載脂蛋白E基因多態(tài)性與河北地區(qū)漢族人群缺血性腦卒中發(fā)病的關(guān)系

茍東蕓，苑夢偉，何莎，呂秀娟，王云鵬，王夢嬌，李姝穎，馬曉偉，3

1河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，石家莊050031；2河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3河北省神經(jīng)退行性疾病機(jī)制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

缺血性腦卒中是一種復(fù)雜的、受遺傳等多因素影響的疾病，其發(fā)病率、病死率和致殘率均較高。在過去的30年里，我國腦卒中發(fā)病率顯著增加，全國每年新發(fā)腦卒中患者約240萬人。薈萃分析表明，缺血性腦卒中的發(fā)生與載脂蛋白E(ApoE)基因多態(tài)性相關(guān)[1]，高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化作為缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素，與ApoE基因多態(tài)性也存在一定的相關(guān)性[2-4]。ApoE基因編碼的ApoE蛋白是一種富含精氨酸的堿性蛋白，在外周組織中，ApoE主要在肝臟中合成、分泌，參與外周循環(huán)中膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)等脂質(zhì)的運(yùn)輸和代謝；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ApoE主要在星型膠質(zhì)細(xì)胞中合成和分泌，通過與細(xì)胞表面ApoE受體結(jié)合，參與腦內(nèi)膽固醇的運(yùn)輸及神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞之間代謝物的細(xì)胞間交換[5]。ApoE基因主要有526C>T和388T>C兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，二者形成3種等位基因ε2(388T-526T)、ε3(388T-526C)、ε4(388C-526C)和6種基因表型ε3/ε4、ε2/ε3、ε2/ε4、ε4/ε4、ε2/ε2[6]。在中國人群中，ApoE ε4等位基因攜帶者罹患缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)較ε2和ε3等位基因攜帶者明顯升高[7-8]。腦卒中的發(fā)病率和病死率在我國的空間分布上存在由北向南的梯度，呈現(xiàn)北方高、南方低的趨勢，腦卒中負(fù)擔(dān)最重的是北部和中部地區(qū)[9]。然而目前對于河北地區(qū)漢族人群ApoE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)病的關(guān)系尚不明確。本研究對河北地區(qū)漢族缺血性腦卒中患者進(jìn)行ApoE基因多態(tài)性位點(diǎn)分析，分析ApoE基因多態(tài)性與河北地區(qū)漢族人群缺血性腦卒中發(fā)病的關(guān)系，旨在為缺血性腦卒中的預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2019年9月—10月于河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院就診的128例缺血性腦卒中患者(觀察組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥40歲；籍貫為河北地區(qū)，民族為漢族，無血緣關(guān)系和異族通婚史；經(jīng)腦CT或MRI檢查證實(shí)顱內(nèi)有缺血性病灶；3個(gè)月內(nèi)未服用過降脂藥物。排除心源性栓塞、冠心病、癡呆、嚴(yán)重感染、肝腎功能異常、惡性腫瘤、甲狀腺和血液系統(tǒng)疾病。另選擇性別、年齡匹配的來自體檢中心的健康查體者125例作為對照組。觀察組男51例，女77例，年齡(59.70±9.74)歲，BMI(25.73±4.31)kg/m2，合并高血壓83例、糖尿病26例、高脂血癥85例，有吸煙史36例、飲酒史38例、卒中家族史12例，頸部血管鎖骨下動(dòng)脈超聲顯示存在頸動(dòng)脈斑塊101例；對照組男65例、女60例，年齡(58.24±10.18)歲，BMI(25.05±3.17)kg/m2，合并高血壓51例、糖尿病19例、高脂血癥58例，有吸煙史22例、飲酒史25例、卒中家族史18例，存在頸動(dòng)脈斑塊56例。兩組性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史及糖尿病較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，觀察組高血壓、高脂血癥及頸動(dòng)脈斑塊發(fā)生率均高于對照組(P均<0.01)。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，患者及家屬對研究項(xiàng)目知情并簽署知情同意書。

1.2 血液ApoE基因多態(tài)性檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)—熒光探針技術(shù)。采集受試者空腹靜脈血2 mL，EDTA抗凝，使用人全血核酸提取試劑盒提取血液中的基因組DNA。在2 L待測樣本的基因組DNA(推薦濃度為5～15 ng/μL)、弱陽性對照和空白對照中分別加入裝有23 L SLCO1B1*lb、SLCO1B1*5、ApoE2、ApoE4反應(yīng)液的反應(yīng)管中，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：37 ℃ 10 min；95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)(設(shè)置在此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào))。熒光信號(hào)的收集定為FAM(ApoE ε2 526C、ApoE ε4 388T)、VIC(ApoE ε2 526T、ApoE ε4 388C)和ROX(內(nèi)標(biāo))。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線，劃定合適基線(一般起始設(shè)定為3，終設(shè)定為15)和熒光閥值(一般將閾值劃定在擴(kuò)增曲對數(shù)形式下指數(shù)增長期的中間)，得到不同通道Ct值并按照表1進(jìn)行結(jié)果判定。ApoE基因包括3種等位基因ε2、ε3、ε4和6種基因表型ε3/ε4、ε2/ε3、ε2/ε4、ε4/ε4、ε2/ε2。

表1 ApoE基因多態(tài)性判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 兩組ApoE基因多態(tài)性分布情況比較 觀察組ε2等位基因攜帶者(ε2/ε2+ε2/ε3)17例(13.3%)，ε3等位基因攜帶者(ε3/ε3+ε2/ε4)87例(68.0%)，ε4等位基因攜帶者(ε3/ε4+ε4/ε4)24例(18.8%)；對照組分別為21例(16.8%)、92例(73.6%)、12例(9.6%)。觀察組ε4等位基因攜帶者所占比例高于對照組(P均<0.05)。

2.2 ApoE ε4等位基因?qū)θ毖阅X卒中發(fā)病的影響 單因素Logistic回歸分析顯示，ApoE ε4等位基因(OR=2.542，95%CI為1.041～6.209，P=0.041)、高血壓(OR=2.851，95%CI為1.498～5.424，P=0.001)、頸動(dòng)脈斑塊(OR=4.514，95%CI為2.366～8.611，P<0.000)是缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素，見表2。校正單因素回歸分析中P<0.15的因素后，將TG、ε4等位基因、高血壓、頸動(dòng)脈斑塊、BMI納入多因素回歸方程中，使用前進(jìn)法分析，結(jié)果未顯示ε4等位基因是缺血性腦卒中發(fā)生的危險(xiǎn)因素。見表3。

3 討論

ApoE是一種富含精氨酸的堿性蛋白，由人類19號(hào)染色體上的ApoE基因編碼，其分子量為34 kDa，由299個(gè)氨基酸組成。526C>T和388T>C是ApoE基因最常見、最主要的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，ApoE 526C>T多態(tài)性促進(jìn)ApoE第112位的半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?，?88T>C促進(jìn)蛋白質(zhì)第158位的精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?，這些氨基酸替換導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能上的差異，使其具有不同的親和力。在ε2、ε3、ε4這3種等位基因中，ε4親和力最高，ε2親和力最低，因此對血脂代謝產(chǎn)生相反的影響[10]。研究顯示，ε2等位基因攜帶者血漿ApoE含量最高，LDL、TC含量較低，而ε4等位基因攜帶者則相反[11]。這提示ApoE基因多態(tài)性與血脂有關(guān)，ApoE基因可能通過調(diào)控血脂參與缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展。

表2 缺血性腦卒中發(fā)病影響因素的單因素Logistic回歸分析結(jié)果

表3 缺血性腦卒中發(fā)病影響因素的多因素前進(jìn)法Logistic回歸分析結(jié)果

近年來，諸多薈萃分析報(bào)告了缺血性腦卒中和ε4等位基因之間的顯著關(guān)聯(lián)。ApoE基因多態(tài)性一方面可能通過調(diào)控缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素進(jìn)而間接影響其發(fā)生和進(jìn)展，另一方面也可能通過介導(dǎo)神經(jīng)元突觸的完整性和可塑性及血腦屏障的完整性直接影響缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，亞洲缺血性腦卒中患者的ε4等位基因頻率高于高加索人群，ε4等位基因攜帶者在亞洲人群中更容易發(fā)生缺血性腦卒中[12-13]；在中國人群中，攜帶ε4等位基因增加了罹患缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。本研究對河北地區(qū)漢族人群的ApoE基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，觀察組ApoE ε4等位基因頻率高于正常對照組，這與以往針對中國人群的研究[1,7,14]結(jié)果相似，提示ApoE ε4等位基因可能提高了缺血性腦卒中的發(fā)生率。但后續(xù)的Logistic回歸在調(diào)整TG、高血壓、頸動(dòng)脈斑塊、BMI等危險(xiǎn)因素后，發(fā)現(xiàn)ApoE基因多態(tài)性并非河北地區(qū)漢族人群缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與韓國人群[15]、桂西壯族人群[16]的研究結(jié)果一致，但不同于廣州地區(qū)人群[17]、中國西北地區(qū)漢族人群[18]的研究。其原因可能與以下兩種因素有關(guān)：一是ApoE基因多態(tài)性的分布存在地區(qū)和種族差異，因此出現(xiàn)地區(qū)和民族的差異；二是本研究樣本量較少，且排除了冠心病、癡呆等與ApoE基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)性很強(qiáng)的疾病，減少了該類疾病對ApoE基因多態(tài)性分布的影響，因此出現(xiàn)與以上地區(qū)研究結(jié)果的差異。

綜上所述，在河北地區(qū)漢族人群中，缺血性腦卒中患者ApoE ε4等位基因頻率較健康人群增高，ε4等位基因攜帶者高脂血癥的發(fā)病率高于ε2、ε3等位基因攜帶，但ε4等位基因并非缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。盡管ε4等位基因非缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但它可能通過調(diào)控血脂間接影響缺血性腦卒中的發(fā)生。提示我們對于攜帶ApoE風(fēng)險(xiǎn)類基因型的缺血性腦卒中人群，有必要密切關(guān)注其血脂水平；對不同地區(qū)的人群進(jìn)行ApoE基因多態(tài)性監(jiān)測，能夠?yàn)樵摰貐^(qū)預(yù)防缺血性腦卒中提供進(jìn)一步保障。