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    外周血循環(huán)腫瘤細胞的表型及TOP2A表達與膀胱癌復發(fā)轉移及預后的關系

    2022-01-26 02:39:16鐘蛟劉浩然汪道琦劉建和
    現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志 2021年5期
    關鍵詞:膀胱癌表型上皮

    鐘蛟 劉浩然 汪道琦 劉建和

    膀胱癌是泌尿外科最常見的腫瘤之一,其遠處轉移是導致膀胱癌患者死亡的主要原因[1]。影像學技術難以發(fā)現(xiàn)早期微小轉移灶,約50%的肌層浸潤性膀胱癌(muscular invasive bladder cancer, MIBC)確診時已有微轉移灶[2]。外周血循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTC)是指能逃避自身免疫監(jiān)視進入外周血中的腫瘤細胞[3]。研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者外周血中CTC的存在與疾病轉歸不良有關[3-4]。目前從單個CTC水平研究膀胱癌預后的文章較少,本文對45例膀胱癌患者的單個CTC上上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表型和拓撲異構酶Ⅱα(topoisomerase-II alpha, TOP2A)表達進行檢測分析,研究其對膀胱癌進展及預后的影響。

    對象和方法

    一、一般資料

    收集從2013年9月至2016年8月在我院行根治性膀胱全切或經(jīng)尿道膀胱電切術,且病理確診為膀胱癌行CTC檢測的45例患者。年齡35~84歲,平均60.93歲,男40例,女5例,腫瘤pTNM分期:T1期17例、T2期14例、T3期8例、T4期6例、N1期6例,腫瘤組織病理分級(根據(jù)WHO 2004年分級標準):高級別31例、低級別14例。本研究經(jīng)我院倫理審查委員會同意。

    二、方法

    采用CanPatrolTM二代多重RNA原位檢測膀胱癌手術前外周血CTC計數(shù)、分型及TOP2A的表達。用8號采血針管和EDTA抗凝采血管采集2管(5 ml/管)外周血樣本,轉移至樣本保存管中,進行預處理。經(jīng)預處理后的樣本抽濾至過濾器中,用特異捕獲探針與目標mRNA進行雜交,擴增探針與捕獲探針進行雜交,為雜交信號的擴大做準備。用標記有熒光基因的標記探針與擴增探針進行雜交,產(chǎn)生熒光信號,利用自動識別系統(tǒng)閱讀熒光信號,自動判斷檢測結果。CTC分為上皮型、混合型和間質型,依據(jù)TOP2A表達量分為高、中、低和無表達。電話隨訪患者手術后腫瘤復發(fā)時間及生存狀況。

    三、統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 23.0統(tǒng)計分析軟件進行描述性統(tǒng)計分析。分類變量報告為計數(shù)和百分比,連續(xù)變量報告為平均值和標準差,計數(shù)型資料采用χ2或Fisher精確檢驗。采用Kaplan-Meier法中的Log-rank法進行生存分析來計算影響患者生存時間及生存狀態(tài)的因素,并繪制生存函數(shù)圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結 果

    一、外周血CTC陽性率及CTC中EMT表型和TOP2A的表達

    45例患者中有35例(77.8%)外周血中檢出CTC,共檢出CTC 160個,每個樣本CTC檢出范圍0~17個,平均3.56個,中位數(shù)3個,其中上皮型40個(25.0%)、間質型53個(33.1%)、混合型67個(41.9%)。單個CTC水平的TOP2A高/中表達共108個(67.5%),TOP2A低表達/無表達共52個(32.5%)。CTC中不同EMT表型間TOP2A表達量差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.375,P<0.05),見表1。

    表1 CTC上EMT 表型與TOP2A的表達[個(%)]

    二、外周血CTC陽性率、數(shù)量、TOP2A表達及TOP2A高/中表達的EMT表型與腫瘤分期、病理分級的關系

    卡方檢驗結果顯示,非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscular invasive bladder cancer, NMIBC)與MIBC兩組患者外周血CTC的陽性率、數(shù)量、TOP2A高/中表達、TOP2A高/中表達上皮型和TOP2A高/中表達間質型比較,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);但對兩組患者CTC上TOP2A高/中表達混合型檢出情況進行比較時,發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。不同臨床分期、病理分級膀胱癌患者外周血CTC的TOP2A高/中表達存在差異(χ2=11.24,P<0.05),T2~4G3患者檢測到TOP2A高/中表達的CTC更多;但在不同臨床分期、病理分級膀胱癌患者外周血CTC的陽性率、CTC檢出數(shù)量、TOP2A高/中表達上皮型、TOP2A高/中表達混合型和TOP2A高/中表達間質型比較,差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),見表3。研究結果顯示,膀胱癌是否淋巴結轉移與CTC檢出、不同EMT表型、TOP2A表達及TOP2A高/中表達的EMT表型之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    表2 外周血CTC檢測數(shù)據(jù)與膀胱腫瘤浸潤程度的關系[例(%)]

    表3 外周血CTC檢測數(shù)據(jù)與膀胱腫瘤不同臨床分期及病理分級的關系[例(%)]

    三、外周血CTC檢出、數(shù)量、TOP2A表達與NMIBC及MIBC的無病生存期(disease-free survival time, DFS)和總生存期(overall survival, OS)的關系

    45例患者中,41例隨訪2~74個月,失訪4例,中位隨訪時間32個月,無病生存25例,死亡14例。在17例NMIBC患者中,失訪2例,死亡0例,復發(fā)1例,而在28例MIBC患者中,失訪2例,死亡14例,復發(fā)19例。通過KM法對17例NMIBC患者的隨訪結果進行生存分析,結果顯示,未發(fā)現(xiàn)外周血CTC檢出、數(shù)量、EMT表型及TOP2A表達與DFS及OS存在差異(P>0.05)。通過KM法對28例MIBC患者的隨訪結果進行生存分析,結果顯示,DFS與CTC的檢測陽性、TOP2A高/中表達及TOP2A高/中表達的間質型存在相關性(P<0.05),未觀察到DFS與CTC的數(shù)量及TOP2A高/中表達的混合型和上皮型存在相關性(P>0.05)。同時研究結果顯示,OS與CTC的陽性及TOP2A高/中表達顯著相關(P<0.05),未觀察到OS與CTC的數(shù)量及TOP2A高/中表達的不同EMT表型存在顯著差異(P>0.05)。圖1、圖2分別為MIBC各組DFS和OS的KM曲線及P值。分別對圖1中的各圖分組進行差異性比較,因樣本量(n=28,<40)較小,Fisher檢驗結果顯示,MIBC復發(fā)轉移與否與CTC陽性(P=0.007)、TOP2A高/中表達(P=0.003)及TOP2A高/中表達的間質型(P=0.013)之間差異有統(tǒng)計學意義;同樣對圖2中的各圖分組進行差異性比較,F(xiàn)isher檢驗結果顯示,MIBC死亡與CTC陽性(P=0.04)及TOP2A高/中表達(P=0.021)之間差異有統(tǒng)計學意義。

    A:CTC檢測陽性vs CTC檢測陰性;B:低CTC計數(shù) vs 高CTC計數(shù);C:TOP2A高/中表達vs TOP2A低/無表達;D:TOP2A高/中表達間質型 vs 非TOP2A高/中表達間質型;E:TOP2A高/中表達混合型 vs 非TOP2A高/中表達混合型;F:TOP2A高/中表達上皮型 vs 非TOP2A高/中表達上皮型圖1 CTC上TOP2A和EMT表型與DFS的KM曲線

    A:CTC檢測陽性vs CTC檢測陰性;B:低CTC計數(shù) vs 高CTC計數(shù);C:TOP2A高/中表達vs TOP2A低/無表達;D:TOP2A高/中表達間質型 vs 非TOP2A高/中表達間質型;E:TOP2A高/中表達混合型 vs 非TOP2A高/中表達混合型;F:TOP2A高/中表達上皮型 vs 非TOP2A高/中表達上皮型圖2 CTC上TOP2A和EMT表型與OS的KM曲線

    討 論

    CTC被認為是腫瘤轉移性擴散的源頭,CTC成為惡性腫瘤危險分層和治療檢測的重要工具[5-6]。盡管體內(nèi)CTC的存在與膀胱癌預后不良有關[7-8], 但許多患者即便體內(nèi)存在CTC,也不一定會出現(xiàn)腫瘤的轉移和復發(fā),使得從單細胞水平上對CTC的表型特征及基因表達進一步研究變得尤為重要,可能發(fā)現(xiàn)更多與腫瘤轉移及預后相關的信息。腫瘤細胞轉移是一緩慢、低效而致命的過程,而研究認為EMT是大多數(shù)腫瘤生長和轉移的必然過程[2,9-10],CTC主要分為上皮型、混合型和間質型,其中間質型的惡性程度高,預后差,可能因間質型CTC是經(jīng)EMT轉換而來,使自身形態(tài)發(fā)生了改變,黏附能力降低,可塑性強,與更容易發(fā)生脫落轉移有關。TOP2A是有絲分裂的重要核酶,研究已證實TOP2A的高表達與膀胱癌復發(fā)和預后不良密切相關[11-13]。

    我們的研究發(fā)現(xiàn),在MIBC中CTC陽性率較NMIBC更高,CTC與腫瘤浸潤程度的關系與既往研究結論一致[3-5];同時,T2~4G3和T2~4G1~2患者CTC陽性率較T1G3和T1G1~2更高,提示膀胱癌的T分期、病理分級越高,則外周血中檢測出CTC的幾率就越高;本研究中不同T分期和病理分級之間CTC陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.069),可能與病例數(shù)少有關。此外,研究證實CTC數(shù)量越多,膀胱癌患者的預后越差[3,10,14-15],本研究中CTC數(shù)量與DFS、OS無統(tǒng)計學差異,可能與病例數(shù)少以及CTC個數(shù)的多少定義為臨界值有關。

    本研究中,雖然大多數(shù)CTC陽性的患者檢測到TOP2A表達,但TOP2A的表達模式在不同表型中不同。Turley等[16]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中TOP2A表達水平較正常細胞更高。研究發(fā)現(xiàn)尿路上皮癌中TOP2A的高表達可能預示著腫瘤的侵襲性更高、預后更差[11,17-18]。我們研究發(fā)現(xiàn)MIBC和高級別膀胱癌患者的TOP2A水平均高于NMIBC和低級別膀胱癌,而且TOP2A高/中表達MIBC患者的DFS和OS明顯低于TOP2A低/無表達患者,結果與既往研究一致[12,18],即TOP2A的表達水平反映了腫瘤的侵襲性;但我們在NMIBC患者的隨訪檢測中,未發(fā)現(xiàn)CTC中TOP2A高表達與腫瘤復發(fā)和生存之間存在差異,這可能與本研究病例數(shù)太少有關,增大樣本量可能會產(chǎn)生有意義的結果。

    腫瘤侵襲性與EMT密切相關,CTC可分為上皮型、混合型和間質型。張瑞赟等[19]研究表明,間質型和混合型在MIBC中檢出率明顯高于NMIBC,上皮型卻無差異;金一等[20]研究發(fā)現(xiàn),間質型是膀胱癌復發(fā)轉移的獨立危險因素;本研究未發(fā)現(xiàn)CTC表型與膀胱癌臨床分期、病理分級存在統(tǒng)計學意義,但間質型在MIBC 17/28(60.7%)中的檢出率較NMIBC 6/17(35.3%)多,統(tǒng)計學無意義可能是由于樣本量太小,需進一步擴大樣本量進行驗證。在單個CTC水平上研究EMT表型和TOP2A共同表達發(fā)現(xiàn),在MIBC中TOP2A高/中表達間質型的檢出率更高,且TOP2A高/中表達間質型與DFS之間存在統(tǒng)計學意義,與OS之間差異無統(tǒng)計學意義,但其間質型中位OS明顯短于混合型和上皮型,這可能與隨訪時間短或病例數(shù)少相關,故我們推測,當MIBC患者間質型CTC上TOP2A基因高表達時,出現(xiàn)療效差、復發(fā)轉移快的可能大。然而,我們在17例NMIBC患者的隨訪研究中,除2例失訪,1例復發(fā),其余患者均存活,未發(fā)現(xiàn)單個CTC上TOP2A和間質型共同表達與DFS、OS之間存在相關性,但二者共表達的中位DFS和OS均短于其他表型,可能與術后化療、隨訪時間短及病例少等相關,尚需動態(tài)檢測CTC、擴大樣本量及延長隨訪時間等研究來進一步驗證。此外,本研究未發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移與CTC檢出、TOP2A表達及EMT表型的相關性,可能與腫瘤淋巴結轉移機制與血性轉移機制不同,無法通過CTC評估淋巴結轉移情況[19]。

    綜上所述,不同EMT表型和TOP2A標記物在CTC中有著不同的表達模式,CTC上不同標記物在NIMBC和MIBC之間也存在差異,在MIBC患者中更常檢測到TOP2A高/中表達和TOP2A高/中表達間質型的CTC,提示這些細胞可能在腫瘤侵襲和疾病進展過程中發(fā)揮一定作用,是腫瘤分期晚、預后差的原因,值得進一步研究來驗證。

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