子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN、RFC4表達(dá)變化及其與患者預(yù)后的關(guān)系

章小霞，任曉燕，陶玉梅，袁明明，顧麗麗，王燕

1南通市婦幼保健院病理科，江蘇南通226006；2南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科

子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤，近年來，我國(guó)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，并逐漸年輕化。目前治療子宮內(nèi)膜癌的主要方法是手術(shù)切除輔以放療和藥物治療，但大多數(shù)患者術(shù)后生存時(shí)間短，生活質(zhì)量較差，且極易出現(xiàn)耐藥性。靶向治療的迅速發(fā)展為子宮內(nèi)膜癌提供了新的治療手段，但多數(shù)靶向藥物仍處于實(shí)驗(yàn)階段，尋找具有針對(duì)性的分子標(biāo)志物是攻克子宮內(nèi)膜癌的關(guān)鍵。Geminin基因(GMNN)是一種小分子蛋白，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因子[1]。RFC4是復(fù)制因子C(RFC)復(fù)合體的幾個(gè)亞基之一，作為聚合酶輔助蛋白在DNA復(fù)制和修復(fù)中起作用，RFC4失調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生[2]。關(guān)于子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN、RFC4的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后關(guān)系的研究目前罕見報(bào)道。本研究利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，觀察子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN、RFC4 mRNA的表達(dá)變化，探討其與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，并利用臨床標(biāo)本對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為子宮內(nèi)膜癌的診斷與預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物信息學(xué)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫 UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)，OncoLnc數(shù)據(jù)庫(http://www.oncolnc.org/)，基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析(GEPIA)數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)。

1.1.2 組織標(biāo)本來源 收集2020年在南通大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的40例子宮內(nèi)膜癌患者的新鮮癌組織及癌旁組織(距離腫瘤直徑2 cm)，患者年齡≤55歲67例，>55歲66例；腫瘤組織分級(jí)G1級(jí)32例，G2級(jí)73例，G3級(jí)28例；腫瘤浸潤(rùn)深度<1/2肌層110例，≥1/2肌層23例；FIGO病理分期Ⅰ+Ⅱ期88例，Ⅲ+Ⅳ期45例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例；絕經(jīng)100例；ER陽性61例，PR陽性68例，Her-2 0～2+ 109例、3+ 24例，Ki67陽性65例，p53陽性38例。另收集2013年1月1日—2016年6月30日南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科保存的石蠟標(biāo)本，包括120例正常子宮內(nèi)膜組織、100例不典型增生子宮內(nèi)膜組織及133例子宮內(nèi)膜癌組織。所有患者手術(shù)前未接受過抗癌治療，臨床資料及術(shù)后隨訪記錄完整。

1.2 方法

1.2.1 子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN、RFC4 mRNA和蛋白表達(dá)檢測(cè)

1.2.1.1 子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織的生物信息學(xué)分析 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫獲取GMNN、RFC4 mRNA和蛋白在人子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)情況。在數(shù)據(jù)庫右上角中選擇TCGA “TCGA Gene analysis”，“Enter gene symbol(s)”中輸入目的基因GMNN、RFC4，“TCGA dataset”中選擇“Uterine Corpus Endometrial Carcinoma”，然后Explore選擇“Expression”即可獲得圖片結(jié)果。GMNN、RFC4蛋白結(jié)果的獲取在右上角選擇CPTAC即可，其余步驟同上。

1.2.1.2 子宮內(nèi)膜癌組織與癌旁組織的PCR分析 使用TRIzol試劑盒提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照RT-qPCR試劑盒的操作說明進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列：GMNN上游5′-AGAAAATGAGCTGTCCGCAGG-3′，下游5′-TACAGCGCCTTTCTCCGTTT-3′；RFC4上游5′-GCGGAAACCTGAGGAACGAGCC-3′，下游5′-TGGCAGCTACTCCTCGATCCTTG-3′；內(nèi)參GAPDH上游5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′，下游5′-TCCCGTTCTCAGCCATGTAGTT-3′。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算GMNN、RFC4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.1.3 正常子宮內(nèi)膜組織、不典型增生子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN、RFC4蛋白表達(dá) 采用免疫組化EnVision法檢測(cè)。取組織石蠟標(biāo)本，連續(xù)切片，按照試劑盒說明進(jìn)行染色，染色結(jié)果由兩位資深病理診斷醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判斷，取來自5個(gè)高倍視野的100個(gè)細(xì)胞進(jìn)行判讀并評(píng)分。GMNN、RFC4定位在細(xì)胞核，染色強(qiáng)度計(jì)0～3分(無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分)，染色細(xì)胞比例計(jì)1～4分(≤10%為1分，>10%～50%為2分，>50%～80%為3分，>80%為4分)，以染色強(qiáng)度評(píng)分與染色細(xì)胞比例相乘，>6為高表達(dá)，≤6為低表達(dá)。

1.2.2 子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后分析

1.2.2.1 生物信息學(xué)分析 利用OncoLnc數(shù)據(jù)庫進(jìn)行TCGA生存分析，觀察GMNN、RFC4 mRNA不同表達(dá)水平對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者的總生存率的影響。在數(shù)據(jù)庫中輸入目的基因GMNN、RFC4，“submit”選擇UCEC(子宮內(nèi)膜癌)中的“Yes Please!”，“Lower Percentile”及“Higher Percentile”均填寫“50”(即前50%定義為低表達(dá)組，后50%定義為高表達(dá)組)，低表達(dá)組和高表達(dá)組各270例，“submit”后即可獲得圖片結(jié)果。

1.2.2.2 組織標(biāo)本分析 133例子宮內(nèi)膜癌患者均獲隨訪，隨訪截至日期為2021年6月，記錄患者的生存情況，計(jì)算總生存率。

1.2.3 GMNN與RFC4的相關(guān)性分析

1.2.3.1 生物信息學(xué)分析 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析GMNN與RFC4的相關(guān)性。在數(shù)據(jù)庫中選擇“Correlation”，Gene A及Gene B中輸入 “GMNN”與“RFC4”，“TCGA Tumor (Cancer name)”選擇“UCEC Tumor”,“Add”，“Plot”后即可得到結(jié)果。

1.2.3.2 組織標(biāo)本分析 采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析133例子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN與RFC4的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN、RFC4基因表達(dá)變化 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織(n=546)中的GMNN、RFC4 mRNA表達(dá)水平均高于正常子宮內(nèi)膜組織(n=35)(P均<0.05)，見圖1。本課題組RT-qPCR結(jié)果顯示，GMNN、RFC4 mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)分別為2.08±0.43、1.98±0.51，在癌旁組織中的表達(dá)分別為1.31±0.39、1.07±0.40。GMNN、RFC4 mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平均高于癌旁組織(P均<0.05)。

2.2 子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN、RFC4蛋白表達(dá)變化 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，GMNN及RFC4蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中(n=546)的表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜組織(n=35)(P均<0.05)，見圖2。本課題組免疫組化結(jié)果顯示，GMNN、RFC4蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的高表達(dá)率高于正常子宮內(nèi)膜組織和不典型子宮內(nèi)膜組織(P均<0.05)。見表1。進(jìn)一步分析顯示，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO病理分期Ⅲ+Ⅳ期、Ki67表達(dá)陽性、p53表達(dá)陽性患者的GMNN、RFC4蛋白高表達(dá)率分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO病理分期Ⅰ+Ⅱ期、Ki67表達(dá)陰性、p53表達(dá)陰性患者(P均<0.05)。見表2。

注：A為GMNN mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)比較；B為RFC4 mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)比較。

注：A為GMNN蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)比較；B為RFC4蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)比較。

表1 正常子宮內(nèi)膜、不典型子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN、RFC4蛋白表達(dá)比較[例(%)]

2.3 子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN、RFC4表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響 OncoLnc數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，GMNN及RFC4 mRNA高表達(dá)患者的總生存率較低表達(dá)患者降低(P均<0.05)，見圖3。本課題組中，GMNN、RFC4蛋白高表達(dá)患者的總生存率分別為43.0%、43.4%，低表達(dá)患者的總生存率分別為89.4%、86.0%。GMNN、RFC4蛋白高表達(dá)患者的總生存率低于低表達(dá)患者(P均<0.05)。Cox回歸分析顯示，GMNN高表達(dá)、RFC4高表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO病理分期Ⅲ+Ⅳ期、Ki-67陽性是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P均<0.05)。見表3。

2.4 子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN、RFC4表達(dá)的相關(guān)性 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN與RFC4 MRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.58，P<0.01)。本課題組中，子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN與RFC4蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.303，P<0.01)。

3 討論

正常內(nèi)膜、不典型增生內(nèi)膜、內(nèi)膜癌三者之間是疾病進(jìn)展的一個(gè)過程。正常子宮內(nèi)膜在長(zhǎng)期持續(xù)的激素或炎癥刺激影響下，子宮內(nèi)膜會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞異形性，即不典型增生，若不及時(shí)治療，進(jìn)一步發(fā)展就會(huì)成為子宮內(nèi)膜癌。子宮內(nèi)膜不典型增生是子宮內(nèi)膜癌的癌前病變，約1/3左右會(huì)發(fā)展為內(nèi)膜癌。子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不佳，僅依賴常規(guī)化療或臨床手術(shù)無法解決子宮內(nèi)膜癌患者尤其是晚期患者的高病死率。雖然目前免疫療法、RNA療法等多種療法聯(lián)合為其治療提供了一種有前景的臨床策略，但能夠有效治療子宮內(nèi)膜癌的靶向藥物目前并不多見。GMNN一種多功能蛋白質(zhì)，可抑制細(xì)胞增殖S期的DNA復(fù)制，防止基因組不穩(wěn)定性，并防止化學(xué)誘導(dǎo)的致癌作用。GMNN通過控制細(xì)胞周期內(nèi)DNA復(fù)制的重新啟動(dòng)來維持基因組保真度[3]，并可調(diào)節(jié)HBO1影響的DNA復(fù)制[2]，其復(fù)制起始因子Cdt1表達(dá)水平的不平衡可導(dǎo)致DNA復(fù)制缺陷從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[4-5]。GMNN在胃癌、腸癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織中過度表達(dá)[6]，表明其具有致癌作用。

表2 不同臨床病理參數(shù)子宮內(nèi)膜癌患者GMNN、RFC4蛋白表達(dá)比較[例(%)]

注：A為GMNN不同表達(dá)水平患者的生存時(shí)間比較；B為RFC4不同表達(dá)水平患者的生存時(shí)間比較。

這種致癌作用的機(jī)制包括在早期細(xì)胞譜系中維持多能性的能力[7]、促進(jìn)胚胎干細(xì)胞中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[8]和在G2/M/G1早期控制胞質(zhì)分裂的能力[9]。大量研究顯示，GMNN表達(dá)水平越高，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度越快，侵襲能力越強(qiáng)，患者生存時(shí)間越短[10-12]，因此有學(xué)者認(rèn)為GMNN可作為肝癌診斷的生物標(biāo)志物[13]。RFC復(fù)合體位于真核生物復(fù)制叉上，由RFC1、RFC2、RFC3、RFC4、RFC5亞基構(gòu)成，在DNA損傷后的真核DNA復(fù)制和DNA修復(fù)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[14]。RFC4與RFC2、RFC5亞基形成核心復(fù)合物，具有DNA依賴性ATP酶活性，在體外系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，該活性受PCNA刺激，是DNA聚合酶δ和DNA聚合酶ε延伸引物DNA模板所必需的[15]。RFC4在肺癌、口腔舌鱗癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病等多種癌癥中高表達(dá)，其致癌作用與腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲密切相關(guān)[16]。本研究利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析子宮內(nèi)膜癌組織中的GMNN、RFC4 mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，GMNN、RFC4mRNA和蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)均高于正常子宮內(nèi)膜組織；進(jìn)一步采用RT-qPCR方法對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者的新鮮癌組織和癌旁組織中的GMNN、RFC4 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，GMNN、RFC4 mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平均高于癌旁組織；采用免疫組化方法檢測(cè)正常內(nèi)膜、不典型增生內(nèi)膜、內(nèi)膜癌組織中的GMNN、RFC4蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，GMNN、RFC4蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的高表達(dá)率明顯高于不典型子宮內(nèi)膜組織和正常子宮內(nèi)膜組織。這提示MNN、RFC4 mRNA和蛋白表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)，二者高表達(dá)促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。進(jìn)一步分析GMNN、RFC4與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO病理分期Ⅲ+Ⅳ期、Ki67表達(dá)陽性、p53表達(dá)陽性患者的GMNN、RFC4高表達(dá)率分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO病理分期Ⅰ+Ⅱ期、Ki67表達(dá)陰性、p53表達(dá)陰性的患者，表明GMNN和RFC4表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的FIGO病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki67蛋白表達(dá)水平、p53蛋白表達(dá)水平有關(guān)，提示GMNN及RFC4的高表達(dá)均可促進(jìn)人子宮內(nèi)膜癌的惡性進(jìn)展。

表3 子宮內(nèi)膜癌患者的術(shù)后單因素和多因素生存分析

子宮內(nèi)膜癌作為常見的婦科惡性腫瘤，大多數(shù)患者手術(shù)后生存時(shí)間短，預(yù)后差。本研究采用OncoLnc數(shù)據(jù)庫分析子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN、RFC4 mRNA表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響，結(jié)果顯示，GMNN及RFC4 mRNA高表達(dá)患者的總生存率較低表達(dá)患者降低；本課題組對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者的隨訪結(jié)果顯示，GMNN、RFC4蛋白高表達(dá)患者的總生存率低于低表達(dá)患者，提示二者的高表達(dá)與內(nèi)膜癌患者的總生存率均密切相關(guān)，兩者的表達(dá)情況可提示子宮內(nèi)膜癌患者的術(shù)后生存率；Cox回歸分析顯示，GMNN、RFC4蛋白高表達(dá)是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，二者與內(nèi)膜癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，可作為內(nèi)膜癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，GMNN和RFC4表達(dá)越高，子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后越差。

最新對(duì)斑馬魚的研究顯示，GMNN通過影響Fgf8和Notch信號(hào)通路，以調(diào)節(jié)體節(jié)發(fā)生過程中的體節(jié)分割[17]；對(duì)斑馬魚和小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，GEMC1作為GMNN家族的一員，是多纖毛細(xì)胞分化程序的關(guān)鍵上游介質(zhì)，在Notch抑制時(shí)被激活[18]。而另有研究顯示，RFC4是Notch1信號(hào)傳導(dǎo)的全新直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)[19]。我們推測(cè)，GMNN與RFC4的相互作用可能與Notch信號(hào)通路有一定的關(guān)系，但具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究先通過生物信息學(xué)分析GMNN與RFC4 mRNA表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，GMNN與RFC4 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)；然后對(duì)子宮內(nèi)膜癌組織中GMNN與RFC4蛋白表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者呈正相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。推測(cè)二者可能協(xié)同表達(dá)，共同促進(jìn)內(nèi)膜癌的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，GMNN、RFC4 mRNA及蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)升高，且二者表達(dá)呈正相關(guān)；GMNN、RFC4高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的惡性程度、進(jìn)展情況有關(guān)，嚴(yán)重影響患者的術(shù)后生存率。因此認(rèn)為，GMNN及RFC4與子宮內(nèi)膜癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，兩者極有可能成為今后病理診斷和治療子宮內(nèi)膜癌的新的分子指標(biāo)。關(guān)于GMNN與RFC4相互作用的具體機(jī)制目前尚并不明確，有待我們從細(xì)胞學(xué)及分子遺傳學(xué)水平進(jìn)一步深入研究。