雷公藤多苷對濕疹大鼠皮損的預防作用及機制

張明昊，董文霞，薛鵬坤，高一盈，馬偉洋，王珍，馬峰偉，張圣欣，李豐

1河南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，鄭州450046；2河南中醫(yī)藥大學藥學院

濕疹是發(fā)生于表皮及真皮淺層的過敏性皮膚疾病，可由遺傳因素導致，也可由外部環(huán)境和生活方式引起，發(fā)病時可見皮疹對稱分布，瘙癢且有滲出傾向，易反復發(fā)作。目前臨床上治療濕疹的藥物以糖皮質(zhì)激素制劑和抗組胺藥為主，用藥時間長，雖可緩解癥狀但難以有效治愈，且會存在機體抗感染能力降低、胃酸及胃蛋白酶分泌增多等不良反應，停藥后癥狀易復發(fā)[1]。中藥因其療效好、不良反應小的優(yōu)勢，逐漸成為開發(fā)新型濕疹治療藥物的主要來源。雷公藤多苷是從中藥雷公藤根部提取的有效成分，具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)機體免疫功能等多種藥理作用[2-3]?？紤]到止癢和抗炎是治療濕疹的兩個基本思路，我們將雷公藤多苷用于濕疹大鼠，觀察其對濕疹皮膚的預防效果。由于中藥具有多功效、多靶點的特點，組胺受體H1(H1R)/瞬時感受器電位受體1(TRPV1)通路、蛋白酶激活受體2(PAR-2)/TRPV1通路是皮膚濕疹癢覺發(fā)生的主要依賴途徑；絲裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)通路又與皮炎、濕疹等多種炎癥疾病的發(fā)生過程密切相關；故本研究基于H1R、PAR-2/TRPV1和p38 MAPK信號通路探討雷公藤多苷對大鼠濕疹的預防作用，旨在為雷公藤多苷治療濕疹提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g，鼠齡8周，購于鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫)2019-0002。飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學醫(yī)學機能實驗室，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～22 ℃，相對濕度為55%～60%，正常光照，大鼠自由飲水采食。本實驗經(jīng)河南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審核批準。

1.1.2 藥品與試劑 雷公藤多苷片(遠大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司)。2,4-二硝基氯苯(DNCB，上海麥克林生化科技有限公司)，使用前加入丙酮橄欖油配制成DNCB-丙酮橄欖油溶液。丙酮、二甲苯、甲醛、無水乙醇(煙臺市雙雙化工有限公司)，蘇木素染色液、伊紅染色液(上海尚寶生物科技有限公司)，H1R抗體、PAR-2抗體、TRPV1抗體、p38 MAPK抗體、p-p38 MAPK抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，β-actin抗體、RIPA裂解液、磷酸化蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、顯影定影試劑、ECL試劑盒、HRP標記山羊抗兔二抗(武漢塞維爾生物科技有限公司)。

1.1.3 主要儀器與設備 BS110S型電子天平(德國公司Sartorius公司)；MR-96TB型酶標儀[騁克儀器(上海)有限公司]；D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機[大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司]；CX23光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；BV-2型垂直電泳儀、BT-2型轉(zhuǎn)印電泳儀、MX-F型渦旋混合器(武漢賽維爾生物科技有限公司)；6300型化學發(fā)光儀(上海勤翔科學儀器有限公司)。

1.2 動物分組與造模 將50只大鼠隨機分為5組，分別為正常組、模型組和雷公藤多苷低、中、高劑量組，每組各10只。模型組和雷公藤多苷低、中、高劑量組采用DNCB誘導建立濕疹模型。對大鼠腹部及背部脫毛，裸露皮膚面積約為2 cm×2 cm。用微量移液器吸取80% DNCB-丙酮橄欖油溶液100 μL涂抹于腹部脫毛區(qū)致敏，1次/天，連續(xù)2 d。第6天用0.5% DNCB-丙酮橄欖油溶液100 μL涂抹于大鼠背部脫毛區(qū)進行激發(fā)；同時在大鼠右耳內(nèi)外側(cè)耳面均勻涂抹1% DNCB-丙酮橄欖油溶液5 μL進行激發(fā)，1次/3天，共激發(fā)5次。

1.3 藥物干預 從實驗第3天開始，雷公藤多苷低、中、高劑量組分別給予4.5、9、18 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃21 d。

1.4 大鼠背部皮膚外觀情況觀察 末次給藥24 h后，觀察各組大鼠背部造模區(qū)皮膚是否出現(xiàn)紅腫、丘疹、水皰、糜爛、滲出等濕疹表現(xiàn)。

1.5 大鼠耳腫脹度和耳腫脹抑制率測算 大鼠脫頸椎處死，沿耳基線剪下雙耳，用8 mm打孔器在左右耳中部同一位置打孔取圓形耳片；用電子天平精確稱重后按下列公式計算耳腫脹度和耳腫脹抑制率。耳腫脹度=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量。耳腫脹抑制率(%)=(模型組耳腫脹度-藥物干預組耳腫脹度)/模型組耳腫脹度×100%。

1.6 大鼠背部皮膚組織形態(tài)學觀察 采用HE染色法。取背部造模區(qū)皮膚組織，生理鹽水沖洗后，加入4%多聚甲醛固定。經(jīng)脫水、透明、包埋，切4 μm厚切片，進行HE染色，常規(guī)切片脫水、透明、中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)學變化。

1.7 大鼠背部皮膚組織H1R、PAR-2、TRPV1蛋白表達檢測 采用免疫組織化學法。石蠟切片，脫蠟、水化，H2O2封閉，PBS清洗，檸檬酸鹽緩沖液熱修復，滴加山羊血清封閉液室溫孵育。分別滴加H1R、PAR-2、TRPV1抗體(稀釋比例1∶100)，4 ℃孵育過夜；滴加二抗(稀釋比例1∶100)37 ℃孵育20 min。DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染3 min，鹽酸乙醇分化，自來水再次沖洗，經(jīng)切片脫水、透明、封片后鏡檢。每組選取5張切片，采用Image-Pro Plus6.0測定每個視野中平均光密度值，作為目標蛋白的表達量。

1.8 大鼠背部皮膚組織p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取背部造模區(qū)皮膚組織，用液氮速凍，-80 ℃儲存?zhèn)溆谩Ｈ∑つw組織勻漿，提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，一抗、二抗孵育，TBST漂洗，ECL試劑盒顯影成像，采用Image J軟件測定條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值計算p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組背部皮膚外觀表現(xiàn) 正常組生存狀態(tài)良好，皮膚光滑完整，無明顯異常；模型組背部造模區(qū)皮膚出現(xiàn)紅腫、丘疹、水皰、糜爛和滲出等濕疹表現(xiàn)；雷公藤多苷低、中、高劑量組背部造模區(qū)皮膚紅腫、糜爛及滲出程度降低，丘疹和水皰出現(xiàn)不同程度消散，皮膚較模型組明顯光滑。

2.2 各組耳腫脹度、耳腫脹抑制率比較 與正常組比較，模型組耳腫脹度增加(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組耳腫脹度減少(P均<0.05)；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組耳腫脹度減少，耳腫脹抑制率增加(P均<0.05)。見表1。

表1 各組耳腫脹度和耳腫脹率比較

2.3 各組背部皮膚組織形態(tài)學比較 與正常組比較，模型組背部皮膚表皮厚度較正常組增加，角化程度升高，呈網(wǎng)狀并伴有海綿樣水腫，毛囊口可見角栓；真皮層中可見血管輕度擴張、充血，并伴有淋巴細胞及嗜酸性粒細胞浸潤。雷公藤多苷低、中、高劑量組背部皮膚表皮輕微增厚，可見輕微海綿樣水腫和少量淋巴細胞及嗜酸性粒細胞浸潤。

2.4 各組背部皮膚組織H1R、PAR-2、TRPV1蛋白水平比較 正常組皮膚組織中有少量H1R、PAR-2、TRPV1表達；模型組H1R、PAR-2、TRPV1表達較對照組增加(P均<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組H1R、PAR-2、TRPV1表達降低(P均<0.05)；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷高劑量組H1R、PAR-2蛋白水平升高，雷公藤多苷中劑量組TRPV1蛋白水平升高，雷公藤多苷中、高劑量組p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白水平降低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組背部皮膚組織中H1R、PAR-2、TRPV1蛋白水平比較

2.5 各組背部皮膚組織p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達比較 與正常組比較，模型組皮膚組織中p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平升高(P均<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平降低(P均<0.05)；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平降低(P均<0.05)。見表3。

表3 各組背部皮膚組織中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達比較

3 討論

濕疹是皮膚科常見性、多發(fā)性及難治性疾病之一，臨床以劇烈瘙癢、多樣性皮疹為主要表現(xiàn)，嚴重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量[4]。濕疹發(fā)病機制較為復雜，目前認為該病是由多種因子引發(fā)的表皮及真皮淺層炎癥性疾病，屬遲發(fā)性變態(tài)反應[5]。本研究采用DNCB高濃度腹部致敏，低濃度背部、耳部激發(fā)的方式構建大鼠濕疹模型，結(jié)果顯示濕疹大鼠耳腫脹度升高，背部造模區(qū)表皮增厚且過度角化，真皮層見炎癥細胞浸潤，表明造模成功。該模型背部及耳廓局部病理特征與人類濕疹相似，可用于藥物療效的評價。雷公藤為衛(wèi)矛科雷公藤屬的木質(zhì)藤本植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，名莽草，主治頭風、癰腫、乳腫和疝瘕。雷公藤多苷是從雷公藤植物根中提取的總苷，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[6-7]，可用于自身免疫及皮炎濕疹疾病的治療，且未見明顯不良反應[8]。本研究結(jié)果顯示，雷公藤多苷能夠降低濕疹大鼠耳腫脹度，減輕背部造模區(qū)皮膚組織中海綿樣水腫及炎性細胞浸潤程度，表明雷公藤多苷具有較好的預防濕疹的作用。

皮膚瘙癢是濕疹的主要臨床表現(xiàn)之一，其發(fā)生主要通過組胺依賴的癢覺信號通路和非組胺依賴的PAR-2途徑共同傳遞[9]，而TRPV1是兩條信號通路共同的下游信號分子，該分子可以通過介導Ca2+的跨膜流動來影響細胞內(nèi)Ca2+濃度，是癢覺通路傳遞的樞紐[10-12]。組胺依賴的癢覺信號通路由組胺激活，通過機械刺激不敏感的無髓鞘C-纖維介導，在Ca2+存在下，H1R激活磷脂酶C(PLC)和磷脂酶A2,再活化下游TRPV1通道，使Ca2+內(nèi)流增加；同時PLC還可水解為二酰甘油而使TRPV1通道開放，從而誘導機體產(chǎn)生癢覺[13-15]。非組胺依賴的PAR-2途徑是在機械刺激熱敏感的C-纖維介導下由類胰蛋白酶激活PAR-2，活化PLC，使下游TRPV1通道開放；同時活化的PAR-2還可以激活蛋白激酶A，使TRPV1活性增加，誘導機體產(chǎn)生癢覺[16]。本研究結(jié)果顯示，濕疹大鼠背部皮膚組織中H1R、PAR-2、TRPV1蛋白表達水平升高，提示濕疹瘙癢的產(chǎn)生是H1R/TRPV1、PAR-2/TRPV1通路作用的結(jié)果，而雷公藤多苷可以抑制H1R、PAR-2、TRPV1蛋白表達，從而發(fā)揮抗瘙癢的作用。

p38 MAPK作為一個較為保守的絲氨酸/蘇氨酸絲裂原激活蛋白激酶，在去磷酸化狀態(tài)下無活性，只有通過磷酸化改變蛋白質(zhì)構象后才能與底物和ATP結(jié)合，參與細胞衰老、細胞分化、炎癥反應等生理過程，也與皮炎、濕疹、類風濕關節(jié)炎等疾病的發(fā)生密切相關[17-19]。本研究結(jié)果顯示，濕疹大鼠背部皮膚組織p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達水平顯著升高，提示濕疹的發(fā)生與p38 MAPK磷酸化水平相關;而雷公藤多苷可以下調(diào)p38 MAPK磷酸化水平，抑制p38 MAPK信號通路激活，從而發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，H1R/TRPV1、PAR-2/TRPV1和p38 MAPK信號通路在濕疹皮膚組織中均存在異常激活現(xiàn)象，而雷公藤多苷可以通過下調(diào)H1R、PAR-2、TRPV1、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白水平來抑制H1R/TRPV1、PAR-2/TRPV1和p38 MAPK信號通路的激活，從而發(fā)揮其抗瘙癢和抗炎的作用，達到預防和減輕濕疹的目的。本研究為雷公藤多苷在濕疹治療方面的深入開發(fā)利用提供了實驗依據(jù)。