皂莢刺發(fā)育過(guò)程中形態(tài)與結(jié)構(gòu)觀察研究

孫婭楠，趙 楊*，何可權(quán)，陸躍堂

(1 貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州省森林資源與環(huán)境研究中心，貴陽(yáng) 550025；2 獨(dú)山縣國(guó)有林場(chǎng)，貴州獨(dú)山 558200)

皂莢(GleditsiasinensisLam.)隸屬于豆科(Leguminosae)云實(shí)亞科(Caesalpinioideae)皂莢屬(Gleditsia)，又名皂角、豬牙皂等[1]，是中國(guó)生態(tài)經(jīng)濟(jì)型鄉(xiāng)土樹(shù)種。其一身均是寶，具有食用[2]、藥用[3]、化工[4]和觀賞[5]等價(jià)值，且還在美容、洗發(fā)水和用材等方面發(fā)揮著作用。皂莢刺是皂莢的主要藥用部位，其富含黃酮類(lèi)、三萜皂苷類(lèi)等藥用成分，具有消除炎癥、抗腫瘤等作用，被譽(yù)為“十大抗癌草藥”之一[6]。

皂莢刺的研究主要集中在皂莢刺的藥用價(jià)值方面[7]，而在皂莢刺發(fā)育方面的研究鮮有報(bào)道，其中李建軍等[8]和陳思等[9]對(duì)皂莢刺的物候期進(jìn)行觀測(cè)，簡(jiǎn)單地描述其形態(tài)變化。皂莢刺發(fā)育過(guò)程及機(jī)理不清，影響了皂莢刺用遺傳改良與定向栽培，故本研究以皂莢實(shí)生苗為研究材料，通過(guò)外部形態(tài)對(duì)應(yīng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的方法，以揭示皂莢刺發(fā)育過(guò)程的形態(tài)學(xué)變化，為皂莢刺用遺傳改良與定向栽培奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究試驗(yàn)地位于貴州大學(xué)林學(xué)院基地，地處106°39′27″E，26°27′13″N，海拔1 082 m，為亞熱帶濕潤(rùn)溫和型氣候，年均溫15.3 ℃，年平均降水量約1 130 mm左右。2019年底于貴州省貴陽(yáng)市采集皂莢種子，2020年6月開(kāi)始對(duì)皂莢種子進(jìn)行催芽處理(通過(guò)濃硫酸處理30 min，38 ℃水浴浸泡24 h)，種子露白后移苗，即選用健康狀況良好的皂莢苗木進(jìn)行試驗(yàn)，以混合土(黃壤∶蛭石∶珍珠巖=6∶1∶1)作為栽培基質(zhì)，花盆規(guī)格為20 cm×20 cm，每盆定植一株苗，盆栽完成后統(tǒng)一進(jìn)行澆水、除草等苗期管理。對(duì)皂莢刺芽發(fā)育進(jìn)行為期6個(gè)月的觀測(cè)，前期為每天觀察一次，后期為半個(gè)月觀察一次，并及時(shí)做好皂莢刺外觀形態(tài)與石蠟切片的拍照記錄及測(cè)定。

1.2 指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 皂莢刺生物量與含水量測(cè)定各時(shí)期分別選取30株長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病害、能代表平均水平的皂莢幼苗，將當(dāng)天采回來(lái)的皂莢苗鮮樣帶回實(shí)驗(yàn)室，在105 ℃烘箱中殺青30 min，之后60 ℃烘箱繼續(xù)烘至恒重，即可稱(chēng)其干重為生物量，并計(jì)算皂莢刺的分配比和含水量，皂莢刺分配比(%)=刺干重/單株干重，皂莢刺含水量(%)=(刺鮮重-刺干重)/刺鮮重。

1.2.2 皂莢芽/刺掃描電鏡、體視顯微鏡觀察各時(shí)期將當(dāng)天采回來(lái)的芽鮮樣帶回實(shí)驗(yàn)室，用Hitachi TM4000 plus掃描電鏡和Leica M205FA顯微鏡觀察10株皂莢刺的外部形態(tài)變化，并做好拍照記錄，利用Image J軟件測(cè)定皂莢刺形成后的單株刺數(shù)量、刺分叉數(shù)、刺基徑、刺長(zhǎng)等指標(biāo)。

1.2.3 皂莢芽/刺石蠟切片觀察各時(shí)期將10株現(xiàn)采的皂莢芽/刺鮮樣去掉其葉片，保留完整的腋芽立即放入FAA固定液(50%乙醇∶甲醛∶冰乙酸∶甘油=18∶1∶1∶1)中固定，皂莢刺木質(zhì)硬化后則選用同比例70%乙醇的FAA固定液固定，然后采用石蠟切片法制成永久性切片，石蠟切片染色采用番紅-固綠染色[10]，之后在Leica DM3000顯微鏡下進(jìn)行解剖學(xué)觀察且拍照記錄，同樣利用Image J軟件測(cè)量髓、木質(zhì)部、韌皮部的寬度等指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析、多重比較(P<0.05)進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 皂莢幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程

圖1為未催芽處理當(dāng)天(0 d)以及1～14 d皂莢幼苗的外部形態(tài)。未催芽處理的種子有堅(jiān)硬的種殼，種胚顏色為黃色(圖2，A)；催芽處理1 d后皂莢種子吸脹，種胚顏色由原來(lái)的黃色變?yōu)辄S綠色，且質(zhì)感由原來(lái)的干癟變?yōu)樗疂?rùn)的肉質(zhì)狀(圖2，B)；2 d皂莢種子露白，種胚大小變化不明顯(圖2，C)；3 d皂莢種子出土，種胚形態(tài)整體膨大，上胚軸明顯向上延伸(圖2，D)；4 d皂莢的下胚軸和上胚軸繼續(xù)向上延伸(圖2，E)；6 d種子脫掉種殼，種胚中幼葉的下半部顏色由原來(lái)的黃綠色變?yōu)榫G色，幼葉較前期更為趨于成熟(圖2，F(xiàn))；7 d皂莢幼苗張開(kāi)子葉，肉眼能在葉腋處看見(jiàn)一個(gè)小凸起的腋芽(圖2，G)；8 d上胚軸繼續(xù)向上延伸，節(jié)間距離變大，子葉向兩側(cè)更為張開(kāi)，葉腋處的腋芽逐漸膨大變得更為明顯(圖2，H)；14 d肉眼能清楚地看見(jiàn)皂莢刺的形態(tài)，可以確定皂莢刺著生的位置為皂莢苗的葉腋處(圖2，I)；30 d皂莢幼苗節(jié)間距離基本固定(圖2，J)；75 d皂莢刺顏色逐漸變黃(圖2，K)；165 d皂莢幼苗的葉片脫落，皂莢刺變?yōu)榧t褐色(圖2，L)。

圖中為未催芽處理當(dāng)天(0 d)以及1-14 d皂莢幼苗的外部形態(tài)圖1 皂莢生長(zhǎng)過(guò)程中的外部形態(tài)The figure shows the external morphology of G. sinensis seedlings on the day without bud forcing treatment(0 d) and 1-14 dFig.1 External morphology of G. sinensis development process

A.未催芽處理當(dāng)天(0 d)；B-L.分別為催芽處理后1、2、3、4、6、7、8、14、30、75和165 d皂莢葉腋處的外部形態(tài)圖2 皂莢刺生長(zhǎng)過(guò)程中的局部形態(tài)A. The day without bud forcing treatment(0 d)； B-L. The external morphology of G. sinensis axillary on after bud forcing treatment 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 14, 30, 75 and 165 dFig.2 Local morphology of G. sinensis thorn development process

2.2 皂莢刺發(fā)育過(guò)程的形態(tài)學(xué)變化

皂莢在種子狀態(tài)下未見(jiàn)刺芽(圖3，A)，而是在催芽處理3 d時(shí)才發(fā)現(xiàn)皂莢刺原基，且其為一個(gè)裸芽，沒(méi)有鱗葉包裹，呈扁平、肉質(zhì)狀(圖3，B)；4 d皂莢刺芽整體不再呈扁平狀，出現(xiàn)明顯的膨大(圖3，C)；5 d能看見(jiàn)兩端有兩個(gè)“小凸起”，整體呈小山狀(圖3，D)；6 d 皂莢刺芽?jī)啥说耐蛊鸶鼮槊黠@(圖3，E)；7 d觀察到之前的“小凸起”繼續(xù)向上延伸，皂莢刺芽頂部出現(xiàn)裂開(kāi)的跡象(圖3，F(xiàn))；8 d后“小凸起”發(fā)育為鱗葉，形成2枚外部的已完全分離的鱗葉，并出現(xiàn)明顯的主徑(圖3，G)；9 d觀察到皂莢刺側(cè)枝發(fā)育的“小凸起”，皂莢刺芽開(kāi)始抽梢，徑向生長(zhǎng)更快(圖3，H)；14 d皂莢刺的基本結(jié)構(gòu)發(fā)育完全，其分枝數(shù)已固定，且皂莢刺分枝時(shí)均會(huì)發(fā)育1枚鱗葉，此時(shí)的皂莢刺及其鱗葉仍呈肉質(zhì)狀(圖3，I)；30 d皂莢刺開(kāi)始木質(zhì)硬化(圖3，J)；75 d皂莢刺的顏色開(kāi)始變?yōu)辄S褐色(圖3，K)；165 d皂莢刺顏色完全變?yōu)榧t褐色(圖3，L)。

A-H分別為催芽處理2-9 d皂莢刺的外部形態(tài)，I-L分別為14、30、75和165 d皂莢刺的外部形態(tài)圖3 皂莢刺發(fā)育過(guò)程中的外部形態(tài)A-H are the external morphology of G. sinensis thorn on 2-9 d with bud forcing treatment, I-L are the external morphology of G. sinensis thorn on 14, 30, 75 and 165 dFig.3 External morphology of Gleditsia sinensis thorn development process

由表1可知，皂莢刺發(fā)育過(guò)程中刺的外部形態(tài)整體呈上升趨勢(shì)，且各時(shí)期間差異顯著(P<0.05)。其中皂莢單株刺數(shù)量和分枝數(shù)均在皂莢刺開(kāi)始木質(zhì)化后增長(zhǎng)迅速，增長(zhǎng)率分別為204.54%、31.09%，在刺完全褐化時(shí)，達(dá)到最大值；而皂莢刺的單刺基徑則是在刺開(kāi)始褐化以后的增長(zhǎng)最為迅速，增長(zhǎng)率為54.37%，分別是前3個(gè)時(shí)期的3.32、1.89、1.54倍；且皂莢刺的單刺總長(zhǎng)則在刺基本結(jié)構(gòu)形成后增長(zhǎng)最為迅速，其增長(zhǎng)率為254.67%。

表1 皂莢刺發(fā)育過(guò)程中外部形態(tài)的變化

2.3 皂莢刺發(fā)育過(guò)程的解剖學(xué)變化

皂莢幼苗出土前，尚未發(fā)現(xiàn)皂莢刺腋芽原基，但能觀察到皂莢幼葉的小葉原基(圖4，A)；3 d觀察到皂莢刺腋芽原基，其與皂莢幼苗莖段的維管束相連，根據(jù)細(xì)胞組織分區(qū)學(xué)說(shuō)，其AM由體積較大且呈圓頂狀的CZ、體積較小且胞質(zhì)致密的PZ及沿軸向呈明顯縱向排列的RM所組成，頂狀結(jié)構(gòu)的頂端為CZ，在CZ區(qū)的周?chē)h(huán)繞著PZ，OC維護(hù)著CZ，OC的下方是RM(圖4，B-C)；4 d CZ的細(xì)胞通過(guò)垂周分裂，產(chǎn)生表皮，然后通過(guò)其側(cè)面和基部細(xì)胞的分裂，產(chǎn)生PZ的內(nèi)層及RM，促使皂莢刺腋芽整體膨大(圖4，D)；5 d PZ細(xì)胞持續(xù)分裂，產(chǎn)生鱗葉原基P (圖4，E)；7 d皂莢刺芽鱗葉發(fā)育已基本完成，有開(kāi)裂的跡象(圖4，F(xiàn))；8 d鱗葉發(fā)育完全，已成型，皂莢刺主軸向上延伸(圖4，J)；9 d PZ細(xì)胞持續(xù)平周分裂，產(chǎn)生側(cè)枝原基BP(圖4，H)；10 d PZ細(xì)胞繼續(xù)分裂分化，再次產(chǎn)生另一個(gè)側(cè)枝原基，皂莢刺腋芽徑向生長(zhǎng)變化顯著(圖4，I)。

A和B-C分別為催芽處理2 d和3 d皂莢刺解剖結(jié)構(gòu)的縱切面，D-I分別為4、5、7、8、9和10 d皂莢刺解剖結(jié)構(gòu)的縱切面；AM.腋生分生組織；P.葉原基；VB.維管束；CZ.中央?yún)^(qū)母細(xì)胞區(qū)；RM.肋狀分生組織區(qū)；PZ.周緣分生組織區(qū)；OC.中央組織中心；Ca.鱗葉；BP.側(cè)枝原基圖4 皂莢刺發(fā)育過(guò)程中的解剖結(jié)構(gòu)變化A and B-C are longitudinal sections of the anatomical structure of G. sinensis thorn with bud forcing treatment 2 d and 3 d. D-I are longitudinal sections of the anatomical structure of G. sinensis thorn with 4, 5, 7, 8, 9 and 10 d; AM. Axillary meristem; P. Phyllopodium; VB. Vascular bundle; CZ. Central zone; RM. Rib meristem; PZ. Peripheral zone; OC. Organizing center; Ca. Cataphyll; BP. Branch primordiaFig.4 Changes in the anatomical structure of G. sinensis thorn development process

皂莢刺的結(jié)構(gòu)均呈近似橢圓形，在刺基本結(jié)構(gòu)形成時(shí)期，皂莢刺已經(jīng)分化表皮、皮層、韌皮部、木質(zhì)部、髓等組織結(jié)構(gòu)，且在木質(zhì)部中觀察到環(huán)紋導(dǎo)管(圖5，A-B)；之后原形成層向外形成韌皮部，向內(nèi)形成木質(zhì)部，韌皮部和木質(zhì)部生長(zhǎng)變化顯著(圖5，C-D)；此后木質(zhì)部和韌皮部持續(xù)生長(zhǎng)，兩者相比，木質(zhì)部的生長(zhǎng)速度大于韌皮部(圖5，E-H)。

如表2所示，隨著皂莢幼苗的生長(zhǎng)，皂莢刺的髓、木質(zhì)部、韌皮部寬度整體均呈上升趨勢(shì)，且各時(shí)期間差異顯著(P<0.05)。其中皂莢刺的髓寬度在刺開(kāi)始木質(zhì)化之前雖有差別，但尚未達(dá)到差異水平，在刺完全褐化期的增長(zhǎng)率最大，達(dá)到47.62%；木質(zhì)部寬度同樣在刺完全褐化期的增長(zhǎng)率最大，達(dá)到282.24%，分別是其他3個(gè)時(shí)期的9.96、4.69和3.82倍；而皂莢刺的韌皮部寬度則在刺基本結(jié)構(gòu)形成后增長(zhǎng)率最大，達(dá)到106.32%，而此后的增長(zhǎng)率只有22.27%、7.13%。

表2 皂莢刺發(fā)育過(guò)程中維管柱的變化

2.4 皂莢刺發(fā)育過(guò)程的生物量變化

由表3可知，在皂莢刺的生長(zhǎng)進(jìn)程中，皂莢幼苗的單株刺生物量和刺分配比整體均呈上升趨勢(shì)，而刺含水量則呈下降趨勢(shì)，各時(shí)期間差異顯著(P<0.05)。其中皂莢刺生物量在刺開(kāi)始木質(zhì)化前的時(shí)期差異不顯著，而在刺開(kāi)始木質(zhì)化之后生長(zhǎng)迅速，是其他3個(gè)時(shí)期的94.71、10.67和0.83倍；皂莢刺的分配比同樣在刺開(kāi)始木質(zhì)化之后生長(zhǎng)迅速，增長(zhǎng)率為89.86%，在刺完全褐化時(shí)達(dá)到最大值；而皂莢刺的含水量在刺基本結(jié)構(gòu)形成時(shí)達(dá)到最大值，之后開(kāi)始下降，在刺開(kāi)始褐化后迅速下降，下降率為73.82%，在刺完全褐化時(shí)達(dá)到最小值。

表3 皂莢刺發(fā)育過(guò)程中生物量和含水量的變化

3 討 論

芽是枝、花或花序的雛體，可根據(jù)芽在枝條上的著生位置、將發(fā)育成的器官性質(zhì)、芽鱗的有無(wú)、生理活動(dòng)的狀態(tài)，分別分為定芽和不定芽，葉芽，花芽和混合芽，裸芽和被芽，活動(dòng)芽和休眠芽等類(lèi)型[11]。本研究中，皂莢刺芽是催芽處理3 d才在掃描電鏡下觀察到皂莢刺的芽原基，而皂莢刺芽的著生位置為皂莢幼苗的葉腋內(nèi)，為腋芽或側(cè)芽，故皂莢刺芽為定芽；并皂莢刺芽將發(fā)育成變態(tài)的枝條，故為葉芽；且根據(jù)在掃描電鏡下觀察到的皂莢刺原基，其為一個(gè)裸芽，無(wú)芽鱗包被；皂莢刺芽在生長(zhǎng)季能形成變態(tài)的枝條，故當(dāng)年由種子萌發(fā)的皂莢幼苗，其刺芽為活動(dòng)芽。

莖端分生組織(SAM)位于植物嫩枝的尖端，是植物地上部分器官的來(lái)源。本研究中皂莢刺芽的腋生分生組織與頂芽莖尖分生組織結(jié)構(gòu)相類(lèi)似，根據(jù)細(xì)胞組織分區(qū)學(xué)說(shuō)，可將SAM分為中心區(qū)(CZ)、周邊區(qū)(PZ)和肋狀區(qū)(RM)[12]。皂莢刺芽AM由體積較大且呈圓頂狀的CZ、體積較小且胞質(zhì)致密的PZ和沿軸向呈明顯縱向排列的RM所組成，PZ是器官原基發(fā)生的起點(diǎn)，不斷分化成新的鱗葉，且干細(xì)胞組織中心(OC)維護(hù)著CZ，RM在莖的伸長(zhǎng)過(guò)程中起作用[13]。

植物莖結(jié)構(gòu)分為表皮、皮層和維管柱3部分，而維管柱又分為維管束、髓和髓射線等部分，不同植物間莖初生結(jié)構(gòu)的組成結(jié)構(gòu)形狀存在著一定的差異，或各結(jié)構(gòu)所占大小存在差異。如薩如拉等[14]對(duì)2個(gè)苜蓿品種營(yíng)養(yǎng)器官解剖結(jié)構(gòu)特征研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)苜蓿品種的莖結(jié)構(gòu)組成相同，均為表皮、皮層、維管束、髓等部分組成，但與‘草原2號(hào)’雜花苜蓿相比，‘草原4號(hào)’紫花苜蓿莖部厚角組織增厚，韌皮部向兩側(cè)延伸，具有變窄現(xiàn)象。馬一鳴等[15]研究亞洲百里香、薄荷、黃芩、并頭黃芩等6種唇形科植物莖的解剖結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其莖均是四棱形，橫切面近長(zhǎng)方形，4個(gè)棱角處均有豐富的厚角組織，起著支持作用。本研究中，皂莢刺結(jié)構(gòu)呈橢圓形，在刺基本結(jié)構(gòu)形成時(shí)期，皂莢刺已經(jīng)分化表皮、皮層、韌皮部、木質(zhì)部、髓等結(jié)構(gòu)，且在木質(zhì)部中觀察到環(huán)紋導(dǎo)管，之后形成層向外形成韌皮部，向內(nèi)形成木質(zhì)部，此后莖結(jié)構(gòu)均持續(xù)生長(zhǎng)，其中木質(zhì)部生長(zhǎng)速度大于韌皮部，促進(jìn)皂莢刺的生長(zhǎng)。

綜上所述，本研究明確皂莢刺是由腋生分生組織發(fā)育而來(lái)，其發(fā)育過(guò)程與枝條的發(fā)育相似，皂莢刺芽分生組織由體積較大且呈圓頂狀的中央?yún)^(qū)母細(xì)胞區(qū)、體積較小且胞質(zhì)致密的周緣分生組織區(qū)和沿軸向呈明顯縱向排列的肋狀分生組織區(qū)所組成，同時(shí)將皂莢刺發(fā)育過(guò)程劃分為8個(gè)時(shí)期，本研究為皂莢的開(kāi)發(fā)利用與定向栽培提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。