香附四物湯全方與組方藥材揮發(fā)油經(jīng)皮外用“藥輔合一”作用研究

姚俊宏,任略,2,董潔,2,顧薇,2,陸姍姍,陳軍,2

(1.南京中醫(yī)藥大學江蘇省中醫(yī)外用藥開發(fā)與應(yīng)用工程研究中心,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023)

經(jīng)皮給藥是中藥除口服以外最常用的給藥途徑之一,但由于皮膚角質(zhì)層屏障的存在,大部分活性成分很難透皮吸收,從而嚴重限制了其藥效的發(fā)揮。應(yīng)用透皮促滲劑(Penetration enhancer, PE)是改善藥物透皮吸收最常用的有效策略[1],而中藥揮發(fā)油是一大類性質(zhì)優(yōu)良的PE,具有較高的促滲效果[2]和較低的皮膚刺激性[3]。與化學PE不同的是,揮發(fā)油PE中的成分多為小分子脂溶性成分,其透皮吸收能直接產(chǎn)生藥理活性[4-5],即具有“藥輔合一”的作用特點。

香附四物湯是中醫(yī)治療痛經(jīng)的經(jīng)典方,出自《不知醫(yī)必要》[6],全方由當歸、川芎、白芍、熟地黃、木香、香附及延胡索7味藥材組成,其中當歸、川芎、木香、香附4味藥材富含揮發(fā)油[7],且均有作為PE使用的報道[8-10],與痛經(jīng)治療作用密切相關(guān)[11-12]。前期研究已將香附四物湯開發(fā)為經(jīng)皮外用貼劑,具有給藥方便、藥效延長的優(yōu)點[13]。中藥通常復方配伍應(yīng)用,目前已有中藥藥對揮發(fā)油作為PE研究的報道[14],但研究全方揮發(fā)油作為PE應(yīng)用時的“藥輔合一”作用尚處于空白。本文提取香附四物湯全方揮發(fā)油,并與組方藥材揮發(fā)油進行體外促滲效果、皮膚細胞毒性和對離體子宮收縮抑制作用的比較,為合理選擇揮發(fā)油PE應(yīng)用于香附四物湯經(jīng)皮外用制劑提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

PTHW型調(diào)溫電熱套(南通市通州申通電熱器廠);TGL-16B型高速離心機(上海安亭科學儀器廠);7890A-5975C型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);NIST11質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(美國國家標準技術(shù)研究所);TK-12D型透皮擴散試驗儀(上海鍇鎧科技貿(mào)易有限公司);Millicell ERS-2細胞膜電阻儀(美國Millpore公司);CO2培養(yǎng)箱(德國Memmert公司);SW-CJ-IF型超凈工作臺(蘇凈安泰公司);XD-202型倒置顯微鏡(江南永新公司);Chromate 4300型酶標儀(美國Awareness公司);MPA2000多導生理儀(北京吉安得爾科技有限公司)。

1.2 試藥

當歸、川芎、白芍、熟地黃、木香、香附、延胡索藥材飲片均購于蘇州天靈中藥飲片有限公司,由南京中醫(yī)藥大學藥學院劉圣金副教授鑒定符合2020年版《中國藥典》一部要求。氮酮(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150104);縮宮素注射液(四川金科藥業(yè)有限責任公司,批號：20180601);苯甲酸雌二醇注射液(四川金科藥業(yè)有限責任公司,批號：20180101),鹽酸維拉帕米(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：20181102)，其余試劑均為分析純。

1.3 細胞與動物

人永生化表皮角質(zhì)形成細胞(HaCaT細胞),購于江蘇凱基生物股份有限公司,以DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及100 U·mL-1青霉素-鏈霉素溶液),37 ℃培養(yǎng)于5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。

雌性SD大鼠,體質(zhì)量180～220 g,SPF級,購于南京青龍山動物繁殖場,許可證號:SCXK(蘇)2019-0001。實驗過程中對動物的處理遵守科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》的規(guī)定,通過南京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準(批準號：201911A028)。

2 方法

2.1 中藥揮發(fā)油的制備

所有揮發(fā)油均通過水蒸氣蒸餾法提取。按質(zhì)量比當歸∶川芎∶白芍∶熟地黃∶木香∶香附∶延胡索(6∶3∶3∶8∶2∶3∶3)全方配伍(處方來源于《不知醫(yī)必要》[6]),提取香附四物湯全方揮發(fā)油。另稱取各含揮發(fā)油組方藥材(當歸、川芎、木香、香附),粉碎后,加6倍量水浸泡一定時間,連接揮發(fā)油提取器和冷凝管,自冷凝管上端加純水至溢出揮發(fā)油提取器支口,加熱保持微沸狀態(tài),提取至揮發(fā)油的量不再增加,停止加熱。放冷至室溫,加入適量無水硫酸鈉脫水,于4 ℃避光密封保存。

2.2 GC-MS成分分析

2.2.1 供試品制備 精密稱定揮發(fā)油0.10 g于10 mL量瓶中,乙酸乙酯定容,12 000 r·min-1離心10 min,取上清液進行GC-MS成分分析。

2.2.2 GC-MS分析條件 HP-5MS色譜柱(5%苯甲基聚硅氧烷石英毛細管柱,30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣為氦氣,流速1 mL·min-1;離子源為EI源,電離能量70 eV,離子源溫度230 ℃;進樣口溫度250 ℃,進樣體積1 μL,采取分流進樣方式進行分析。具體檢測條件參見表1。

表1 不同揮發(fā)油GC-MS分析的條件參數(shù)

2.3 皮膚電阻法評價揮發(fā)油促滲效果

皮膚屏障功能的強弱可以通過皮膚電阻值進行評價,電阻值減小表明皮膚屏障功能下降[15]。將大鼠皮膚自然解凍,固定于Transwell的24孔小室上,角質(zhì)層向上,向接收室內(nèi)加入0.65 mL的PBS,皮膚上層加入0.2 mL含3%揮發(fā)油的溶液(溶劑為70%異丙醇-PBS),空白對照組加入等體積的溶劑,以化學PE氮酮為陽性對照。將24孔小室置于37 ℃恒溫水浴中,插入細胞電阻儀電極,平衡數(shù)秒后讀取電阻值,即為初始電阻R0,并于給藥后的1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60 min時讀取電阻值,即為Rt,以R0/Rt對時間t作圖,并對曲線中直線部分進行線性回歸,所得直線斜率K即為衡量不同揮發(fā)油的透皮促滲能力的參數(shù),按公式計算促滲倍數(shù)ER=K揮發(fā)油/K空白對照。

2.4 揮發(fā)油皮膚細胞毒性評價

取對數(shù)生長期的HaCaT細胞,以0.25%胰蛋白酶溶液消化后,以含10%胎牛血清的DMEM稀釋,每孔7 000個接種于96孔細胞培養(yǎng)板上,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h,棄去培養(yǎng)基,每孔加100 μL不同濃度的揮發(fā)油溶液,溶劑為含1%DMSO的DMEM培養(yǎng)基,設(shè)5個復孔,以空白溶劑組為對照孔,以不含細胞的培養(yǎng)基作為調(diào)零孔,以化學PE氮酮為對照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,棄去給藥液,每孔加入0.83 mg·mL-1的MTT溶液120 μL,培養(yǎng)4 h,棄去MTT溶液,加入150 μL DMSO,搖床振蕩10 min,用酶標儀于570 nm處測定吸光度值。存活率(%)=(A揮發(fā)油-A調(diào)零孔)/(A空白對照-A調(diào)零孔)×100%。揮發(fā)油對細胞的毒性以半數(shù)抑制率(IC50)作為評價指標,IC50采用GraphPad Prism 8計算。

2.5 離體子宮收縮模型評價揮發(fā)油生物效應(yīng)

雌性SD大鼠,實驗前3 d,每天皮下注射苯甲酸雌二醇,劑量為10 mg·kg-1·d-1,第4天動物安樂死后摘取子宮,小心去除子宮上黏附的血管及肌肉。將子宮取出后立即放入預(yù)冷的Lock's液中清洗后,將子宮連接于張力換能器上,加入預(yù)熱37 ℃的Lock's液,通入含5%CO2的氧氣。調(diào)節(jié)子宮負荷質(zhì)量,待子宮收縮幅度恢復節(jié)律后,開始記錄收縮曲線,加入縮宮素(0.01 U·mL-1)誘導子宮異常收縮,記錄一段收縮曲線后,加入相應(yīng)組別的揮發(fā)油,揮發(fā)油終濃度為0.02 μg·mL-1,以空白溶劑為陰性對照,Ca2+通道阻滯劑維拉帕米作為陽性對照。按抑制率=(給藥前參數(shù)—給藥后參數(shù))/給藥前參數(shù)×100%,計算給藥后子宮平滑肌收縮幅度、收縮頻率及肌張力的變化。

3 結(jié)果

3.1 揮發(fā)油GC-MS成分分析

5種揮發(fā)油GC-MS成分對比如表2所示,提取的香附四物湯全方揮發(fā)油中主要成分為藁本內(nèi)酯,占總成分的43.54%,來自處方中川芎與當歸,川芎油和當歸油中含有藁本內(nèi)酯分別為38.69%和80.28%。全方揮發(fā)油的化學成分不僅僅等同于各組方揮發(fā)油組成的簡單疊加,與組方藥材揮發(fā)油相比,全方揮發(fā)油共產(chǎn)生了16種新成分,與川芎油的共有成分最多,共10種成分。

表2 香附四物湯全方揮發(fā)油及與各組方藥材揮發(fā)油成分比較

3.2 皮膚電阻法評價不同揮發(fā)油的促滲效果

不同揮發(fā)油處理離體皮膚后,電阻隨時間變化見圖1,相比空白對照組,5種揮發(fā)油對離體大鼠皮膚的電阻值均有影響,電阻值隨揮發(fā)油作用時間的延長呈現(xiàn)逐步降低的趨勢,表明揮發(fā)油干擾了皮膚的屏障作用。揮發(fā)油對離體大鼠皮膚電阻的影響依次為:木香油>香附油>全方揮發(fā)油>川芎油>氮酮>當歸油。對結(jié)果進行t檢驗,如表3所示,全方揮發(fā)油及4種組方揮發(fā)油均具有顯著的透皮促滲效果(P<0.05,P<0.01),全方揮發(fā)油、香附油和木香油的促滲效果顯著強于化學PE氮酮(P<0.05,P<0.01),其中全方揮發(fā)油的促滲作用較強，是化學PE氮酮的2.5倍。

圖1 揮發(fā)油處理后大鼠離體皮膚電阻比值-時間曲線Fig. 1 Electrical resistance ratio-time curve of isolated skin

表3 揮發(fā)油處理后大鼠離體皮膚電阻變化率結(jié)果Table 3 Electrical resistance change rates of isolated skin treated with EOs

3.3 皮膚細胞毒性研究結(jié)果

以IC50值評價不同揮發(fā)油對人角質(zhì)形成細胞的毒性作用,結(jié)果如表4所示,香附四物湯全方揮發(fā)油與4種組方藥材揮發(fā)油的細胞毒性均顯著低于化學PE氮酮(P<0.05,P<0.001),中藥揮發(fā)油對皮膚細胞刺激性較低,其中對皮膚細胞毒性作用表現(xiàn)為當歸油≈川芎油<全方揮發(fā)油<香附油<木香油。

表4 揮發(fā)油作用于HaCaT細胞的IC50值Table 4 IC50 of HaCaT treated with

3.4 離體子宮收縮實驗結(jié)果

提取的5種揮發(fā)油對大鼠離體子宮平滑肌收縮幅度、收縮頻率及肌張力的影響如圖2所示,與空白對照組相比,除川芎油外其余4種揮發(fā)油均顯著抑制了平滑肌收縮頻率和幅度(P<0.05,P<0.01，P<0.001),其中對平滑肌收縮幅度抑制作用全方揮發(fā)油>當歸油>維拉帕米>木香油>香附油>川芎油,對平滑肌收縮頻率的抑制率全方揮發(fā)油>香附油>木香油≈維拉帕米>當歸油>川芎油。此外,除川芎油和香附油,其余3種揮發(fā)油均顯著降低子宮平滑肌肌張力(P<0.05,P<0.01,P<0.001),全方揮發(fā)油與陽性藥效果相當,抑制率分別為66.98%和67.00%,其次為木香油53.64%,當歸油作用略弱,抑制率為44.33%。

綜合分析離體子宮收縮實驗的3個評價指標表明:在同等劑量下,香附四物湯組方提取的揮發(fā)油抑制子宮收縮的生物效應(yīng)明顯強于各組方藥材揮發(fā)油。

注:與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖2 揮發(fā)油對大鼠離體子宮平滑肌收縮幅度、收縮頻率及肌張力的作用Fig. 2 The activities on contraction amplitude, contraction frequency, and muscle tension of rat uterine smooth muscle of EOs

4 討論

揮發(fā)油作為中藥的組成部分,品種總數(shù)達300余種,是中藥藥理活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ),其中有34種中藥揮發(fā)油作為PE應(yīng)用[16],與化學PE相比具有“藥輔合一”的作用優(yōu)勢。前期研究表明21種辛味中藥揮發(fā)油中有11種揮發(fā)油PE促滲效果優(yōu)于經(jīng)典化學PE氮酮[2],本文提取了香附四物湯全方揮發(fā)油和已有促滲研究報道的木香油、香附油、當歸油和川芎油,通過皮膚電阻法,發(fā)現(xiàn)除當歸油外的4種揮發(fā)油促滲效果均優(yōu)于氮酮;5種中藥揮發(fā)油的皮膚細胞毒性均顯著低于氮酮(P<0.05)。其中全方揮發(fā)油促滲作用僅次于木香油和香附油,但是皮膚細胞毒性低于木香油和香附油。與化學PE氮酮相比,全方揮發(fā)油促滲能力是氮酮的2.5倍,皮膚安全性為氮酮的3.28倍,因此香附四物湯全方揮發(fā)油具有作為PE應(yīng)用的潛力。

“藥輔合一”是中藥制劑使用輔料的重要原則,蘊含著獨特的哲學智慧和用藥理念,在中藥制劑中具有普遍性[17]。與化學PE不同,中藥揮發(fā)油由于其成分經(jīng)皮吸收的性質(zhì)可以發(fā)揮藥理效應(yīng)。李鈺等[5]以桂皮醛為指標,考察了肉桂油中桂皮醛及桂皮醛單體的體外經(jīng)皮吸收行為,發(fā)現(xiàn)桂皮醛在肉桂油中的滲透性更強。藁本內(nèi)酯是多種揮發(fā)油中的共有成分,具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎藥理活性[18],其適宜的相對分子質(zhì)量,適中的油水分配系數(shù)以及較好的溶解度,利于其在外用制劑中的透皮吸收[19]。在同等劑量下,全方揮發(fā)油對離體子宮收縮的抑制作用明顯優(yōu)于各組方藥材揮發(fā)油,強于Ca2+通道阻滯劑維拉帕米,提示選擇其作為PE應(yīng)用于香附四物湯經(jīng)皮外用制劑除了促進其他藥效成分的透皮吸收,自身也能直接產(chǎn)生較強的藥理作用,具有“藥輔合一”的特點。

通過GC-MS分析發(fā)現(xiàn),全方揮發(fā)油與組方藥材揮發(fā)油相比共產(chǎn)生了16種新成分,雖然與川芎油共有成分種類最多,主要成分藁本內(nèi)酯的含量相當(分別為45.54%和38.69%),但其促滲作用為川芎油的1.29倍(K電阻比值),對子宮平滑肌抑制作用最強而川芎油未見顯著抑制作用,提示7味藥材按處方比例共煎提取,可能發(fā)生了一系列的物理或化學變化[20]。在配伍作為PE應(yīng)用時,不同揮發(fā)油可能體現(xiàn)協(xié)同作用,比如香附油和川芎油主要降低皮膚屏障,促進其他揮發(fā)油(如當歸油)或其他藥理活性強的成分透皮發(fā)揮效應(yīng)。因此全方提取的揮發(fā)油較4種組方藥材揮發(fā)油顯示出增效(促滲效果強和藥理活性強)的趨勢,更易發(fā)揮“藥輔合一”作用,在一定程度上闡明了香附四物湯配伍應(yīng)用的科學性和必要性。

皮膚電阻法早已廣泛用于離體皮膚屏障功能的評價[15,21],以及PE的篩選[22]。本文應(yīng)用市售細胞電阻儀結(jié)合Transwell小室進行皮膚電阻值的測定,課題組前期應(yīng)用該套裝置評價了溫里藥揮發(fā)油對皮膚屏障作用的影響,并與Franz擴散池法對揮發(fā)油促滲香附四物湯中不同極性成分透皮效果進行比較,發(fā)現(xiàn)兩種方法對揮發(fā)油PE促滲不同極性成分的評價結(jié)果具有明顯的相關(guān)性(R2=0.748 1～0.812 9)[23],證明皮膚電阻技術(shù)可以代替滲透實驗評價PE促滲能力。本文應(yīng)用皮膚電阻法評價香附四物湯提取的揮發(fā)油的透皮促滲能力,可以排除被促滲藥物性質(zhì)的干擾。目前仍有90%揮發(fā)油尚未作為PE開發(fā),通過藥對或配伍還可能極大豐富揮發(fā)油PE種類,皮膚電阻法具有高通量篩選的優(yōu)點,可提高中藥揮發(fā)油PE開發(fā)和應(yīng)用的效率,充分利用好和發(fā)展好中藥揮發(fā)油的資源寶庫。