miR-146a多態(tài)性與糖尿病周圍神經(jīng)病變及臨床療效的相關(guān)性研究

張馨允, 王澤華, 姚思宇

(開灤總醫(yī)院 內(nèi)分泌科, 河北 唐山, 063000)

糖尿病為臨床常見的慢性疾病，隨著中國居民經(jīng)濟(jì)水平的提高和生活方式的改變，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢[1]。糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病最常見和最復(fù)雜的慢性并發(fā)癥之一，容易造成神經(jīng)結(jié)構(gòu)改變及功能障礙，引起麻痛、發(fā)涼、感覺減退等臨床癥狀[2]。2型糖尿病(T2DM)患者的DPN患病率為42.2%, 高于1型糖尿病患者[3], 且隨著病情惡化最終可導(dǎo)致足部潰瘍、壞疽，甚至有截肢致殘的風(fēng)險[4]。DPN是多種因素協(xié)同作用的結(jié)果，確切的發(fā)病機制尚未完全闡明，其中遺傳易感性是DPN的發(fā)病基礎(chǔ)。微小RNA(miRNA)是一類由19～25個核苷酸組成的非編碼RNA, 廣泛存在于動植物中，人類基因組中有20%～30%受miRNA調(diào)控。miR-146為多功能非編碼小分子RNA, 是參與天然免疫的調(diào)控因子，主要通過對核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)相關(guān)通路的靶基因進(jìn)行調(diào)控而影響細(xì)胞代謝，特別是影響炎癥反應(yīng)的進(jìn)程[5]。T2DM患者外周血miR-146a水平較健康者普遍降低[6]，而miR-146a表達(dá)降低與T2DM的易感性有關(guān)[7]。miR-146a可通過作用于靶基因白介素受體相關(guān)激酶1(IRAK-1)和腫瘤壞死因子相關(guān)受體6(TRAF-6), 調(diào)控NF-κB通路參與DPN的發(fā)生發(fā)展[8]。編碼miRNA基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)可通過影響初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物影響pre-miRNA及其加工過程，改變蛋白質(zhì)表達(dá)，從而參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展。目前, miR-146a基因多態(tài)性的報道多集中于自身免疫性疾病和癌癥方面，關(guān)于其與DPN相關(guān)性的研究則相對較少。本研究探討了miR-146a基因多態(tài)性與DPN易感性和臨床療效的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2020年12月在開灤總醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的524例T2DM患者作為研究對象，均符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)提出的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。將299例單純糖尿病患者納入單純T2DM組，將225例T2DM合并DPN患者納入DPN組。DPN組患者納入標(biāo)準(zhǔn): ① 年齡≥18周歲者; ② 臨床診斷符合《糖尿病防治指南(2017版)》中DPN診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]者; ③ 未合并其他嚴(yán)重疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 并發(fā)其他神經(jīng)病變(如頸腰椎病變、中毒性末梢神經(jīng)炎、感染性多發(fā)性神經(jīng)炎、骨關(guān)節(jié)炎、腦卒中、格林巴利綜合征等)者; ② 并發(fā)其他對神經(jīng)傳導(dǎo)產(chǎn)生影響的疾病(如慢性酒精中毒、藥物等)者; ③ 存在心臟、肝臟、腎臟功能嚴(yán)重障礙者; ④ 存在嚴(yán)重動靜脈血管性疾病(如靜脈栓塞、淋巴管炎等)者; ⑤ 合并惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)或全身炎癥疾病者; ⑥ 哺乳期或妊娠期婦女; ⑦ 對治療藥物過敏者。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，且患者均簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集: 收集所有患者的年齡、性別、糖尿病病程、身高、體質(zhì)量等臨床資料，并計算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。

1.2.2 實驗室指標(biāo)檢測: 清晨抽取所有患者空腹靜脈血5 mL置于普通采血管，室溫下靜置30 min, 待血液完全凝固后于高速低溫離心機上以3 500 轉(zhuǎn)/min離心15 min, 分離得血清。應(yīng)用美國Roche公司7200-C全自動生化分析儀檢測空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平，應(yīng)用美國Roche公司全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測空腹胰島素(FINS)水平。另取患者空腹靜脈血2 mL于抗凝管，采用高效液相離子層析法檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR), HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.2.3 miR-146a 基因多態(tài)性檢測: 清晨抽取所有患者空腹靜脈血1 mL置于EDTA抗凝管，采用天根生化科技(北京)公司血液全基因組DNA提取試劑盒提取DNA。MiR-146a基因引物和探針序列由天根生化科技(北京)公司合成。MiR-146a基因上游引物和下游引物分別為5′-GAACTGAATTCCATGGGTTGTGT-3′和5′-GCCCACGATGACAGAGATATCC-3′, 探針G allele序列為5′-FAM-TCAGACCTGTGAAATT-MGB-3′, 探針C allele序列為5′-HEX-TCAGACCTCTGAAATT-MGB-3′。應(yīng)用Applied Bioststems公司的7500實時聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)對目的片段擴增及檢測基因型。PCR反應(yīng)條件: 50 ℃預(yù)熱2 min, 95 ℃預(yù)變性10 min, 95 ℃變性15 s, 60 ℃ 退火40 s, 共55 個循環(huán)。采用雙盲法判斷TaqMan分型結(jié)果。

1.2.4 治療方法: 所有患者均按《糖尿病防治指南(2017版)》進(jìn)行糖尿病飲食及運動干預(yù)，同時口服降糖藥控制血糖[目標(biāo)為FPG<7.0 mmol/L, 餐后2 h血糖(2 hPG)<10.0 mmol/L]。DPN患者同時服用依帕司他片(50 mg/次，3次/d)和甲鈷胺片(0.5 mg/次，3次/d)，療程為3個月。

1.3 臨床療效評價

治療前后采用丹麥DNA TEC公司OISA 2000型肌電圖儀檢測DPN患者腓總神經(jīng)、尺神經(jīng)、脛神經(jīng)、正中神經(jīng)的運動神經(jīng)和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度，各指標(biāo)重復(fù)檢測3次，最后結(jié)果取平均值。采用多倫多臨床評分系統(tǒng)(TCSS)[11]評估DPN患者的臨床癥狀與體征，由專人登記每例患者治療前后各相關(guān)指標(biāo)的數(shù)據(jù)并匯總分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料比較

DPN組糖尿病病程長于單純T2DM組, FPG、HbA1c、FINS和HOMA-IR水平高于單純T2DM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 2組患者的性別、年齡和BMI、TG、TC、LDL、HDL水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組患者臨床資料比較

2.2 miR-146a基因型和等位基因分布頻率比較

2組miR-146a基因型及等位基因分布頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); DPN組患者GG基因型分布頻率高于單純T2DM組, CG基因型分布頻率低于T2DM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者miR-146a基因型及等位基因分布頻率比較[n(%)]

等位基因百分率以每組各等位基因出現(xiàn)總頻次計算。

2.3 DPN患病風(fēng)險的多因素分析

二分類Logistic回歸分析顯示，糖尿病病程、FPG、HbA1c、HOMA-IR和miR-146a基因分型均為T2DM患者發(fā)生DPN的獨立影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 T2DM患者發(fā)生DPN風(fēng)險的多因素分析

2.4 miR-146a基因多態(tài)性與DPN患病風(fēng)險分析

GG基因型患者的DPN患病風(fēng)險高于CC基因型患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組患者miR-146a不同基因型比較[n(%)]

2.5 DPN患者的臨床治療效果

治療3個月后, DPN患者腓總神經(jīng)、尺神經(jīng)、脛神經(jīng)和正中神經(jīng)的運動和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度均高于治療前, TCSS評分低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 225例DPN患者治療前后TCSS評分和運動感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較

2.6 DPN患者臨床療效與miR-146a基因多態(tài)性的相關(guān)性分析

治療前, miR-146a不同基因型DPN患者的TCSS評分、運動感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 治療3個月后, GG基因型患者運動感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度低于CC基因型和CG基因型患者, TCSS評分高于CC基因型和CG基因型患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 治療3個月后, CG基因型患者運動感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度低于CC基因型患者, TCSS評分高于CC基因型患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 miR-146a不同基因型DPN患者治療前后運動感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度和TCSS評分比較

3 討 論

糖尿病患者可能發(fā)生嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，其中DPN為糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，長期高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致周圍神經(jīng)細(xì)胞供給紊亂，最終誘發(fā)周圍神經(jīng)病變。研究[12]表明, DPN發(fā)病機制較復(fù)雜，可能是多種因素共同作用的結(jié)果，以遺傳易感性為基礎(chǔ)、糖脂代謝紊亂引起固有性免疫的長期慢性激活而導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)。早期發(fā)現(xiàn)和治療是延緩病情進(jìn)展的重要措施，DPN早期表現(xiàn)不典型，臨床難以早期診斷，故如何有效篩選高危人群并及時干預(yù)是臨床關(guān)注的熱點。本研究結(jié)果顯示，糖尿病病程、FPG、HbA1C和HOMA-IR均為T2DM患者發(fā)生DPN的獨立影響因素(P<0.05), 提示臨床應(yīng)重點關(guān)注上述因素，必要時盡量控制，以延遲DPN的發(fā)生。

miRNA在多種人類疾病中發(fā)揮著重要作用，在臨床上常被用作診斷標(biāo)志物或基因治療靶點。miR-146a基因位于人類5號LOC285628基因的第2個外顯子上(Chr. 5q34), 存在1個rs編碼為2910164的pre-miR-146a C/G變異，在炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病等疾病中發(fā)揮著重要作用[13]。國外研究[14-15]結(jié)果顯示, miR-146a rs2910164是印度南部人群DPN的易感基因, CC基因型和C等位基因與T2DM患病風(fēng)險增加相關(guān)。另有研究[16]顯示，高加索人miR-146a基因多態(tài)性與DPN相關(guān)。王國鳳等[17]研究顯示, miR-146a基因多態(tài)性是糖尿病患者發(fā)生DPN的危險因素。本研究結(jié)果顯示, DPN組患者GG基因型分布頻率高于單純T2DM組, CG基因型分布頻率低于T2DM組，且GG基因型患者的DPN患病風(fēng)險高于CC基因型患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 因此GG基因型是DPN發(fā)病的危險因素，與上述研究結(jié)論基本一致。

DPN的臨床治療比較棘手，目前尚缺乏特效治療手段，以控制血糖、營養(yǎng)神經(jīng)等對癥支持治療為主，但僅可以改善相關(guān)癥狀及體征。甲鈷胺是一種內(nèi)源性輔酶B12，可修復(fù)受損的神經(jīng)細(xì)胞，改善神經(jīng)代謝及傳導(dǎo)[18]; 依帕司他可抑制醛糖還原酶活性，抑制多元醇通路的激活而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，控制細(xì)胞炎性反應(yīng)與程序性死亡，從而修復(fù)神經(jīng)組織損傷[2]。本研究中, DPN患者接受甲鈷胺聯(lián)合依帕司他治療3個月后，腓總神經(jīng)、尺神經(jīng)、脛神經(jīng)和正中神經(jīng)的運動和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度均高于治療前, TCSS評分均低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 說明甲鈷胺聯(lián)合依帕司對DPN有較好的治療效果。王國鳳等[19]研究顯示, CC基因型DPN患者治療后的臨床有效率和神經(jīng)傳導(dǎo)速度增加幅度顯著高于GG基因型患者。本研究中，接受甲鈷胺聯(lián)合依帕司他治療3個月后, GG基因型患者運動感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度低于CC基因型和CG基因型患者, TCSS評分高于CC基因型和CG基因型患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 說明miR-146基因多態(tài)性對甲鈷胺聯(lián)合依帕司他治療DPN的臨床效果具有一定影響。

綜上所述, miR-146a基因多態(tài)性與T2DM患者DNP易感性及臨床治療效果有關(guān), GG基因型T2DM患者的DNP易感性較高且臨床療效較差。