貯藏期柚?；^程中果實總細胞壁物質積累和維管束超微結構的變化

盧艷清，林燕金，盧新坤

(福建省農業(yè)科學院 果樹研究所，福州 350000)

柑橘類果實?；鞘澜绺涕佼a業(yè)中存在的一類生理失調病害，主要表現為汁胞硬度增加，食用品質降低。許多柑橘類果實均存在汁胞粒化現象，例如，橙(CitrussinensisL. Osbeck)、橘(CitrusreticulataBlanco)、葡萄柚(CitrusparadisiMacf.)[1]。據報道，臍橙果實?；食^80%[2]，寬皮柑橘果實?；蔬_到62.5%[3]。

在柑橘類果實?；^程中汁胞生理代謝的變化得到廣泛關注。現已證明柑橘類果實粒化汁胞中木質素、纖維素、半纖維素和果膠含量提高[4-5]，汁胞?；膶嵸|是次生細胞壁的加厚[6-7]。目前發(fā)現了一些與汁胞?；嚓P的酶?！g溪蜜柚’(CitrusgrandisL. Osbeck)汁胞苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂醇脫氫酶(CAD)和過氧化物酶(POD)活性提高伴隨著汁胞木質素含量和?；笖档纳遊8]。HRB(柑橘三倍體株系)果實汁胞細胞壁木質化，細胞壁明顯加厚，而汁胞過氧化物酶(POD)活性和肉桂酸-4-羥化酶(C4H)基因轉錄水平均顯著提高[9]。PAL[10]、CAD[11]、POD[12]和C4H[13]均是木質素合成途徑中的酶。另外，‘琯溪蜜柚’汁胞果膠甲酯酶(PE)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)和纖維素酶(Cx)活性低,伴隨著細胞壁物質(原果膠、纖維素、半纖維素)含量的提高[14]。PE[15]、PG[16]和Cx[17]均為細胞壁降解酶類。從而可見，?；屑毎谖镔|代謝途徑受到明顯影響，從而引起細胞壁物質含量的變化。最近，從甜橙中發(fā)現幾個能夠調控汁胞木質素積累的MYB轉錄因子。甜橙CsMYB330(轉錄激活子)和CsMYB308(轉錄抑制子)能夠與4-香豆酸∶輔酶A連接酶基因(Cs4CL1)啟動子的AC 元件結合，調控Cs4CL1 的表達[18]。之后發(fā)現CsMYB85與CsMYB330 啟動子結合，調控CsMYB330 的表達；CsMYB85過量表達時汁胞Cs4CL1表達量和木質素含量均顯著提高[19]。以上研究揭示了?；屑毎谖镔|含量提高的原因。

然而除汁胞外，柑橘類果實?；^程中果皮的生理代謝也產生變化?！疁刂菝鄹獭?CitrusunshiuMarc.)果皮超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性低引發(fā)果實?；痆20]。另外，在?；摹S果柑’(CitrusreticulataBlanco ×CitrussinensisL. Osbeck)果皮中發(fā)現果膠、可溶性果膠、纖維素、木質素含量提高[21]。表明果皮生理代謝的變化與汁胞?；嚓P。

柑橘類果實主要包括果實維管束、果皮、囊衣和汁胞幾個部分。每個汁胞都通過或長或短的柔軟絲柄著生于果實維管束，而維管束在囊衣和果皮中均有分布?；诟涕兕惞麑嵉慕Y構特征和已有報道，在果實?；M程中協同觀測不同果實組織間生理代謝的改變可能更有利于?；瘷C理的揭示。目前，在果實?；^程中果實維管束和囊衣是否也出現明顯的生理代謝變化，以及汁胞和汁胞以外的果實組織各自生理代謝產生明顯變化的時間順序尚不明晰。

本試驗以室溫貯藏的成熟‘琯溪蜜柚’為材料，將果實分為6個部分：背面維管束、側面維管束、果皮、囊衣、背面維管束汁胞和側面維管束汁胞。主要通過測定背面維管束汁胞、側面維管束汁胞、囊衣和果皮總細胞壁物質含量，以及觀察果實背面維管束和側面維管束超微結構的變化趨勢，揭示柚汁胞?；^程中不同果實組織是否均存在細胞壁物質積累現象及其積累順序，為深入揭示柑橘類果實汁胞?；瘷C理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

‘琯溪蜜柚’成熟期果實于2016年10月30日取自福建省平和縣小溪鎮(zhèn)商品果園，選擇10株樹勢較為一致的樹，從樹冠外圍中部取15個果實，共150個。果實放置于實驗室內，自然溫度條件下(無控溫處理)貯藏60 d。設3個生物學重復，每個重復50個果實。在每個取樣時期從每個重復選取3個果實，共取9個果實。將每個果實每個囊瓣的背面維管束汁胞和側面維管束汁胞分別取下，之后將每個生物學重復的兩類汁胞分別混合均勻。將每個果實的每個囊瓣外圍的囊衣取下，之后將每個生物學重復的囊衣切成小塊混合均勻。同樣，將每個生物學重復的果皮切成小塊后混合均勻。在60 d貯藏期內，每隔5 d取背面維管束汁胞和側面維管束汁胞(圖1)，用于測定可溶性固形物含量。將貯藏0、10、20、30、40、50和60 d果實的背面維管束汁胞、側面維管束汁胞、囊衣和果皮保存于-80 ℃冰箱，用于測定總細胞壁物質含量。將0、10、20、40和60 d果實背面維管束和側面維管束切成2～3 mm長的小段，立即浸于3.5%戊二醛固定液[戊二醛溶于0.2%的磷酸緩沖液(pH 7.2)]中，4 ℃固定2 d，用于制作透射電子顯微鏡超薄切片。

1標示為背面維管束汁胞，2標示為側面維管束汁胞[10]圖1 琯溪蜜柚果實2類汁胞的分類The region marked by 1 indicates juice sacs isolated from the dorsal vascular bundles, the region marked by 2 indicates juice sacs isolated from the septal vascular bundles[10]Fig.1 Illustration of two types of juice sacs of ‘Guanxi’ pummelo fruit

1.2 總細胞壁物質含量的測定

總細胞壁物質含量的測定參照Ookawa等[11]的方法。稱取液氮研磨的果實樣品3 g置10 mL離心管，加80%乙醇6 mL，80 ℃水浴浸提30 min，在15 000 g、4 ℃條件下離心10 min，棄上清液。向沉淀中加6 mL 80%乙醇，重復浸提2次。之后向沉淀中加80%甲醇6 mL，室溫放置30 min，相同條件下離心棄上清液，沉淀重復浸提2次。最后向沉淀中加正己烷6 mL，室溫放置30 min，相同條件下離心棄上清液，沉淀重復浸提2次。從而去除樣品的糖、脂質、色素物質。在80 ℃條件下將沉淀烘至恒重，記錄沉淀總重量(W1)。

稱取烘干的沉淀20 mg(W2)置2 mL離心管，加15 U·mL-1的α-淀粉酶(芽孢桿菌)溶液1 mL，在85 ℃條件下放置30 min，以使淀粉降解，在15 000 g、4 ℃條件下離心10 min，棄上清液。加1.5 mL去離子水清洗沉淀，重復清洗1次。在80 ℃條件下將沉淀烘至恒重，記錄沉淀重量(W3)。總細胞壁物質含量(mg·g-1)=W3×(W1/W2)/樣品鮮重。

1.3 可溶性固形物含量的測定

用手持測糖儀測定汁胞可溶性固形物含量。

1.4 透射電子顯微鏡超薄切片的制作和觀察

用0.2%磷酸緩沖液洗戊二醛溶液固定的樣品15 min，重復沖洗2次。樣品轉至含1%鋨酸和1.5%亞鐵氰化鉀溶液，4 ℃后固定1.5 h。用0.2%磷酸緩沖液沖洗樣品15 min，重復沖洗4次。樣品放于乙醇和丙酮梯度溶液脫水：50%乙醇15 min，70%乙醇過夜，90%乙醇15 min，90%乙醇和丙酮(V/V，1∶1)混合溶液15 min，90%丙酮溶液15 min，無水丙酮15 min。脫水樣品放于無水丙酮和環(huán)氧樹脂618(V/V, 1∶1)混合物中滲透1.5 h，之后在35 ℃ 條件下，放于純環(huán)氧樹脂618中3 h。最后用純環(huán)氧樹脂618包埋樣品：35 ℃聚合12 h，45 ℃保持12 h，60 ℃保持2～3 h。用超薄切片機(Leica EMUC7，韋茨拉爾，德國)切取厚度為90 nm的切片。切片用2%乙酸雙氧鈾染色20 min，檸檬酸鉛染色3 min。應用透射電子顯微鏡(Hitachi HT7700，東京，日本)觀察細胞超微結構(80 kV條件下)。

2 結果與分析

2.1 柚果實不同組織總細胞壁物質含量的變化趨勢

在整個貯藏期內背面維管束汁胞總細胞壁物質含量無顯著變化。然而從貯藏40至60 d，側面維管束汁胞總細胞壁物質含量顯著升高。囊衣和果皮總細胞壁物質含量的變化趨勢相同，均從貯藏20至60 d顯著提高(圖2)。

小寫字母表示不同貯藏時期之間的差異(P<0.05)圖2 貯藏期琯溪蜜柚果實組織總細胞壁物質含量The normal letters represent the differences among stages (P <0.05)Fig.2 Total cell wall material contents of fruit segments of ‘Guanxi’ pummelo fruits during storage

通過對每個貯藏階段不同組織間總細胞壁物質含量的比較發(fā)現，至貯藏30 d時，兩類汁胞總細胞壁物質含量無顯著差異，然而在貯藏40和60 d時，側面維管束汁胞總細胞壁物質含量顯著高于背面維管束(貯藏50 d時顯著差異暫時消失)；在整個貯藏期內，盡管果皮總細胞壁物質含量始終顯著高于兩類汁胞，但始終顯著低于囊衣。

2.2 柚果實汁胞可溶性固形物含量的變化趨勢

圖3顯示，在貯藏期內背面維管束汁胞可溶性固形物含量始終無顯著變化，而側面維管束汁胞可溶性固形物含量從貯藏40至60 d持續(xù)顯著降低。至貯藏35 d時，背面維管束汁胞可溶性固形物含量顯著低于側面維管束汁胞(20 d除外)，但之后與側面維管束汁胞間無明顯差異。

小寫字母表示不同貯藏時期之間的差異顯著(P <0.05)，*表示同一時期兩類汁胞之間的差異顯著(P <0.05)圖3 貯藏期琯溪蜜柚果實背面維管束汁胞和側面維管束汁胞可溶性固形物含量The normal letters represent the differences among stages (P<0.05). Asterisks represent the significant differences between the two types of juice sacs at each stage (P<0.05)Fig.3 Soluble solid contents of juice sacs isolated from the dorsal and the septal vascular bundles of ‘Guanxi’ pummelo fruits during storage

2.3 柚果實背面維管束和側面維管束超微結構變化

2.3.1 柚果實維管束篩管-伴胞復合體、韌皮部薄壁細胞和導管的分布柚果實背面維管束的導管位于中部，篩管-伴胞復合體和韌皮部薄壁細胞分布在導管兩側(圖4，A)；側面維管束三類細胞分布模式與背面維管束相同(圖4，B)。不同的是背面維管束導管明顯大于側面維管束。

Se-Cc. 篩管-伴胞復合體；P. 韌皮部薄壁細胞區(qū)域；V. 導管區(qū)域圖4 琯溪蜜柚果實背面維管束(A)和側面維管束(B)的篩管-伴胞復合體、韌皮部薄壁細胞和導管的分布Se-Cc. Sieve tube-companion cell complexes; P. Phloem parenchyma cells; V. VesselsFig.4 Distribution pattern of the sieve tube-companion cell complexes, phloem parenchyma cells, and vessels in the dorsal (A) and the septal (B) vascular bundles of ‘Guanxi’ pummelo fruits

2.3.2 柚果實維管束篩管和伴胞的次生細胞壁加厚過程在貯藏始期，柚果實背面維管束和側面維管束篩管和伴胞的結構特征類似。伴胞的細胞質濃縮，沿細胞壁分布。篩管和伴胞內部空間分布著濃密的細胞壁物質，篩管細胞壁內側次生細胞壁沉積，形成蘑菇狀突起(圖5)。貯藏10 d，柚果實兩類維管束篩管內部空間細胞壁物質減少，但次生細胞壁明顯加厚；伴胞細胞壁內側也觀察到明顯的次生細胞壁，但內部空間仍分布著大量的細胞壁物質(圖6)。貯藏20 d，在兩類維管束篩管-伴胞區(qū)域出現不規(guī)則形狀的黑色聚集物，主要分布在細胞壁部位(圖7，a、d、c、f)。同時觀察到篩管次生細胞壁沿著初生細胞壁延展，且趨于合攏(圖7，a、d)，但染色深度比貯藏10 d時明顯變淺(圖7，b、e)。此期兩類維管束伴胞結構特征與貯藏10 d時類似(圖7，c、f)。貯藏40 d，背面維管束篩管-伴胞區(qū)域的不規(guī)則形狀黑色聚集物已消失，但在側面維管束篩管-伴胞區(qū)域仍可觀察到此類物質，且其外形比貯藏20 d時增長，不僅分布在細胞壁區(qū)域，也延展至細胞內部空間(圖8，a、c)。同時觀察到背面維管束篩管和伴胞次生細胞壁染色深度重于側面維管束(圖8，b、f)。由于兩類維管束篩管次生細胞壁的沉積和擴展，導致紋孔的形成，紋孔室由紋孔膜(圖8，d、h)隔開。

a. 背面維管束篩管和伴胞；b、c. 圖a中矩形框標注部位的放大圖；d. 側面維管束篩管和伴胞；e、f. 圖d矩形框標注部位的放大圖；Se. 篩管；Cc. 伴胞；Scw. 次生細胞壁；Cp. 細胞質圖5 貯藏0 d時琯溪蜜柚果實背面維管束(a-c)和側面維管束(d-f)的篩管和伴胞a. Sieve tube and companion cells of the dorsal vascular bundle; b and c. Magnified micrographs of the regions marked by rectangles in a; d. Sieve tube and companion cells of the septal vascular bundle; e and f. Magnified micrographs of the regions marked by rectangles in d; Se. Sieve tube cell; Cc. Companion cell; Scw. Secondary cell wall; Cp. CytoplasmFig.5 Sieve tube and companion cells of the dorsal (a-c) and the septal (d-f) vascular bundles of ‘Guanxi’ pummelo fruits at 0 day of storage

a. 背面維管束篩管和伴胞；b、c. 圖a矩形框標注區(qū)域的放大圖；d. 側面維管束篩管和伴胞；e、f. 圖d矩形框標注區(qū)域的放大圖；Se. 篩管；Cc. 伴胞；Scw. 次生細胞壁圖6 貯藏10 d時琯溪蜜柚果實背面維管束(a-c)和側面維管束(d-f)的篩管和伴胞a. Sieve tube and companion cells of the dorsal vascular bundle; b and c. Magnified micrographs of the regions marked by rectangles in a; d. Sieve tube and companion cells of the septal vascular bundle; e and f. Magnified micrographs of the regions marked by rectangles in d; Se. Sieve tube cell; Cc. Companion cell; Scw. Secondary cell wallFig.6 Sieve tube and companion cells of the dorsal (a-c) and the septal (d-f) vascular bundles of ‘Guanxi’ pummelo fruits at 10 days of storage

a. 背面維管束篩管和伴胞；b、c. 圖a矩形框標注區(qū)域的放大圖；d. 側面維管束篩管和伴胞；e、f. 圖d矩形框標注區(qū)域的放大圖；Se. 篩管；Cc. 伴胞；Scw. 次生細胞壁；Uscw. 即將封閉的次生細胞壁；St. 不規(guī)則形狀黑色聚集物圖7 貯藏20 d時琯溪蜜柚果實背面維管束(a-c)和側面維管(d-f)束的篩管和伴胞a. Sieve tube and companion cells of the dorsal vascular bundle; b and c. Magnified micrographs of the regions marked by rectangles in a; d. Sieve tube and companion cells of the septal vascular bundle; e and f. Magnified micrographs of the regions marked by rectangles in d; Se. Sieve tube cell; Cc. Companion cell; Scw. Secondary cell wall; Uscw. Primary cell wall is almost fully covered by secondary cell wall; St. Black aggregation with irregular shapeFig.7 Sieve tube and companion cells of the dorsal (a-c) and the septal (d-f) vascular bundles of ‘Guanxi’ pummelo fruits at 20 days of storage

a. 背面維管束篩管和伴胞；b. 圖a矩形框標注區(qū)域的放大圖；c. 背面維管束中次生細胞壁早期加厚的篩管；d. 篩管次生細胞壁的加厚引起紋孔的形成(圖c矩形框標注區(qū)域的放大圖)；e. 側面維管束篩管和伴胞；f. 圖e矩形框標注區(qū)域的放大圖；g. 側面維管束中次生細胞壁早期加厚的篩管；h. 篩管次生細胞壁加厚引起紋孔的形成(圖g矩形框標注區(qū)域的放大圖)；Se. 篩管；Cc. 伴胞；Scw. 次生細胞壁；St. 不規(guī)則形狀黑色聚集物；1. 紋孔室；2. 紋孔膜圖8 貯藏40 d時琯溪蜜柚果實背面維管束(a-d)和側面維管束(e-h)的篩管和伴胞a. Sieve tube and companion cells of the dorsal vascular bundle; b. Magnified micrograph of the region marked by rectangle in a; c. Earlier secondary thickened sieve tube cells of the dorsal vascular bundle; d. Secondary cell wall thickening leads to pit formation in sieve tube cell (magnified micrograph of the region marked by rectangle in c); e. Sieve tube and companion cells of the septal vascular bundle; f. Magnified micrograph of the region marked by rectangle in e; g. Earlier secondary thickened sieve tube cells of the septal vascular bundle; h. Secondary cell wall thickening leads to pit formation in sieve tube cell (magnified micrograph of the region marked by rectangle in g); Se. Sieve tube cell; Cc. Companion cell; Scw. Secondary cell wall; St. Black aggregation with irregular shape; 1. Pit chamber; 2. Pit membraneFig.8 Sieve tube and companion cells of the dorsal (a-d) and the septal (e-h) vascular bundles of ‘Guanxi’ pummelo fruits at 40 days of storage

貯藏期結束時，側面維管束篩管-伴胞區(qū)域的不規(guī)則形狀黑色聚集物消失(圖9，e)。兩類維管束篩管次生細胞壁明顯加厚(圖9，b、d、f、h)。與貯藏40 d相比，紋孔膜表面沉積了更多的細胞壁物質(圖9，d、h)。兩類維管束伴胞內部空間仍然分布著細胞壁物質(圖9，a、e)。

a. 背面維管束篩管和伴胞；b. 圖a矩形框標注區(qū)域的放大圖；c. 背面維管束中次生細胞壁早期加厚的篩管；d. 篩管次生細胞壁加厚引起紋孔的形成(圖c矩形框標注區(qū)域的放大圖)；e. 側面維管束篩管和伴胞；f. 圖e矩形框標注區(qū)域的放大圖；g. 側面維管束中次生細胞壁早期加厚的篩管；h. 篩管次生細胞壁加厚引起紋孔的形成(圖g矩形框標注區(qū)域的放大圖)；Se. 篩管； Cc. 伴胞；Scw. 次生細胞壁；1. 紋孔室；2. 紋孔膜圖9 貯藏60 d時琯溪蜜柚果實背面維管束(a-d)和側面維管束(e-h)的篩管和伴胞a. Sieve tube and companion cells of the dorsal vascular bundle; b. Magnified micrograph of the region marked by rectangle in a; c. Earlier secondary thickened sieve tube cells of the dorsal vascular bundle; d. Secondary cell wall thickening leads to pit formation in sieve tube cell (magnified micrograph of the region marked by rectangle in c)； e. Sieve tube and companion cells of the septal vascular bundle; f. Magnified micrograph of the region marked by rectangle in e; g. Earlier secondary thickened sieve tube cells of the septal vascular bundles; h. Secondary cell wall thickening leads to pit formation in sieve tube cell (magnified micrograph of the region marked by rectangle in g); Se. Sieve tube cell; Cc. Companion cell; Scw. Secondary cell wall; 1. Pit chamber; 2. Pit membraneFig.9 Sieve tube and companion cells of the dorsal (a-d) and the septal (e-h) vascular bundles of ‘Guanxi’ pummelo fruits at 60 days of storage

2.3.3 柚果實維管束韌皮部薄壁細胞次生細胞壁的加厚過程貯藏始期，兩類維管束韌皮部薄壁細胞均出現質壁分離現象(圖10，a、c)。不僅細胞內部空間分布著細胞壁物質(背面維管束主要是成片的絮狀物，側面維管束除了絮狀物外，還分散著纖維絲)，而且在細胞壁內側已有次生細胞壁的沉積(圖10，b、d)。貯藏10 d，兩類維管束韌皮部薄壁細胞均呈現多類結構特征。背面維管束韌皮部薄壁細胞在質壁分離的同時，出現囊泡和線粒體，同時有大量細胞壁物質分散在細胞壁內部空間(圖11，a、b)。另有細胞囊泡增多，細胞潰散(圖11，c、d)。最后囊泡和細胞器消失殆盡，細胞內積累大量的細胞壁物質(圖11，e、f)。側面維管束韌皮部薄壁細胞的囊泡和線粒體緊貼細胞壁分布，中央分布著一個大液泡(圖11，g、h)。另有細胞質壁分離，細胞質膜局部斷裂，中央液泡消失，出現一些小囊泡和線粒體(圖11，i、j)。最后細胞潰散，僅剩少量囊泡，細胞壁物質均勻地分布在細胞內部空間(圖11，k、l)。兩類維管束韌皮部薄壁細胞次生細胞壁均明顯加厚。貯藏20 d，兩類維管束韌皮部薄壁細胞仍然呈現多類結構特征。背面維管束韌皮部薄壁細胞質壁分離，由于中央大液泡的存在，細胞質緊鄰細胞質膜內側分布(圖12，a、b)。另有細胞的中央液泡變多、變小，線粒體增多；液泡、線粒體和高爾基體和細胞壁物質分散在細胞質中(圖12，c、d)。細胞質潰散后，細胞壁物質聚集并向細胞壁沉積(圖12，e、f)。但這些細胞的胞間連絲仍然存在(圖12，b、c、f)。側面維管束韌皮部細胞的細胞質逐漸降解，但線粒體和高爾基體尚存，同時大量細胞壁物質積累在細胞內部空間(圖12，g、h)。另外發(fā)現有的細胞細胞質消失殆盡，殘存的細胞器沿細胞壁分布，細胞內部空間的細胞壁物質向細胞壁沉積(圖12，i、j)。貯藏40 d，背面維管束韌皮部薄壁細胞的細胞質幾乎全部消失，細胞內部空間的細胞壁物質仍然向細胞壁沉積(圖13，a、b)。然而，有的側面維管束韌皮部薄壁細胞仍然分布著大液泡和線粒體(圖13，c、d)，盡管有的細胞內部空間幾乎僅剩細胞壁物質(圖13，e、f)。

a. 背面維管束韌皮部薄壁細胞；b. 圖a矩形框標注區(qū)域的放大圖；c. 側面維管束韌皮部薄壁細胞；d. 圖c矩形框標注區(qū)域的放大圖；Scw. 次生細胞壁；Cwm. 細胞壁物質；Mf. 微纖絲；Pl.質壁分離圖10 貯藏0 d時琯溪蜜柚果實背面維管束(a-b)和側面維管束(c-d)的韌皮部薄壁細胞a. Phloem parenchyma cells of the dorsal vascular bundle; b. Magnified micrograph of the region marked by rectangle in a; c. Phloem parenchyma cells of the septal vascular bundle; d. Magnified micrograph of the region marked by rectangle in c; Scw. Secondary cell wall; Cwm. Cell wall material; Mf. Microfibril; Pl. PlasmolysisFig.10 Phloem parenchyma cells of the dorsal (a-b) and the septal (c-d) vascular bundles of ‘Guanxi’ pummelo fruits at 0 day of storage

a、c、e. 三類典型的背面維管束韌皮部薄壁細胞；b、d、f.質壁分離現象和細胞質逐漸降解(圖a、c、e 矩形框標注區(qū)域的放大圖)；g、i、k. 三類典型的側面維管束韌皮部薄壁細胞；h、j、l. 細胞質和中央液泡逐漸消失(圖g、i、k矩形框標注區(qū)域的放大圖)；M. 線粒體；Cv. 液泡；V. 囊泡；P. 過氧化物酶體；Scw. 次生細胞壁圖11 貯藏10 d時琯溪蜜柚果實背面維管束(a-f)和側面維管束(g-l)的韌皮部薄壁細胞a, c and e. Three typical types of phloem parenchyma cells of the dorsal vascular bundle; b, d and f. Note the plasmolysis of plasma membrane and the increasing degradation of cytoplasm (magnified micrographs of the regions marked by rectangles in a, c, and e); g, i and k. Three typical types of phloem parenchyma cells of the septal vascular bundle; h, j and l. The cytoplasm and central vacuole gradually disappeared (magnified micrographs of the regions marked by rectangles in g, i and k); M. Mitochondrion; Cv. Vacuole; V. Vesicle; P. Peroxisome; Scw. Secondary cell wallFig.11 Phloem parenchyma cells of the dorsal (a-f) and the septal (g-l) vascular bundles of ‘Guanxi’ pummelo fruit at 10 days of storage

a、c、e. 三類典型的背面維管束韌皮部細胞；b、d、f. 液泡和線粒體數量增加，高爾基體出現，細胞質降解(圖a、c、e矩形框標注區(qū)域的放大圖)；g、i. 兩類典型的側面維管束韌皮部細胞；h、j. 關注線粒體數量的增加，高爾基的出現，細胞質的降解(圖g、i矩形框標注區(qū)域的放大圖)；M. 線粒體；Cv. 液泡；G. 高爾基體；Pd. 胞間連絲；Mf.微纖絲圖12 貯藏20 d時琯溪蜜柚果實背面維管束(a-f)和側面維管束(g-j)的韌皮部薄壁細胞a, c and e. Three typical types of phloem parenchyma cells of the dorsal vascular bundle; b, d and f. Note the increases in the number of vacuoles and mitochondria, the occurrence of Golgi apparatus, and the degradation of cytoplasm (magnified micrographs of the regions marked by rectangles in a, c, and e); g and i. Two typical types of phloem parenchyma cells of the septal vascular bundle; h and j. Note the increase in the number of mitochondria, the occurrence of Golgi apparatus, and the degradation of cytoplasm (magnified micrographs of the regions marked by rectangles in g and i); M. Mitochondrion; Cv. Vacuole; G. Golgi apparatus; Pd. Plasmodesma; Mf. MicrofibrilFig.12 Phloem parenchyma cells of the dorsal (a-f) and the septal (g-j) vascular bundles of ‘Guanxi’ pummelo fruits at 20 days of storage

a. 背面維管束韌皮部薄壁細胞；b. 圖a矩形框標注區(qū)域的放大圖；c、e. 兩類典型的側面維管束韌皮部薄壁細胞；d. 細胞內部空間分布著大量線粒體(圖c矩形框標注區(qū)域的放大圖)；f. 圖e矩形框標注區(qū)域的放大圖；V. 囊泡；M. 線粒體；Cwm. 細胞壁物質；Mf. 微纖絲圖13 貯藏40 d時琯溪蜜柚果實背面維管束(a-b)和側面維管束(c-f)的韌皮部薄壁細胞a. Phloem parenchyma cells of the dorsal vascular bundle; b. Magnified micrograph of the region marked by rectangle in a; c and e. Two typical types of phloem parenchyma cells of the septal vascular bundle; d. Many mitochondria distribute in the intracellular space (magnified micrograph of the region marked by rectangle in c; f. Magnified micrograph of the region marked by rectangle in e; V. Vesicle; M. Mitochondrion; Cwm. Cell wall material; Mf. MicrofibrilFig.13 Phloem parenchyma cells of the dorsal (a-b) and the septal (c-f) vascular bundles of ‘Guanxi’ pummelo fruits at 40 days of storage

貯藏期結束時，兩類韌皮部薄壁細胞均只剩殘余的細胞質(圖14，a、c)，細胞內部空間的細胞壁物質仍向細胞壁沉積(圖14，b、d)。

a. 背面維管束韌皮部薄壁細胞；b. 圖a矩形框標注區(qū)域的放大圖；c. 側面維管束韌皮部薄壁細胞；d. 圖c矩形框標注區(qū)域的放大圖；Cwm. 細胞壁物質；Mf. 微纖絲圖14 貯藏60 d時琯溪蜜柚果實背面維管束(a-b)和側面維管束(c-d)的韌皮部薄壁細胞a. Phloem parenchyma cells of the dorsal vascular bundle; b. Magnified micrograph of the region marked by rectangle in a; c. Phloem parenchyma cells of the septal vascular bundle; d. Magnified micrograph of the region marked by rectangle in c; Cwm. Cell wall material; Mf. MicrofibrilsFig.14 Phloem parenchyma cells of the dorsal (a-b) and the septal (c-d) vascular bundles of ‘Guanxi’ pummelo fruits at 60 days of storage

綜合分析背面維管束和側面維管束韌皮部薄壁細胞超微結構的變化趨勢，發(fā)現兩類維管束韌皮部細胞的次生細胞壁加厚過程呈現一個共同的特征：中央大液泡開始變成多個小液泡的同時，引起細胞質壁分離；之后線粒體增多，高爾基體出現，細胞壁物質也隨之增多；最后細胞質降解，細胞內部空間幾乎僅剩細胞壁物質，次生細胞壁逐漸加厚，以致無法與初生細胞壁區(qū)分。

3 討 論

本研究結果顯示，汁胞?；^程中果皮總細胞壁物質含量顯著提高，這與熊博等[21]的研究結果較為一致。另外，在果實?；^程中，不僅果實背面維管束和側面維管束的篩管-伴胞復合體和韌皮部薄壁細胞次生細胞壁明顯加厚，而且囊衣同樣存在細胞壁物質積累現象。通過比較琯溪蜜柚果實不同組織細胞壁物質開始顯著積累的時間發(fā)現，首先是果實維管束細胞木質化(貯藏10 d時次生細胞壁明顯加厚)，其次是囊衣和果皮總細胞壁物質含量顯著提高(貯藏20 d)，最后是汁胞總細胞壁物質顯著積累(貯藏40 d側面維管束汁胞總細胞壁物質含量顯著提高，但整個貯藏期內背面維管束汁胞總細胞壁物質含量始終無顯著變化)。果實維管束從果柄部位開始遍布整個果實[22-23]，承擔著物質運輸的作用[24-26]。離體果實的維管束是吸收和散失水分的重要途徑[27]。貯藏期內果實水分散失不可避免，這可能引起果實細胞對水分虧缺逆境的響應。據報道，植物能以木質素、纖維素、胼胝質、角質和軟木質在細胞壁沉積的方式應對環(huán)境的變化[28]。本研究結果說明在柚果實貯藏期內果實維管束、囊衣和果皮生理代謝的變化早于汁胞；揭示汁胞以外的果實組織生理代謝變化的原因可能有助于果實?；瘷C理的研究和?；揽卮胧┑闹贫ā１驹囼灲Y果顯示，在柚果實?；^程中兩類果實維管束的篩管-伴胞復合體結構特征的變化趨勢無明顯差異，但韌皮部薄壁細胞間結構特征的變化不完全相同。兩類果實維管束韌皮部薄壁細胞共同的結構特征是：在貯藏10 至20 d時兩類維管束韌皮部薄壁細胞內線粒體和囊泡數量增多，貯藏20 d時細胞內出現高爾基體，貯藏60 d時細胞潰散死亡。兩類果實維管束結構特征間的差異主要表現為：貯藏40 d時背面維管束韌皮部薄壁細胞內線粒體和囊泡消失殆盡，而此期在側面維管束韌皮部薄壁細胞內仍然可觀察到很多線粒體。在擬南芥木質部次生細胞壁沉積過程中伴隨著高爾基體數量的增加[29]。肉桂醇羥化酶[30]、半纖維素合成酶[31]、半纖維素側鏈修飾酶[32]和纖維素合成酶組裝調控蛋白[33]均分布于植物高爾基體；另外有的細胞壁物質，例如：木葡聚糖、多聚半乳糖醛酸和鼠李半乳糖醛酸也定位在高爾基體[34]。這些報道均證明高爾基體是植物細胞壁物質合成的重要場所。在茵芋(Skimmiajaponica)葉片和莖愈傷組織的原生質體細胞壁再生過程中，伴隨著線粒體數量的增多[35]。懸鈴木(Platanus×acerifolia)的木質部導管附近的薄壁細胞在合成細胞壁物質的同時，細胞內也出現大量的線粒體[36]。這些報道與本試驗結果都說明線粒體可能與細胞壁物質積累相關。特別是本試驗發(fā)現在柚果實維管束韌皮部薄壁細胞內不僅線粒體出現時間早于高爾基體，而且?；氐膫让婢S管束汁胞的著生位置是線粒體數量增加時間更長的果實側面維管束。這表明線粒體可能參與柚果實細胞壁物質積累的調控。植物線粒體是活性氧(ROS)的重要合成部位[37]。ROS中的過氧化氫(H2O2)與植物細胞壁物質積累相關，例如：在擬南芥(Arabidopsisthaliana)維管組織中發(fā)現，H2O2作為一個信號物質能夠轉錄激活木質素的合成途徑[38]；H2O2與鹽逆境下擬南芥植株纖維素含量呈正相關[39]。據報道，琯溪蜜柚老齡樹果實?；矢哂谶m齡樹，老齡樹果實汁胞H2O2含量高于適齡樹[40]。至于線粒體是否是柑橘類果實粒化過程中的重要調控因子及其調控機理(是否由ROS介導)，尚待試驗證實。

從貯藏40 d至貯藏期結束，柚果實側面維管束汁胞可溶性固形物含量持續(xù)顯著降低，而總細胞壁物質含量持續(xù)顯著提高?？扇苄怨绦挝镏械闹饕煞质翘?。糖是木質素[41]、纖維素[42]、半纖維素[43]和果膠[43]合成的碳架來源。對椪柑(CitrusreticulataBlanco)的正常汁胞和?；霓D錄組分析發(fā)現，糖和檸檬酸降解途徑及細胞壁物質合成途徑的相關基因表達量顯著提高，而糖和檸檬酸合成途徑及細胞壁物質降解途徑的相關基因表達量顯著降低，證明在汁胞的?；^程伴隨著糖和酸的消耗[44]。結合本試驗柚果實汁胞可溶性固形物和總細胞壁物質含量的動態(tài)變化趨勢，推測細胞壁物質合成途徑與細胞壁物質前體物質的代謝途徑產生明顯變化的時期相近，然而兩類途徑之間的聯系尚待進一步研究。