不同病理分期膀胱癌患者循環(huán)腫瘤細胞的表達

嚴(yán)勇 孫洵 馬紹翔 鄭昕 王亮 李勇 王珂

膀胱癌是泌尿系最常見的惡性腫瘤，具有治療后復(fù)發(fā)率高、死亡率高的特點，其在我國泌尿系腫瘤中的發(fā)病率及死亡率均為首位，近年來其發(fā)病率和死亡率有所下降[1]。而造成膀胱癌患者死亡的主要原因是遠處轉(zhuǎn)移[2]。進入外周血并能存活的腫瘤細胞是循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTC)，其在一定條件下能在遠處定植而形成遠處器官轉(zhuǎn)移灶，因此，CTC是腫瘤能進行血行轉(zhuǎn)移的前提。早期檢測外周血CTC對評估患者遠處轉(zhuǎn)移風(fēng)險、疾病預(yù)后以及治療手段的選擇具有重要意義[3]。本研究聯(lián)合運用多種標(biāo)志物，優(yōu)選了免疫芯片分選法，檢測膀胱癌患者外周血中的CTC，并分析CTC的表達與不同病理分期膀胱癌患者的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

對象與方法

一、臨床資料

收集2019年9月至2021年3月在昆明市第一人民醫(yī)院就診的不同病理分期的膀胱癌患者20例，其中男14例，女6例；年齡46～90歲，平均年齡(65.4±7.4)歲，均為膀胱尿路上皮細胞癌。T1期2例，T2期9例，T3期6例(2例合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)，T4期3例(均合并有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)；腫瘤直徑≤3 cm者12例，直徑>3 cm者8例；單發(fā)9例，多發(fā)11例；患者均無遠處轉(zhuǎn)移及其他惡性腫瘤，均未接受過放化療。本研究通過了醫(yī)院倫理委員會審批，所有患者或家屬均簽署了知情同意書。

二、治療方案

所有膀胱癌患者均按照指南要求治療，非肌層浸潤患者采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)，術(shù)后常規(guī)進行表柔比星灌注治療，表柔比星溶于0.9%氯化鈉溶液，濃度為 600 μg/ml，灌注后膀胱內(nèi)維持45 min～1 h，方案為1次/周，灌注8周，之后 1 次/月，灌注8個月；肌層浸潤患者采用根治性膀胱切除術(shù)+尿流改道/原位新膀胱+淋巴結(jié)清掃術(shù)。所有患者均于術(shù)前行CTC檢測。

三、CTC的檢測及陽性判定

采集不同病理分期膀胱癌患者外周靜脈血10 ml，裂解紅細胞后去上清液，重懸，微流體芯片中推入EDTA、PBS和小牛血清白蛋白。將血樣推入另一螺旋微通道入口，加入一抗混合液(CK8/18/19，CD45)、二抗混合液(Alexa488及Alexa555)后，再加入核染試劑(DAPI)孵育，電子顯微鏡下觀察捕獲的細胞，CK、Alexa488(+)/CD45、Alexa555(-)判定為陽性并予以計數(shù)。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對檢測的數(shù)據(jù)進行分析，以頻數(shù)表示計數(shù)資料，組間比較采用χ2檢驗或者Fisher確切概率法，多因素分析采用Logistic回歸分析檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

20例患者中有11例檢出CTC，陽性率為55%(11/20)，CTC的計數(shù)為1～33個，1個CTC的患者有3例，2～8個CTC的患者有5例，8個以上的有3例。單因素分析顯示，CTC的陽性率在肌層浸潤性膀胱癌患者中明顯高于非肌層浸潤性膀胱癌患者；在病理分級高級別的患者中較低級別的患者陽性率高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性率高；多發(fā)腫瘤者較單發(fā)者陽性率高；腫瘤直徑>3 cm者較直徑≤3 cm者陽性率高?；颊咝詣e、年齡則與CTC的陽性率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。多因素Logistic回歸分析顯示，腫瘤高T分期(OR：T22.21、T34.15、T46.46)、病理分級高級別(OR：1.72)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OR：4.87)和腫瘤直徑>3 cm(OR：6.84)是CTC陽性的危險因素，見表2。

表1 膀胱癌患者病理特征與CTC陽性率的關(guān)系

表2 多因素Logistic回歸分析

討 論

有研究表明膀胱腫瘤中非肌層浸潤型占70%[4]，其治療后復(fù)發(fā)率高達78%，進展風(fēng)險為45%，保留膀胱治療后的死亡率為16%～23%[5]；而肌層浸潤型則占30%[4]，即使行根治性膀胱全切術(shù)，其術(shù)后5年局部復(fù)發(fā)率仍可達20%，其中約50%的患者會出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移灶或最終死亡，其主要原因為50%的患者在確診時、手術(shù)前已存在微轉(zhuǎn)移灶[6]。但目前傳統(tǒng)影像學(xué)檢查并不能較早發(fā)現(xiàn)這些微小體積的轉(zhuǎn)移灶，也沒有一種公認(rèn)的可應(yīng)用于早期檢測這些微轉(zhuǎn)移灶的生物學(xué)標(biāo)志物。因此，臨床上需要一種能精確檢測這些微轉(zhuǎn)移灶的新方法，以期早期診斷并指導(dǎo)治療，從而提高膀胱癌的臨床療效，減少腫瘤進展和降低復(fù)發(fā)率。

從1869年首次報道CTC存在于腫瘤患者的血液循環(huán)中，到現(xiàn)在CTC檢測逐漸被重視并廣泛采用，其檢測創(chuàng)傷小、特異性及靈敏度高，在臨床應(yīng)用中發(fā)揮了一定作用。CTC被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過程中的最直接因素[7]，目前已有外周血CTC檢測用于乳腺癌、肺癌、直腸癌、前列腺癌等腫瘤的診斷和預(yù)后判斷的研究，并取得重大進展[8-10]。因此，美國食品藥品管理局已允許CellSearch CTC檢測系統(tǒng)運用于臨床，以監(jiān)測乳腺癌、前列腺癌、肺癌和直腸癌患者的預(yù)后[11]。而目前CTC檢測在膀胱癌中應(yīng)用的報道尚不多，關(guān)于非轉(zhuǎn)移膀胱癌的大宗前瞻性研究表明，即使外周血中僅出現(xiàn)1個CTC，也標(biāo)志著患者在腫瘤相關(guān)病死率、腫瘤復(fù)發(fā)及總生存率等方面預(yù)后較差[6]。另一項研究表明，每7.5 ml外周血中發(fā)現(xiàn)≥1個CTC的膀胱癌患者中87%的病例短期內(nèi)出現(xiàn)首次復(fù)發(fā)，并伴有病情進展，而CTC陰性的患者則沒有出現(xiàn)疾病進展[12]。Gazzaniga等[13]研究證實術(shù)前CTC陽性率與膀胱腫瘤T1分期之間存在相關(guān)性，且CTC陽性與非肌層浸潤性膀胱癌復(fù)發(fā)時間有關(guān)聯(lián)性。Anantharaman等[14]報道了肌層浸潤性或轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者外周血中程序死亡配體基因-1(programmed death-ligand 1, PD-L1)表達于 CTC，所有25例患者均檢測出CTC和PD-L1，提示PD-L1在CTC中的表達情況將可能用于監(jiān)測膀胱腫瘤的治療效果和預(yù)后判斷。有薈萃分析表明，外周血CTC的檢出為膀胱腫瘤患者有無預(yù)后不良的獨立預(yù)測指標(biāo)，因而可應(yīng)用于膀胱癌的診斷，而CTC的陽性率與膀胱腫瘤的病理分期、有無轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)[3]。這些研究均提示CTC與膀胱癌的病理分期有一定的相關(guān)性，對患者的療效評估、預(yù)后監(jiān)測和個體化治療均有較大意義。

本研究中，我們也得出了相似的結(jié)果，選用免疫芯片分選法檢測具有不同病理特征的T1～T4期膀胱腫瘤患者外周血CTC，并分析其不同病理特征與CTC陽性率的相關(guān)性，結(jié)果提示CTC與腫瘤T分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及數(shù)目有相關(guān)性(P<0.05)；多因素分析顯示CTC與腫瘤T分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小有相關(guān)性(P<0.05)。故CTC的檢測有利于在不同病理特征膀胱癌患者中早期明確易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移者，從而準(zhǔn)確地評估病情、調(diào)整治療和判斷預(yù)后。但同樣也應(yīng)認(rèn)識到：腫瘤的轉(zhuǎn)移其實是個低效過程，即使進入外周血的腫瘤細胞量大，真正能在遠處定植成功的卻極少。其主要原因是CTC沒有了原位腫瘤的基質(zhì)依托，面臨著巨大生存壓力，包括血流剪切力、氧化應(yīng)激及免疫追殺等。因此，通過動態(tài)監(jiān)測CTC，則有助于盡早判斷復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移傾向、評判療效，便于臨床甄選合理、個體化的治療方案，以期提高臨床治療效果。但由于目前的檢測方法尚未完全統(tǒng)一，仍存在一定的假陰性或假陽性可能，且本研究也存在樣本量小的不足，因此，未來研究應(yīng)進一步建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的檢測質(zhì)量控制體系，以確保所有研究結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)的一致性；并早日進行大規(guī)模、多中心的臨床研究，且可將CTC與其他生物標(biāo)志物如循環(huán)腫瘤DNA聯(lián)合檢測,以進一步提升其早期判斷預(yù)后、評估治療效果和調(diào)整治療策略的應(yīng)用價值[15]。相信在不久的將來，CTC檢測有望成為臨床膀胱腫瘤診斷、早期預(yù)后評估、療效評價及指導(dǎo)個體化治療無創(chuàng)、便捷的重要監(jiān)測手段，并在膀胱癌的綜合診療體系中展現(xiàn)出較大的應(yīng)用前景。