環(huán)狀RNA circKDM4B調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖及侵襲遷移的實(shí)驗(yàn)研究

馬曉武，譚文亮，楊磊，謝智欽，王慶斌，陳亞進(jìn)，商昌珍

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤類型之一［1］。由于HCC發(fā)病早期無(wú)明顯典型癥狀，大部分患者在確診時(shí)病情已屬中晚期，失去根治性手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致HCC的整體預(yù)后仍有待提高［2，3］。因此，探索HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找有效的分子標(biāo)志物用于早期診斷、預(yù)測(cè)靶向及免疫等綜合治療的療效，對(duì)改善患者總體預(yù)后、提高患者生存率具有重大的臨床意義。

環(huán)狀RNA是具有共價(jià)鍵閉環(huán)結(jié)構(gòu)的特殊RNA分子，多數(shù)由外顯子反向剪接而成［4］。既往的研究已表明，環(huán)狀RNA在HCC、肺癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有調(diào)控作用［5-8］。由于環(huán)狀RNA在組織中的表達(dá)特異性以及其閉環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，表明其具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，本研究旨在初步探索circKDM4B對(duì)HCC細(xì)胞增殖、凋亡以及遷移侵襲能力的影響，為闡明其在HCC發(fā)生以及進(jìn)展過程中的作用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

肝癌細(xì)胞株（Huh7、SNU 387、HepG2）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。RNA快速提取試劑盒購(gòu)自EZBioscience公司。qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)試劑盒購(gòu)自湖南艾科瑞生物公司。FISH試劑盒及siRNA購(gòu)自廣州銳博公司。LipofectamineTM3000、AnnexinV-FITC及PI凋亡檢測(cè)相關(guān)試劑購(gòu)自Invitrogen公司。RNase R購(gòu)自廣州吉賽生物公司。CCK-8試劑購(gòu)自APEx-BIO公司。BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司。Martrigel基質(zhì)膠購(gòu)自Corning公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

所有細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)取適量細(xì)胞接種于六孔板，待其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分別加入陰性對(duì)照組siRNA（si-NC）和沉默組siRNA（si-circKDM4B）與LipofectamineTM3000混合液，轉(zhuǎn)染24 h后，用于提取RNA或進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3 RNA提取及qRT-PCR檢測(cè)

使用RNA快速提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA后使用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再使用SYBR?Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒和PCR儀對(duì)cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計(jì)算RNA的相對(duì)表達(dá)水平。circKDM4B上游引物：5′-CCTGGCCAACAGCGAGAAGTACTG-3′，下游：5′-TCCTTCGGGGGGATGATGTCATC-3′，GAPDH上游：5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′，下游：5′-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3′。

1.4 熒光原位雜交

HepG2細(xì)胞在50%融合度時(shí)，用多聚甲醛固定，然后進(jìn)行預(yù)雜交，最后，熒光標(biāo)記的circKDM4B探針與雜交緩沖液在37℃下雜交過夜，最后用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。Cy3-circKDM4B探針：5′-TTCGGGGGGATGATGTCATCATAC-3′。

1.5 RNase R消化實(shí)驗(yàn)

提取HCC細(xì)胞總RNA后，平均分成兩份，一份進(jìn)行消化反應(yīng)處理：2.5 μg總RNA加入10U RNase R在37℃孵育30 min；另一份加入0.5 μL的DEPC水作為對(duì)照，反應(yīng)后按之前步驟進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄和及PCR擴(kuò)增檢測(cè)RNA的表達(dá)水平。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)方法（CCK-8）實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染處理的HCC細(xì)胞每孔接種2000細(xì)胞于96孔板，分別于1、2、3、4、5、6天加入含10%濃度的CCK-8培養(yǎng)基溶液，避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的光密度（OD）值。

1.7 EdU增殖實(shí)驗(yàn)

每孔接種7×104個(gè)轉(zhuǎn)染處理的HCC細(xì)胞培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)基，加入500 μL EdU反應(yīng)液（10 μM）繼續(xù)孵育2 h。固定染色30 min，Hochest 33342進(jìn)行染核。最后使用熒光顯微鏡在100倍視野下進(jìn)行觀察拍照。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染處理的HCC細(xì)胞于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約90%時(shí)，使用200 μL槍頭于細(xì)胞板上劃痕，PBS沖洗清除被劃下的貼壁細(xì)胞，然后加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于劃痕后0 h、48 h時(shí)取樣并拍照記錄。最后使用Image-J軟件測(cè)量劃痕面積，并計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.9 Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)

離心收集轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，每個(gè)上層小室加入4×104個(gè)細(xì)胞（侵襲實(shí)驗(yàn)則在6 h前往上層小室中先加入100 μL Martrigel基質(zhì)膠），小室下層24孔板內(nèi)加入600 μL 25%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。48 h后取出小室，使用多聚甲醛固定下室細(xì)胞后滴加結(jié)晶紫染色10 min，擦去上層小室未穿過的細(xì)胞，在正置成像顯微鏡100倍視野下進(jìn)行拍照觀察。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理后，離心收集細(xì)胞加入PBS重懸清洗細(xì)胞，然后先后加入Annexin V-FITC及PI進(jìn)行染色，避光孵育15 min后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)所有的結(jié)果均采用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及作圖，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circKDM4B在HCC組織中高表達(dá)并驗(yàn)證其環(huán)狀結(jié)構(gòu)

在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索肝癌相關(guān)的環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)集，我們共篩選出3個(gè)GEO數(shù)據(jù)集，分別是GSE97332，GSE94508，GSE78520。通過limma包分析HCC癌與癌旁差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，我們共篩選出5個(gè)在HCC癌組織中高表達(dá)的環(huán)狀RNA，并將circKDM4B作為我們后續(xù)分析的對(duì)象。如圖1a所示，在經(jīng)過RNase R消化處理后，circKDM4B在細(xì)胞的表達(dá)量幾乎沒有受到影響，而其親本基因KDM4B在經(jīng)過酶消化后，含量明顯下降，表明相較于線性KDM4B mRNA，circKDM4B對(duì)RNase R耐受性好更加穩(wěn)定。同時(shí)運(yùn)用熒光原位雜交技術(shù)，我們確定了circKDM4B在HCC細(xì)胞內(nèi)的定位主要分布在細(xì)胞質(zhì)中（圖1b）。

圖1 a RNase R消化實(shí)驗(yàn)后circKDM4B的表達(dá)情況；圖1b FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)circKDM4B在HepG2細(xì)胞系中的定位

2.2 circKDM4B siRNA在HCC細(xì)胞系的沉默效率

為了探究circKDM4B對(duì)HCC發(fā)生及進(jìn)展的影響，我們對(duì)circKDM4B進(jìn)行了沉默處理，在轉(zhuǎn)染了si-circKDM4B 24 h后，采用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)circKDM4B和其親本基因KDM4B的表達(dá)水平，如圖2所示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染了si-circKDM4B后，SNU 387和Huh7細(xì)胞的circKDM4B表達(dá)水平明顯下降，但其親本基因KDM4B表達(dá)水平卻沒有變化。

圖2 轉(zhuǎn)染si-circKDM4B后，細(xì)胞內(nèi)circKDM4B和KDM4B的表達(dá)水平變化

2.3 沉默circKDM4B可抑制了HCC細(xì)胞的增殖能力

通過CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，在SNU 387和Huh7細(xì)胞中，si-circKDM4B組代表細(xì)胞數(shù)目的OD值均遠(yuǎn)高于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3a）。此外，我們也進(jìn)一步使用EdU增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-circKDM4B對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果表明，在SNU 387和Huh7細(xì)胞中si-circKDM4B組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)都遠(yuǎn)低于對(duì)照組（圖3b）。這部分結(jié)果表明敲減circKDM4B可明顯抑制HCC細(xì)胞的增殖能力。

圖3 a CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SNU 387和Huh7在轉(zhuǎn)染si-circKDM4B后增殖能力的變化；圖3b EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SNU 387和Huh7在轉(zhuǎn)染si-circKDM4B后增殖能力的變化

2.4 沉默circKDM4B可抑制HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力

為了探究circKDM4B是否影響HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，我們進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4a所示，在SNU 387和Huh7細(xì)胞系中，與對(duì)照組相比，敲減了circKDM4B后HCC細(xì)胞遷移速度明顯減慢。同樣的，Trasnwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，si-circKDM4B組穿過小室的細(xì)胞數(shù)都遠(yuǎn)少于對(duì)照組（圖4b）。因此，沉默circKDM4B后確實(shí)能對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力起到抑制作用。

圖4 a劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SNU 387和Huh7在轉(zhuǎn)染si-circKDM4B后橫向遷移能力的變化；圖4b Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SNU 387和Huh7在轉(zhuǎn)染si-circKDM4B后縱向遷移和侵襲能力的變化

2.5 沉默circKDM4B促進(jìn)HCC細(xì)胞的凋亡

通過流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)，結(jié)果顯示在SNU 387細(xì)胞中si-circKDM4B組的細(xì)胞早期凋亡率遠(yuǎn)高于對(duì)照組，并且總體的凋亡率（早期和晚期）也顯著高于對(duì)照組，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖5）。同樣的，我們也在Huh7細(xì)胞系中做了同樣的處理，也得到了類似的結(jié)果。

3 討論

目前HCC的首選治療方案仍是以手術(shù)切除為主聯(lián)合其它綜合治療措施。近年來(lái)，靶向及免疫治療的臨床研究及應(yīng)用取得了一定的進(jìn)展，使得一部分中晚期HCC患者在轉(zhuǎn)化治療中得到了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，在一定程度上提高了HCC患者整體的生存率。但由于腫瘤細(xì)胞的高度異質(zhì)性以及諸多的信號(hào)通路參與了HCC的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程［9-11］，因此，繼續(xù)深入的探索HCC的發(fā)病機(jī)制、尋找新的有效的治療靶點(diǎn)對(duì)改善HCC患者的總體預(yù)后仍具有重要的研究?jī)r(jià)值。

環(huán)狀RNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和免疫調(diào)節(jié)等多方面起到重要的作用［12］。多項(xiàng)研究也表明環(huán)狀RNA參與調(diào)控了HCC的發(fā)生及惡性進(jìn)展。Wei等人發(fā)現(xiàn)circCDYL通過介導(dǎo)非編碼RNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，激活PI3K/AKT和HIF1AN/Notch2信號(hào)通路從而促進(jìn)HCC進(jìn)展［13］。Liang等人研究發(fā)現(xiàn)circ-β-catenin可通過編碼短肽，并充當(dāng)GSK3β的誘餌，競(jìng)爭(zhēng)性地消耗GSK3β，從而增強(qiáng)β-catenin的穩(wěn)定性促進(jìn)其入核，激活Wnt/β-catenin通路及下游基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)HCC進(jìn)展的作用［14］。此外，有研究顯示circUHRF1可通過靶向miR-449c-5p，從而減少NK細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α，降低HCC患者抗PD-1的治療效果，在HCC免疫調(diào)節(jié)過程中也發(fā)揮重要的作用［15］。由于獨(dú)特的生物學(xué)特性，閉環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及在組織和體液中的差異性表達(dá)，環(huán)狀RNA在HCC的早期診斷和治療方面有著廣泛的應(yīng)用前景。

本研究通過生物信息學(xué)分析篩選在HCC癌組織中高表達(dá)的circKDM4B，并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了敲減circKDM4B可明顯抑制HCC細(xì)胞的增殖和侵襲遷移能力，同時(shí)具有促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡的能力。這也是首次在HCC中關(guān)于circKDM4B的功能研究報(bào)道?，F(xiàn)有證據(jù)表明，環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能主要包括參與miRNA、蛋白質(zhì)海綿吸附，參與miRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)，與RNA結(jié)合蛋白相互作用并調(diào)節(jié)親本基因的表達(dá)，編碼蛋白質(zhì)等［16-18］。我們通過FISH實(shí)驗(yàn)確定了circKDM4B在HCC細(xì)胞中主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，這為后面關(guān)于circKDM4B在肝癌中的具體調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。由于“海綿吸附機(jī)制”是定位在細(xì)胞質(zhì)中的環(huán)狀RNA最常見的調(diào)節(jié)機(jī)制，因此，circKDM4B可能通過經(jīng)典的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)肝癌的進(jìn)展發(fā)揮作用。

綜上所述，circKDM4B在肝癌組織中高表達(dá)，且主要穩(wěn)定分布在細(xì)胞質(zhì)中。在肝癌細(xì)胞系SNU 387和Huh7中沉默circKDM4B后可明顯抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)細(xì)胞的凋亡明顯增加。這表明circKDM4B是肝癌發(fā)生發(fā)展過程中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)分子，有望成為肝癌的預(yù)后指標(biāo)及治療靶點(diǎn)，但本研究也只是在體外細(xì)胞層面對(duì)circKDM4B的促癌作用進(jìn)行了證實(shí)，其作用機(jī)制尚不明確，下一步將繼續(xù)進(jìn)行雙熒光素酶及挽救實(shí)驗(yàn)等篩選和驗(yàn)證可能結(jié)合的miRNA及其下游的靶基因，為探明circKDM4B在肝癌中的分子機(jī)制提供更充分的理論依據(jù)。