單瓣與重瓣垂絲海棠花器官形態(tài)發(fā)育比較觀察

魏 景，彭 冶，楊立梅

(南京林業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境學(xué)院，南京 210037)

垂絲海棠(MalushallianaKoehne)為薔薇科(Rosaeeae)蘋(píng)果亞科(Maloideae)蘋(píng)果屬 (Malus)植物，是中國(guó)薔薇科特有的木本觀賞植物之一[1]。據(jù)《中國(guó)植物志》記載，垂絲海棠產(chǎn)于江蘇、浙江、安徽、陜西、四川、云南，多生于海拔50～1 200 m的山坡叢林中或山溪邊。因花梗細(xì)長(zhǎng)下垂，花色鮮艷，小花簇?fù)碛趥惴炕ㄐ?，垂絲海棠具有較高的觀賞價(jià)值，是重要的園藝品種及種質(zhì)資源，有重瓣、白花等變種[2]。1974年，《中國(guó)植物志》將其重瓣變種名稱作為垂絲海棠的異名；1985年，《中國(guó)樹(shù)木志》將其重瓣變種記載為重瓣垂絲海棠(Malushallianavar.parkmaniiRehd.)；至1996年，《中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書(shū)》將重瓣垂絲海棠作為栽培品種[3]。重瓣垂絲海棠花為半重瓣(8～14瓣)，其余特點(diǎn)與垂絲海棠相近[4]。

花瓣作為觀賞植物中最具觀賞價(jià)值的結(jié)構(gòu), 其數(shù)量和形狀的變化對(duì)花型的發(fā)展與進(jìn)化有著重要意義, 是決定觀花植物觀賞價(jià)值的重要因素之一[5]。相比單瓣品種，重瓣垂絲海棠因其重瓣的花朵具有更高的觀賞價(jià)值，且花重瓣屬于觀賞樹(shù)種的創(chuàng)新性狀[6]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)垂絲海棠的形態(tài)學(xué)，脅迫生理學(xué)[7]、生殖生物學(xué)研究逐漸豐富[8-9]，但對(duì)重瓣垂絲海棠的研究較少，對(duì)其重瓣性狀的研究更為匱乏。深入研究其花器官分化過(guò)程與花形態(tài)變異是進(jìn)一步探索重瓣性狀的基礎(chǔ)。

本研究主要觀察了重瓣垂絲海棠花形態(tài)及花器官分化過(guò)程，以積累有關(guān)重瓣垂絲海棠花器官研究的資料，并為進(jìn)一步研究垂絲海棠重瓣花形成原因和分子機(jī)制奠定形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料采自南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)樹(shù)齡大于40年且生長(zhǎng)健康的單、重瓣垂絲海棠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花器官分化觀察于7月底垂絲海棠花芽分化期，每隔3日分別從單瓣垂絲海棠和重瓣垂絲海棠取20個(gè)花芽固定保存于50% FAA固定液中，于Nikon SMZ18體式鏡下解剖觀察，直至花芽?jī)?nèi)頂花發(fā)育到萼片原基出現(xiàn)開(kāi)始拍照記錄直至花芽?jī)?nèi)頂花雌蕊原基分化結(jié)束。

將各時(shí)期解剖后的樣品進(jìn)行脫水干燥并置于EMITECH K850 臨界點(diǎn)干燥儀中用 CO2臨界法干燥，將干燥后的樣品粘于樣品臺(tái)上放置在HITACHI E-1010離子濺射儀中噴金鍍膜，最后用 OXFORD Inca X-act 能譜儀觀察拍照單瓣與重瓣垂絲海棠萼片原基分化期，花瓣原基分化期，雄蕊原基分化期以及雌蕊原基分化期4個(gè)時(shí)期。

1.2.2 花器官形態(tài)觀察于垂絲海棠3月份花期，對(duì)重瓣垂絲海棠盛開(kāi)花朵的花器官進(jìn)行觀察并記錄異常的花器官形態(tài)。另外，隨機(jī)采取重瓣垂絲海棠不同花序中的50朵大花蕾(氣球狀)于體視顯微鏡下進(jìn)行解剖觀察，并對(duì)其萼片、花瓣、雄蕊、花柱、瓣化中的雄蕊以及異?；ㄖ鶖?shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(蘋(píng)果屬植物的雌蕊多為3～5心皮復(fù)雌蕊，下位子房，花柱分離，因此，在統(tǒng)計(jì)心皮數(shù)時(shí)，以花柱數(shù)目代替心皮數(shù)目)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Excel(2016版)初步分析，再應(yīng)用R語(yǔ)言(4.0.3版)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花器官分化

單瓣垂絲海棠與重瓣垂絲海棠的花芽分化時(shí)期大致可分為花芽分化前期，花序原基分化期和花器官分化期。其中花器官分化期又可分為萼片原基分化期，花瓣原基分化期，雄蕊原基分化期以及雌蕊原基分化期4個(gè)時(shí)期[4]，各輪花器官按照向心的順序依次分化發(fā)育。其中，單、重瓣垂絲海棠在花序原基分化過(guò)程中均為頂花最早分化，周圍3～6朵小花分化階段一致，均較晚。

從六月上旬開(kāi)始，單、重瓣垂絲海棠均進(jìn)入花芽分化前期，直至十月中旬雌蕊分化完成，整個(gè)花芽分化期持續(xù)4個(gè)月。于八月上旬，單、重瓣垂絲海棠進(jìn)入萼片原基分化期，小花原基上著生出5個(gè)突起，三大兩小，為萼片原基(圖1，A；圖2，A)。九月中上旬垂絲海棠進(jìn)入花瓣原基分化期，在單瓣垂絲海棠花芽?jī)?nèi)的頂花中，5枚圓形凸起的原基均起生于外輪萼片交匯處的內(nèi)部，為花瓣原基(圖1，B)；而重瓣垂絲海棠每個(gè)花芽中的頂花內(nèi)第一輪起生的5至7枚花瓣原基在萼片內(nèi)部不均勻分布，在第一輪花瓣原基內(nèi)部同時(shí)或相錯(cuò)極短時(shí)間分化出7至10個(gè)突起為第二輪花瓣原基(圖2，B)。與葉原基發(fā)育模式相同，萼片原基與花瓣原基是由小花原基表面的幾層細(xì)胞分裂形成最初的圓形凸起，接著向長(zhǎng)、寬、厚三個(gè)方向生長(zhǎng)，但各方向生長(zhǎng)速率不同且厚度生長(zhǎng)開(kāi)始與停止均較早，使其進(jìn)行扁平生長(zhǎng)[10]。九月下旬，花瓣原基內(nèi)部分化出2至3輪等大的圓形突起為雄蕊原基，單、重瓣垂絲海棠進(jìn)入雄蕊原基分化期(圖1，C；圖2，C)。直至十月末，雌蕊原基在杯型花托最底部分化發(fā)育(圖1，D；圖2，D)。其中，雄蕊原基與雌蕊原基起初發(fā)育模式相同，其寬度生長(zhǎng)與厚度生長(zhǎng)停止較早，雌雄蕊均進(jìn)行伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。

A.萼片原基(SeP)分化期；B.花瓣原基(PeP)分化期；C.雄蕊原基(SP)分化期；D.雌蕊原基(PP)分化期圖1 單瓣垂絲海棠花器官分化A. Sepal primordium (SeP) differentiation stage; B. Petal primordium (PeP) differentiation stage; C. Stamen primordium (SP) differentiation stage; D. Pistil primordium (PP) differentiation stageFig.1 Differentiation of floral organs in Malus halliana

A.萼片原基(SeP)分化期；B.花瓣原基(PeP)分化期；C.雄蕊原基(SP)分化期；D.雌蕊原基(PP)分化期圖2 重瓣垂絲海棠花器官分化A. Sepal primordium (SeP) differentiation stage; B. Petal primordium (PeP) differentiation stage; C. Stamen primordium (SP) differentiation stage; D. Pistil primordium (PP) differentiation stageFig.2 Differentiation of floral organs in M. halliana var. parkmanii

總體而言，萼片原基出現(xiàn)到花瓣原基出現(xiàn)間隔30日左右；雄蕊原基出現(xiàn)到雌蕊原基出現(xiàn)同樣間隔30日左右；而花瓣原基分化期與雄蕊原基分化期的間隔較短，僅相隔8日左右。

2.2 花器官形態(tài)多樣性

重瓣垂絲海棠的花包含單輪排列的萼片(5枚)， 2至多輪花瓣(多為11～13枚)，25～35 枚雄蕊，花柱0～5枚不等[11]。通過(guò)對(duì)南京林業(yè)大學(xué)重瓣垂絲海棠盛開(kāi)花的系統(tǒng)觀察發(fā)現(xiàn)，相比單瓣垂絲海棠，重瓣垂絲海棠不僅在其花瓣數(shù)目上存在巨大差異，在少數(shù)萼片中也存在數(shù)目與形態(tài)的異常(圖3，B～D)，雄蕊瓣化較為常見(jiàn)(圖3，F(xiàn)～H)，花藥出現(xiàn)畸形發(fā)育(圖3，J～L)，花柱數(shù)目0～5枚不等且存在形態(tài)異常(圖3，N～P)。其中，圖3A、E、I、M為單、重瓣垂絲海棠正常形態(tài)的各輪花器官。

而對(duì)50朵重瓣垂絲海棠大蕾期花蕾的解剖發(fā)現(xiàn)，所解剖的重瓣垂絲海棠大蕾期的萼片數(shù)目均為5，其中3枚較大的萼片后期生長(zhǎng)速度緩慢，2枚較小的萼片生長(zhǎng)速度增加，5枚萼片隨時(shí)間推移生長(zhǎng)至等大。在大蕾期的花蕾與盛開(kāi)的花中，雄蕊瓣化的情況較為常見(jiàn)，不同之處在于大蕾期中的雄蕊瓣化多數(shù)處于初期(仍可見(jiàn)未瓣化的花藥部分)，而盛開(kāi)的花中的雄蕊瓣化多數(shù)處于末期(花藥已完全瓣化為花瓣)；在大蕾期的雄蕊群中也發(fā)現(xiàn)較多形態(tài)異常，如部分雄蕊的花粉囊呈現(xiàn)萎縮狀態(tài)。除此之外，在重瓣垂絲海棠中還觀察到萼片瓣化存在兩種形式，一種是從萼片的一側(cè)橫向逐漸演變?yōu)榛ò?圖3，C)，另一種則是從頂端開(kāi)始縱向演變?yōu)榛ò?圖3，D)；同樣，雄蕊瓣化在重瓣垂絲海棠中也出現(xiàn)兩種形式，一種是從花藥的一側(cè)出現(xiàn)淡紅色(圖3，F(xiàn))，逐漸變化為薄片狀花瓣，另一種是從花藥頂端開(kāi)始變化(圖3，H)。在大蕾期花柱還未完全伸長(zhǎng)生長(zhǎng)時(shí)，觀察到部分花柱分出細(xì)枝，在花柱的中部或中下部斜生出另一支短小的花柱。正常雌蕊花柱為紅色，雄蕊花絲為白色，而在重瓣垂絲海棠的雄蕊群與雌蕊群間的過(guò)渡區(qū)出現(xiàn)紅色花絲的花藥，其形態(tài)與空間位置均處于雄蕊群與雌蕊群之間(圖3，J)。總體而言，重瓣垂絲海棠的花部結(jié)構(gòu)從外至內(nèi)由一輪萼片、2輪分布不均勻的花瓣、1輪直立伸長(zhǎng)的雄蕊、1輪彎曲且未完全伸長(zhǎng)的雄蕊、1輪花柱組成。

2.3 花器官數(shù)目相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)重瓣垂絲海棠的萼片、花瓣、雄蕊、花柱、瓣化中的雄蕊以及異常形態(tài)的花柱數(shù)目，并利用R語(yǔ)言對(duì)以上6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。圖4為重瓣垂絲海棠各輪花器官數(shù)目間的相關(guān)系數(shù)矩陣圖，其主對(duì)角線為各個(gè)指標(biāo)的直方圖；主對(duì)角線下方為各指標(biāo)間的相關(guān)性散點(diǎn)圖；主對(duì)角線上方為各指標(biāo)間的 Spearman相關(guān)系數(shù)，其相關(guān)性系數(shù)越大，則相關(guān)性越強(qiáng)。該圖結(jié)果顯示，在重瓣垂絲海棠大蕾期的各輪花器官中，萼片數(shù)目與其余各輪花器官數(shù)目之間并無(wú)相關(guān)性，始終保持在5的水平上；而花瓣數(shù)目與雄蕊以及瓣化中的雄蕊數(shù)目相關(guān)性系數(shù)分別為0.54、0.43，具明顯的正相關(guān)性，即雄蕊與瓣化中雄蕊數(shù)目越多，其花瓣的數(shù)目也相應(yīng)較多?；ㄖ鶖?shù)目與異常的花柱數(shù)目之間的相關(guān)性系數(shù)為0.48，也具有一定的正相關(guān)性，其余花器官之間的相關(guān)性并不顯著。

Se. 萼片數(shù)目；Pe. 花瓣數(shù)目；S. 雄蕊數(shù)目；St. 花柱數(shù)目；SPe. 雄蕊瓣化數(shù)目；ASt. 異?；ㄖ鶖?shù)目；主對(duì)角線為各指標(biāo)的直方圖；主對(duì)角線左下方為各指標(biāo)間的相關(guān)性散點(diǎn)圖；主對(duì)角線右上方為各指標(biāo)間的 Spearman相關(guān)系數(shù)其相關(guān)性系數(shù)越大，則相關(guān)性越強(qiáng)。**代表有顯著差異(P<0.01), ***代表有極顯著差異(P<0.001)圖4 重瓣垂絲海棠各輪花器官數(shù)目間相關(guān)性分析Se. Sepal number; Pe. Petal number; S. Stamen number; St. Style number; SPe. Stamen Petalody number; ASt. Abnormal Style number; The main diagonal is the histogram of each indicator; the lower left of the main diagonal is the scatter plot of the correlation between the indicators; the upper right of the main diagonal is the Spearman coefficient between the indicators. The larger the correlation coefficient, the stronger the correlation. ** indicate significant difference (P<0.001); *** indicate extremely significant difference (P<0.001)Fig.4 Correlation analysis of the number of floral organs in each round of M. halliana var. parkmanii

3 討 論

3.1 單、重瓣垂絲海棠花器官發(fā)育比較

觀賞海棠不僅是蘋(píng)果的優(yōu)良砧木，也是景觀園林中重要的風(fēng)景線[12]，前人對(duì)垂絲海棠及其變種重瓣垂絲海棠的形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)與生殖生物學(xué)研究已較為透徹[4,11]，但對(duì)重瓣垂絲海棠的花器官特點(diǎn)未有深入研究。花起生于花分生組織，由同心輪生的花器官原基分化發(fā)育為外圍的花被以及中心的生殖器官，花被分為第一輪的萼片與第二輪的花瓣，雄蕊在花瓣內(nèi)部的第三輪發(fā)育，心皮在第四輪發(fā)育[13]，單瓣垂絲海棠與重瓣垂絲海棠均遵循這個(gè)規(guī)律。

據(jù)文獻(xiàn)記載，垂絲海棠為傘房花序[14]，開(kāi)花順序應(yīng)由外至內(nèi)。本研究通過(guò)對(duì)單、重瓣垂絲海棠的花芽分化期、大蕾期花朵與盛開(kāi)的花朵系統(tǒng)觀察，發(fā)現(xiàn)其每個(gè)花序中大多包含4～7枚小花且頂花最先分化并綻放，這與傳統(tǒng)的描述不同。就花芽分化過(guò)程而言，除在花瓣原基分化期時(shí)單、重瓣垂絲海棠的花瓣數(shù)量與位置存在差異，其余階段特點(diǎn)大致相同。其中單瓣垂絲海棠在花瓣原基分化時(shí)，兩片萼片之間分化出5個(gè)均勻分布的花瓣原基；而重瓣垂絲海棠在花瓣原基分化期中，萼片原基內(nèi)部分化出兩輪花瓣原基，第一輪的5～6枚花瓣原基大小相同，但位置分布不均勻，第二輪花瓣原基相比于第一輪花瓣原基體積相近或較小，排列在第一輪花瓣原基的內(nèi)下方。與薔薇屬植物相似，單瓣垂絲海棠萼片、花瓣等大對(duì)稱，且數(shù)目穩(wěn)定，而重瓣垂絲海棠的花瓣位置分布不規(guī)則，數(shù)目也無(wú)規(guī)律可循[15]。

花瓣原基分化期后數(shù)天，在花瓣原基的內(nèi)側(cè)陸續(xù)分化出雄蕊原基，雄蕊原基與花瓣原基不僅在時(shí)間距離上較短，在空間上的距離也更為相近。在重瓣垂絲海棠的花蕾中，雄蕊與花瓣的關(guān)系則更為密切，可觀察到由雄蕊到花瓣變異的不同階段。與羅敏蓉對(duì)天葵花花器官發(fā)生的研究結(jié)果相似，垂絲海棠的花瓣原基與萼片原基形狀差異較大，且存在較長(zhǎng)的發(fā)生時(shí)間間隔；但花瓣原基與雄蕊原基形狀相似，且相隔較短時(shí)間發(fā)生，該現(xiàn)象也暗示了重瓣垂絲海棠的花瓣雄蕊起源[16]。

3.2 垂絲海棠重瓣花成花原因推測(cè)

觀賞植物重瓣的起源大致包括積累起源、苞片起源、雌雄蕊起源、臺(tái)閣起源、重復(fù)起源和花序起源6種方式[17]。在同一種植物中也可能同時(shí)存在多種起源方式，如朱高浦在山茶花的重瓣化研究中發(fā)現(xiàn)山茶花同時(shí)存在積累起源，苞片起源，雌雄蕊起源[18]。其中，積累起源學(xué)說(shuō)認(rèn)為原種的單瓣花花瓣數(shù)量一般是固定的, 起初花瓣的變化數(shù)目較小，后來(lái)在自然選擇或人工選擇的作用下, 經(jīng)過(guò)若干代后使花瓣數(shù)目逐漸增多。苞片起源與雌雄蕊起源均由于萼片與雌雄蕊在發(fā)育過(guò)程中逐漸演變?yōu)榛ò辍?/p>

在重瓣垂絲海棠盛開(kāi)的花的觀察中，萼片與雄蕊在數(shù)量以及形態(tài)上出現(xiàn)差異，即萼片數(shù)目增多或逐漸演變出花瓣特征，雄蕊的瓣化在大蕾期中也存在。其中，雄蕊分為兩輪相錯(cuò)排列在花瓣的內(nèi)側(cè)，雄蕊瓣化的情況通常僅出現(xiàn)在外輪雄蕊中，屬于雄蕊的向心式瓣化。因此，結(jié)合重瓣垂絲海棠花芽分化階段的形態(tài)學(xué)特征，可推斷重瓣垂絲海棠的重瓣起源包含苞片起源與雄蕊起源。

雌雄蕊起源是由雄蕊或雌蕊變瓣，通過(guò)雌雄蕊數(shù)目減少以增加花瓣的數(shù)目[19]，但從50朵大花蕾解剖的數(shù)據(jù)分析角度看，其花瓣數(shù)目與雄蕊數(shù)目和瓣化中的雄蕊數(shù)目存在正相關(guān)性，即花瓣的數(shù)目增多不完全依賴于雄蕊數(shù)目的減少，相反，花瓣數(shù)目較多的花朵中，其雄蕊數(shù)目也較多。在熊陽(yáng)陽(yáng)等對(duì)大花鐵線蓮花芽分化研究中發(fā)現(xiàn)大花鐵線蓮的重瓣起源僅涉及雌雄蕊起源，其花瓣的增多伴隨著雌雄蕊由外向內(nèi)的減少與退化[20]；而孫明偉對(duì)百合的重瓣化研究中表明，百合的花器官變異包含花瓣褶皺面積變大、花器官的二次發(fā)育、雄蕊瓣化、花瓣與雄蕊的累積重復(fù)出現(xiàn)以及苞片瓣化等現(xiàn)象，其重瓣起源涉及積累起源與雌雄蕊瓣化起源，其中‘Siberia’品種的花被片數(shù)目與雄蕊數(shù)目同時(shí)增加，而‘Sornonne’品種的花被片數(shù)目與雄蕊數(shù)目減少[21-22]。結(jié)合重瓣垂絲海棠花瓣原基分化期時(shí)在第一輪花瓣原基內(nèi)側(cè)相繼分化第二輪花瓣原基的情況可推測(cè)，重瓣垂絲海棠的重瓣化原因不僅涉及苞片與雌雄蕊起源，亦同時(shí)存在積累起源。

研究植物重瓣花成花的原因，必然會(huì)涉及到花發(fā)育與花器官發(fā)育的相關(guān)研究，其中研究最多的為ABCDE花發(fā)育模型相關(guān)基因和MADS-box基因家族[23]。雖然，現(xiàn)階段的形態(tài)學(xué)證據(jù)可證明重瓣垂絲海棠的重瓣化起源為積累起源，苞片起源以及雌雄蕊起源，但其重瓣化起源存在多元化與復(fù)雜化的特點(diǎn)，需要展開(kāi)更為深入的形態(tài)學(xué)研究，并結(jié)合重瓣垂絲海棠花器官分化過(guò)程的基因調(diào)控及表達(dá)特點(diǎn)等分子生物學(xué)方面的證據(jù)才可能獲得科學(xué)的解釋。