瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療對(duì)心肌梗死PCI術(shù)后小鼠心肌線粒體穩(wěn)態(tài)的影響

孟紅社

心肌梗死為臨床常見疾病，若不及時(shí)予以干預(yù)，可能引起病人心室壁收縮出現(xiàn)異常的現(xiàn)象，導(dǎo)致心臟收縮力異常下降，造成泵血功能異常，進(jìn)一步導(dǎo)致心室整體結(jié)構(gòu)異常，最終演變?yōu)樾牧λソ?，?yán)重威脅病人的生命安全。近幾年，由于介入技術(shù)的進(jìn)展，使得經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)成為心肌梗死病人的主要治療方式，雖然其能夠使壞死心肌組織恢復(fù)血流灌注，縮小心肌梗死面積，但是也存在一定的局限性，并不能有效改善心肌收縮力及心室重構(gòu)[1]。心肌梗死疾病的發(fā)病機(jī)制中心室重構(gòu)發(fā)揮重要的作用。線粒體在細(xì)胞中時(shí)刻進(jìn)行動(dòng)態(tài)重構(gòu)過程，主要有線粒體生物合成、線粒體自噬、線粒體融合/分裂等，與線粒體穩(wěn)態(tài)發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步調(diào)控線粒體內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)以及活性氧的輸出[2]。有研究表明，心肌細(xì)胞線粒體穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)障礙以后，能夠引起機(jī)體內(nèi)能量供應(yīng)出現(xiàn)異常，與此同時(shí)引起機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，并且能量供應(yīng)異常及氧化應(yīng)激損傷均是心室重構(gòu)的關(guān)鍵病理因素[3]。瑞舒伐他汀具有調(diào)脂、抗炎等作用[4]。但是有研究預(yù)測(cè)瑞舒伐他汀也可改善心肌線粒體穩(wěn)態(tài)，此方面的研究目前尚處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面。本研究基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療對(duì)心肌梗死PCI術(shù)后小鼠心肌線粒體穩(wěn)態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取清潔級(jí)別雄性小鼠，均為5周，共40只，體質(zhì)量25～35 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、瑞舒伐他汀1組、瑞舒伐他汀2組，每組10只。假手術(shù)組與模型組在手術(shù)前1周予以5 mg/kg的蒸餾水灌胃；瑞舒伐他汀1組在手術(shù)前1周予以5 mg/kg瑞舒伐他汀灌胃；瑞舒伐他汀2組在手術(shù)前1周予以20 mg/kg瑞舒伐他汀灌胃。各組均為每日1次，共灌胃8周。

1.2 研究方法

1.2.1 心肌梗死小鼠模型的制備[5]采用常規(guī)方式麻醉小鼠，同時(shí)借助呼吸機(jī)輔助通氣治療，潮氣量6～8 mL/kg，呼吸頻率70～80次/min，進(jìn)行開胸操作，再將小鼠心包組織等進(jìn)行分離、結(jié)扎。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：采用心電圖檢測(cè)，其ST段出現(xiàn)向上抬高的現(xiàn)象，并且動(dòng)脈遠(yuǎn)端心肌組織出現(xiàn)明顯蒼白的現(xiàn)象。小鼠造模成功以后，均予以PCI模擬治療，再分別予以藥物或者蒸餾水干預(yù)。假手術(shù)組在開胸操作結(jié)束后，不予以結(jié)扎處理，脫臼處死小鼠，并獲取心肌組織標(biāo)本，固定，再予以不同濃度梯度的乙醇溶液，包埋，切片處理。

1.2.2 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù) 在藥物干預(yù)8周后，連接多導(dǎo)生理記錄儀，另外在小鼠的右頸總動(dòng)脈位置處再連接塑料心導(dǎo)管，待心室穩(wěn)定后記錄血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)指標(biāo)，包括左心室舒張末期內(nèi)壓(LVEDP)、左心室收縮壓(LVESP)、左心室壓力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.2.3 心肌線粒體獲取 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)指標(biāo)檢測(cè)完畢以后，脫臼處死小鼠，獲取心臟組織標(biāo)本，予以適量的生理鹽水溶液進(jìn)行清洗，再將其他非心肌組織標(biāo)本清除干凈。

1.2.4 心肌線粒各相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)檢測(cè) 將獲取的部分心肌組織置于-80 ℃冰箱中保存，采用蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)線粒體自噬相關(guān)指標(biāo)PINK1、Beclin1蛋白表達(dá)。其余部分心肌組織用于獲取線粒體。主要采用差速離心法獲取心肌組織中線粒體，具體操作方法：取上述心肌組織，剪碎，獲得勻漿溶液，加入蔗糖、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、乙二胺四乙酸(EDTA)介質(zhì)，另外再設(shè)置溶液的pH為7.4，進(jìn)行離心操作，800 r/min離心10 min，靜置，獲取上層溶液，再次進(jìn)行離心操作，1 000 r/min離心10 min，獲取下層沉淀，1 000 r/min離心10 min，定量檢測(cè)主要采用考馬斯亮藍(lán)法。

Western Blot實(shí)驗(yàn)：取組織，消化，予細(xì)胞裂解液，提取蛋白，凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗抗體(PINK1、Beclin1、Drp1、Mfn2、COXⅣ、PGC-1α、Tfam，1∶200；GAPDH，1∶1 000)，4 ℃培養(yǎng)，過夜，于第2日予磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)，再予二抗(1∶1 000)孵育。

1.2.5 線粒體膜電位 取上述獲取的心肌線粒體約0.5 mg，再予以適量的JC-1染色溶液，于37 ℃的黑暗環(huán)境下進(jìn)行水浴操作，10 min左右即可，再予以適量的蘋果酸溶液以及谷氨酸溶液，采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，獲取紅色和綠色熒光值，再計(jì)算線粒體膜電位。

1.2.6 ATP合成活力 于上述反應(yīng)介質(zhì)(蔗糖溶液+蘋果酸+谷氨酸)，依次予以適量的線粒體以及熒光素酶溶液，記錄發(fā)光強(qiáng)度，同時(shí)再予以適量的二磷酸腺苷(ADP)溶液，采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)ATP合成活力、活性氧(ROS)生成速率。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察各組血流動(dòng)力學(xué)相關(guān)指標(biāo)、線粒體膜電位及線粒體ATP合成活力。

2 結(jié) 果

2.1 4組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)指標(biāo)比較 瑞舒伐他汀1組、瑞舒伐他汀2組、模型組LVESP、+dp/dtmax水平均低于假手術(shù)組，-dp/dtmax、LVEDP水平高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，瑞舒伐他汀2組+dp/dtmax水平升高，-dp/dtmax、LVEDP水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；瑞舒伐他汀2組+dp/dtmax高于瑞舒伐他汀1組(P<0.05)，-dp/dtmax低于瑞舒伐他汀1組(P<0.05)。詳見表1。

表1 4組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)指標(biāo)比較(±s)

2.2 4組心肌線粒體功能學(xué)指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組心肌線粒體功能學(xué)指標(biāo)膜電位、ATP合成活力降低，ROS生成速率增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，瑞舒伐他汀2組心肌線粒體功能學(xué)指標(biāo)膜電位、ATP合成活力升高，ROS生成速率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 4組心肌線粒體功能學(xué)指標(biāo)比較(±s)

2.3 4組心肌線粒體自噬PINK1、Beclin1蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，瑞舒伐他汀2組、瑞舒伐他汀1組、模型組PINK1、Beclin1蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，瑞舒伐他汀2組、瑞舒伐他汀1組PINK1、Beclin1蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3、圖1。

圖1 Western Blot檢測(cè)心肌組織中PINK1、Beclin1蛋白表達(dá)

表3 4組心肌線粒體自噬相關(guān)指標(biāo)PINK1、Beclin1蛋白表達(dá)比較(±s)

2.4 4組心肌線粒體Drp1、Mfn2蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，瑞舒伐他汀2組、瑞舒伐他汀1組、模型組心肌線粒體Drp1蛋白表達(dá)升高，模型組Mfn2蛋白表達(dá)降低，瑞舒伐他汀1組、瑞舒伐他汀2組Mfn2蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，瑞舒伐他汀2組、瑞舒伐他汀1組心肌線粒體Drp1蛋白表達(dá)降低，Mfn2蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4、圖2。

圖2 Western Blot檢測(cè)Drp1、Mfn2蛋白表達(dá)

表4 4組心肌線粒體Drp1、Mfn2蛋白表達(dá)比較(±s)

2.5 4組心肌線粒體生物合成相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，瑞舒伐他汀1組、模型組心肌線粒體生物合成指標(biāo)COXⅣ、PGC-1α、Tfam蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；瑞舒伐他汀2組COXⅣ、PGC-1α、Tfam蛋白表達(dá)均高于模型組(P<0.05)，瑞舒伐他汀1組PGC-1α高于模型組(P<0.05)；瑞舒伐他汀2組心肌線粒體生物合成指標(biāo)COXⅣ、PGC-1α、Tfam蛋白表達(dá)均高于瑞舒伐他汀1組(P<0.05)。詳見表5、圖3。

圖3 Western Blot檢測(cè)心肌線粒體生物合成相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)

表5 4組心肌線粒體生物合成相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)比較(±s) 單位：%

3 討 論

高蘭蘭等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過8周瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療以后，能夠明顯提高心肌梗死病人的攝氧量水平，另外予以低劑量瑞舒伐他汀治療后，心肌梗死病人的攝氧量水平無明顯改善。吳建峰[7]研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過10周的瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療以后，能夠有效提高冠心病病人攝氧量水平，大約可提高17.9%，另外予以低劑量瑞舒伐他汀干預(yù)后，冠心病病人耗氧量并無明顯的變化。上述研究均表明，瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療更加具有時(shí)效性，但是目前關(guān)于其生物學(xué)機(jī)制尚且需要進(jìn)一步探討。本研究觀察瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療與低劑量瑞舒伐他汀對(duì)心肌梗死PCI模擬治療小鼠線粒體穩(wěn)態(tài)及心室重構(gòu)的影響，揭示瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療在心肌梗死疾病中潛在的機(jī)制。

+dp/dtmax水平能夠揭示機(jī)體左心室心肌收縮力程度。本研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療可明顯提高+dp/dtmax水平，另外低劑量瑞舒伐他汀雖然也得到一定程度的提升，但與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此研究結(jié)果進(jìn)一步表明瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療心肌梗死PCI術(shù)小鼠，對(duì)于其心室重構(gòu)時(shí)效性更優(yōu)。心肌功能的穩(wěn)定與線粒體穩(wěn)態(tài)之間關(guān)系密切。心肌梗死引起心室重構(gòu)以后，心肌組織長(zhǎng)時(shí)間處于缺血缺氧環(huán)境下，并且線粒體是關(guān)鍵靶向位置，一般常見的表現(xiàn)有氧化應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝過程出現(xiàn)障礙等，甚至包括多條凋亡信號(hào)通路的啟動(dòng)等[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀能夠明顯抑制心肌組織中線粒體ROS產(chǎn)生，但是與低劑量瑞舒伐他汀干預(yù)比較，瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療改善心肌線粒體膜電位、心肌線粒體ATP的生成更明顯。

若線粒體損傷較嚴(yán)重，并且難以恢復(fù)時(shí)，則心肌細(xì)胞線粒體開始啟動(dòng)線粒體自噬過程，目的是為了清除機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)異常的線粒體[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死模型小鼠心肌細(xì)胞中自噬水平明顯上升，如PINK1及Beclin1水平出現(xiàn)異常上升的現(xiàn)象，其中PINK1屬于線粒體自噬的啟動(dòng)因子，Beclin1主要構(gòu)成自噬體關(guān)鍵成分之一。有研究表明，敲除PINK1、Beclin1基因的小鼠模型心功能異常明顯，并且線粒體出現(xiàn)異常堆積的現(xiàn)象，小鼠心肌梗死面積異常增大[10]。說明心肌梗死病人機(jī)體內(nèi)可以通過線粒體自噬水平，維持線粒體穩(wěn)態(tài)，但是并不能有效清除異常的線粒體。本研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀可吸納并提高心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)PINK1、Beclin1水平。

心肌細(xì)胞中線粒體并不是單獨(dú)存在的，主要介導(dǎo)融合以及分裂過程，用以維持線粒體穩(wěn)態(tài)，進(jìn)一步有效發(fā)揮心肌細(xì)胞線粒體功能[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠Mfn2蛋白水平異常下降，另外Drp1蛋白水平異常上升，初步說明心肌梗死機(jī)體可能介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步打破心肌細(xì)胞線粒體融合和線粒體分裂之間的穩(wěn)態(tài)。本研究結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀干預(yù)后能夠明顯提高心肌細(xì)胞線粒體Mfn2蛋白水平，分析其原因：瑞舒伐他汀通過提高心肌細(xì)胞線粒體Mfn2蛋白水平，進(jìn)一步提高心肌細(xì)胞的抵抗能力，尤其當(dāng)心肌細(xì)胞處于缺血以及缺氧環(huán)境下的抵抗能力，同時(shí)控制ROS水平，以及對(duì)線粒體滲透性也發(fā)揮抑制作用[12]。瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療維持線粒體融合以及分裂穩(wěn)態(tài)的過程主要與心肌細(xì)胞線粒體自噬有關(guān)，瑞舒伐他汀可能通過上調(diào)線粒體融合水平，從而使線粒體處于一個(gè)新的平衡狀態(tài)[13]。

細(xì)胞能量供應(yīng)過程主要與其線粒體的功能和數(shù)量存在關(guān)系，并且線粒體的數(shù)量是關(guān)鍵因素，這一過程稱之為線粒體生物合成，其中PGC-1α屬于上述過程的關(guān)鍵因子[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組PGC-1α及其下游靶基因Tfam蛋白水平出現(xiàn)異常下降現(xiàn)象，并且COXⅣ水平也下降，說明心肌梗死病人PGC-1α表達(dá)上升，同時(shí)合并功能異常。另外本研究結(jié)果還顯示，瑞舒伐他汀干預(yù)后，能夠明顯提高心肌細(xì)胞PGC-1α水平，并且瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療后Tfam、PGC-1α、COXⅣ蛋白水平明顯上升[16]。

綜上所述，與5 mg/kg的瑞舒伐他汀用藥方案進(jìn)行比較，瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療后心肌梗死PCI術(shù)后心肌線粒體穩(wěn)態(tài)更加具有實(shí)效性，并且瑞舒伐他汀可以調(diào)節(jié)線粒體能量代謝過程以及心肌細(xì)胞線粒體生物合成，而低劑量的瑞舒伐他汀并沒有上述干預(yù)效果，分析其原因可能與心室泵血功能有關(guān)。瑞舒伐他汀強(qiáng)化治療與其低劑量之間在調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)方面可能與調(diào)控PGC-1α水平差異有關(guān)[11]。