明清亮，轉移至50mL容量瓶中，定溶、過濾后用連續(xù)流動分析儀（AA3）測定全氮含量[14]。氮累積量=植株生物量×植株氮含量，氮素吸收效率=氮素累積量/供氮量[15]。

1.2.3 植物組織離子組 將處理15d的油菜根系和地上部分烘干磨碎后，利用ICP-MS測定其中金屬元素含量。油菜根系、地上部等植物樣品烘干后粉碎，自封袋保存?zhèn)溆?。稱取0.1g樣品于消解管中，加入濃硝酸浸泡，待消解完全后將消煮液轉移到10mL比色管中定容，稀釋至規(guī)定倍數，以慢速定量濾紙過濾，濾液放置4℃下保存，用ICP-MS（NexIONTM350X）測定其中金屬元素含量，同時做空白。

1.2.4 光合參數 采用LI-6400XT便攜式光合系統(tǒng)進行測定植物光合作用。測定過程中，葉室溫度控制在22°C，光合量子通量密度（PPFD）為200μmol/(m2·s)，CO2濃度設定為 500μmol/mol，基本接近培養(yǎng)室內的CO2濃度，測定時間為9:00-15:00。試驗材料處理15d，選取第3或第4片葉片，將葉片放入葉室并夾好，閉合葉室，待植物適應人工光源和光合作用參數值穩(wěn)定后記錄數據[16]。

1.2.5 葉綠素含量 將處理15d的油菜取0.15g葉片，剪碎后置于10mL刻度試管中，加入1:1（V:V）的丙酮:乙醇溶液10mL，塞好瓶蓋，室溫下暗處提取48h（葉片完全變白），取上清液測定663、645和652nm處的吸光值。并計算總葉綠素含量：總葉綠素含量（mg/g）=D652×V÷(34.5×W)，式中，V為提取液的總體積，W為樣品的葉面積或鮮重[16]。

1.2.6 NH4+含量 采用靛酚藍比色法測定NH4+含量。處理7d的油菜幼苗用蒸餾水沖洗3～4次，用濾紙擦干表面的水分，稱重0.1g后裝入5mL的離心管，放入液氮冷凍片刻于組織研磨儀上打碎，用5mL 0.1%的稀鹽酸提取30min，過濾后吸取上清液200μL，用0.1%的稀鹽酸稀釋至4mL，依次加入0.5mL的苯酚溶液（苯酚5g，亞硝基鐵氰化鈉50mg定容至500mL）和NaClO堿性溶液（NaOH 5g，Na2HPO43.53g，Na3PO415.9g，量取 NaClO[ω（NaClO）=5.25%，即含有效氯5%的漂白劑溶液]溶液5mL，溶解后轉移至500mL容量瓶后定容），搖勻后37℃水浴30min，在625nm波長處進行比色[17]。

1.2.7 谷氨酰胺合成酶（GS）活性 處理7d的油菜分地上部和根部取樣，用蒸餾水沖洗3～4次，用濾紙擦干表面的水分，稱取0.1g，采用GS試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）測定GS活性。

1.3 數據處理

采用Excel和DPS軟件進行統(tǒng)計分析及單因素方差分析，LSD法進行顯著性檢驗（P＜0.05），文中圖采用GraphPad Prism 8軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 銨毒害對油菜生長的影響

與正常培養(yǎng)相比，油菜在5mmol/L NH4+條件下的株型明顯變小，側根較少，并且根長更長（圖1a）。在5mmol/L NH4+條件下培養(yǎng)的油菜葉片出現了明顯的黃化，葉片數量相較正常培養(yǎng)更少，總葉面積也有明顯的減?。▓D1b）。地上部正常培養(yǎng)生物量是NH4+培養(yǎng)的2.87倍，地下部生物量正常培養(yǎng)是NH4+培養(yǎng)的4.13倍（圖1c）。葉綠素含量正常培養(yǎng)是NH4+培養(yǎng)的1.86倍（圖1d）。說明5mmol/L NH4+條件對油菜具有明顯的毒害作用，抑制了油菜的生長，導致油菜發(fā)育緩慢，葉片黃化、側根減少，生物量和葉綠素含量都有極顯著的降低。

圖1 銨毒害對油菜生長和葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of ammonium poisoning on rape growth and chlorophyll content

2.2 添加外源硝酸鹽可緩解油菜銨毒害的癥狀

隨著添加硝酸鹽濃度的提高，油菜的銨毒害癥狀逐漸緩解（圖2a）。油菜地上部和根系生物量與表型一致，硝酸鹽梯度0.1～1.0mmol/L的生物量相比0.0mmol/L分別上升了2.94%、34.88%、36.76%和43.93%（圖2b）。與單一銨態(tài)氮條件下的油菜相比，隨著硝酸鹽的濃度增加，油菜的Pn顯著增加，硝酸鹽濃度在0.3、0.6、1.0mmol/L時的Pn均顯著高于0.0和0.1mmol/L處理（圖2c）。此外，添加不同濃度的硝酸鹽后，下部葉片的黃化癥狀逐漸消失，與表型一致的是，油菜葉片葉綠素含量隨著硝酸鹽濃度的增加而上升，在硝酸鹽濃度為1.0mmol/L時達到最高，是0mmol/L的2.6倍（圖2d）。說明在銨毒害條件下添加低濃度的硝酸鹽可提高油菜的葉綠素含量和Pn，緩解銨毒害對油菜生長的抑制。

圖2 添加外源硝酸鹽對油菜生長和光合的影響Fig.2 Effects of exogenous nitrate on growth and photosynthesis of rape

2.3 添加外源硝酸鹽對油菜陽離子含量的影響

研究[6]表明，NH4+可以抑制作物對K+、Ca2+和Mg2+等的吸收。通過比較添加不同濃度的硝酸鹽生長條件下的油菜陽離子含量，發(fā)現地上部K+、Ca2+和Mg2+含量隨著硝酸鹽濃度的上升而上升，硝酸鹽濃度在0.6和1.0mmol/L相比0.0和0.1mmol/L，K+含量上升了30%左右（圖3a）；1.0mmol/L相比0.0mmol/L硝酸鹽處理，Ca2+含量上升了88.9%（圖3b），Mg2+含量上升了60.6%（圖3c）。而油菜根系陽離子含量的上升雖然不如地上部顯著，但是隨著硝酸鹽濃度的上升，K+、Ca2+和Mg2+的含量也都有明顯的上升。而綜合地上部與根系的上升趨勢來看，陽離子含量的上升與硝酸鹽濃度呈現正相關，并且添加濃度達到1.0mmol/L時效果最好。說明添加外源硝酸鹽在一定程度上促進油菜對陽離子的吸收，增加油菜的陽離子含量。

圖3 外源添加硝酸鹽對油菜陽離子含量的影響Fig.3 Effects of exogenous nitrate nitrogen addition on cationic content in rape

2.4 添加外源硝酸鹽對油菜氮同化能力的影響

銨營養(yǎng)條件下，隨著硝酸鹽處理濃度的增加，地上部和地下部游離銨的含量在硝酸鹽濃度0.1mmol/L時增加趨勢顯著，在0.3和0.6mmol/L時增加趨勢不顯著，然而硝酸鹽濃度為1.0mmol/L時，地上部的銨鹽含量比純銨處理降低了21.9%，根系的銨鹽含量比純銨處理降低了24.8%。表明增加硝酸鹽的供應可降低油菜銨鹽的含量，減輕氨毒害（圖4a）。與單一銨營養(yǎng)相比，增加硝酸鹽供應可顯著增加GS活性，而GS活性表征氮同化能力的強弱，這一結果與植株體內游離銨含量下降相吻合。結果表明，隨著硝酸鹽的供應，地上部氮同化能力呈梯度顯著增強，與銨處理相比，硝酸鹽濃度為0.1、0.3和0.6mmol/L時，GS活性分別增加了1.03、0.66和2.69倍，在硝酸鹽濃度達到1.0mmol/L時，GS活性顯著提升了3.58倍。而根系的GS活性則沒有明顯的變化（圖4b）。

圖4 添加外源硝酸鹽對油菜氮同化能力的影響Fig.4 Effects of exogenous nitrate addition on nitrogen assimilation ability of rape

2.5 添加外源硝酸鹽對油菜總氮含量的影響

增施硝酸鹽后，油菜的總氮含量、累積量和氮素吸收效率都呈增加的趨勢（圖5）。地上部硝酸鹽濃度為0.3、0.6和1.0mmol/L時的總氮含量、氮累積量和氮素吸收效率都顯著高于0.0和0.1mmol/L處理；而根系隨著硝酸鹽濃度的上升呈現顯著的上升趨勢，當硝酸鹽濃度為0.6和1.0mmol/L時的總氮含量、氮累積量和氮素吸收效率顯著高于其他處理。結果表明，添加外源硝酸鹽可增加油菜在銨毒害條件下對氮素的吸收效率。

圖5 添加外源硝酸鹽對油菜總氮含量的影響Fig.5 Effects of exogenous nitrate addition on total nitrogen content in rape

3 討論

3.1 添加外源硝酸鹽可提高油菜的陽離子含量

高銨脅迫會造成無機陽離子的減少。當NH4+作為唯一氮源時，植物為了生長發(fā)育，不得不吸收過多的NH4+，由于其帶正電荷，因此影響了其他無機陽離子的吸收。研究[18]發(fā)現，相比于NO3-，當NH4+作為氮源時，植物體內的Ca2+和Mg2+含量顯著減少。陽離子含量能夠影響作物的電化學平衡，而Ca2+和Mg2+是植物體內重要的無機陽離子，參與眾多生理生化過程，如細胞信號轉導、許多酶的活性以及光合作用等。植物在吸收銨態(tài)氮時會以質子留在膜外的方式進入細胞內，使根際的pH降低。前人[19-20]研究指出，不同的銨硝比在施氮總量不變的情況下并不會使蝴蝶蘭對氮的吸收能力升高或降低，但銨硝比的升高會抑制蝴蝶蘭對K+、Ca2+和Mg2+等的吸收，相對于混合施氮，硝態(tài)氮更有利于蝴蝶蘭的生長。常笑超等[21]發(fā)現比起純銨培養(yǎng)，添加硝態(tài)氮顯著促進了毛白楊根氮、磷、鉀元素的累積。在本試驗中觀察到，在銨態(tài)氮條件下加入不同濃度的硝酸鹽后，K+、Ca2+和Mg2+的含量上升（圖3），這與前人的研究結果一致，說明銨態(tài)氮可能會抑制油菜對陽離子的吸收，而添加外源硝酸鹽能增加油菜的陽離子含量，進而促進植物體內酶活性和光合作用等生理生化過程。

3.2 添加外源硝酸鹽能增強油菜的銨同化能力和氮素利用效率

氮素利用效率由吸收和同化2個途徑決定，植物通過增強體內NH4+的同化來實現自我解毒的能力是減輕銨毒害的重要途徑[22-23]。植物吸收的銨態(tài)氮大部分在根中進行同化，然而仍有部分銨態(tài)氮會通過木質部運輸至地上部[24-25]，地上部的銨態(tài)氮則會通過GS同化或以NH3的形式損失[26]。高濃度的NH4+還可抑制作物氮代謝中關鍵酶活性，如GS和谷氨酸合成酶（GOGAT）[27]。其中GS是植株同化銨態(tài)氮的關鍵酶，銨態(tài)氮濃度越高，GS活性越強[28]。一般認為，植物體內存在2種GS，GS1參與植物體內大部分的銨同化，而GS2則定位于葉綠體或質體中，并參與NO3-還原產生的NH4+同化[29]。遲蓀琳等[30]認為，小白菜中GS活性與硝酸鹽含量呈正相關關系?？偟膩碚f，增加氮的吸收和運輸以及無機氮向氨基酸的同化可能有助于油菜對氮限制的適應性[31]。本試驗中，純銨條件下，增加硝酸鹽供應的含量可顯著增加地上部GS活性，而GS活性表征氮同化能力的強弱。本研究表明，隨著硝酸鹽的供應，地上部氮同化能力成梯度顯著增強，而根系則無顯著差異（圖4），這可能因根系的GS活性在純銨培養(yǎng)時已經達到頂峰，而添加硝酸鹽后誘導地上部的GS2活性增強。

前人[32]研究證明，在銨硝混施的條件下，植物葉片含氮量明顯增加。公華銳等[33]的試驗結果表明，番茄生長發(fā)育各時期，隨著銨態(tài)氮含量的提高，番茄的干物質量及其氮素吸收量均顯著下降。常笑超等[21]發(fā)現，硝態(tài)氮能促進毛白楊的氮累積。胡國策等[34]發(fā)現，銨硝比例為3:1時，茶樹葉片含氮量最高。本試驗結果表明，在銨態(tài)氮條件下加入不同濃度的硝酸鹽能夠顯著提高油菜全氮、氮累積量和氮素吸收效率（圖5），表明添加硝酸鹽后可以增加油菜對氮素的吸收。前人[35-37]在花椰菜和葡萄等作物中也觀察到了一致的結果。

3.3 添加外源硝酸鹽促進油菜的生長

硝態(tài)氮中加少量銨態(tài)氮有利于喜硝作物的生長[38]，而銨態(tài)氮中加少量硝態(tài)氮有利于喜銨作物的生長[39]。有研究[40]表明，當環(huán)境中NH4+超過0.1～0.5mmol/L時就會產生銨毒害，具體表現為根系發(fā)育受到抑制，出現葉片黃化甚至枯敗掉落，植物的長勢不良甚至死亡。劉璐等[41]研究發(fā)現，在氮素形態(tài)不同配比下，銨硝混施的煙草葉綠素含量均顯著高于純硝或純銨處理。研究[42-43]發(fā)現，單一氮形態(tài)培養(yǎng)時，氮素的轉移和同化要消耗大量能量，將導致蛋白質和糖類的合成量減少，最終使作物減產，不同形態(tài)的氮混施更能促進植物的生長。王利超等[44]研究發(fā)現，銨硝比為1:1時可以促進煙草生長，使地上部葉面積增大。并且有研究[45]發(fā)現，純銨培養(yǎng)的植物葉面積變小可能導致碳累積減少，因而植物長勢變弱，并且其呼吸作用的消耗比純硝培養(yǎng)的植物更多，進一步使植物的干物質積累量減少，這可能也是為什么純銨培養(yǎng)的植物相對體積更小。前人[46]發(fā)現葉片含氮量越高，植物的光合作用越強。在本試驗中，添加外源硝態(tài)氮后，對油菜的銨毒害癥狀有明顯的緩解作用（圖2a）。這可能由于在銨態(tài)氮條件下加入不同濃度的硝酸鹽能夠顯著改善銨態(tài)氮導致的地上部分黃化，老葉枯萎脫落的癥狀也隨著硝態(tài)氮濃度的上升而逐漸消失，使葉面積大幅上升，促進了油菜的光合作用，并且消耗的碳源減少，增加了干物質的積累，使油菜的生物量顯著上升，長勢增強。

4 結論

在本研究中，我們發(fā)現與正常培養(yǎng)相比，當以銨態(tài)氮作為唯一氮源培養(yǎng)會抑制油菜的生長，減小葉面積，降低葉綠素含量。而在銨態(tài)氮條件下加入硝酸鹽會使油菜的K+、Ca2+和Mg2+含量上升，平衡了滲透勢；添加少量硝態(tài)氮既能減輕油菜葉片變黃枯萎癥狀，促進葉片的生長，增強油菜在銨態(tài)氮條件下的光合作用，提高地上部氮素同化酶的活性，從而降低NH4+含量，使地上部和根系的生物量、總氮含量、氮累積量、氮素吸收效率和光合速率顯著增加，進而促進油菜的正常生長。