不同品系黑老虎各器官精油揮發(fā)性成分的 GC-MS 分析

左毅成，王 森，邵鳳俠，何鐵定，譚玉珊，楊昌宏

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004； 2.湖南省通道縣黑老虎中藥材合作社，湖南 通道 418500）

黑老虎Kadsura coccinea是五味子科Schisandraceae 南五味子屬Schisandra常綠木質(zhì)藤本植物，其葉革質(zhì)，全株無毛，別名冷飯團(tuán)，苗語稱其為“布福娜”，意為美容長壽之果[1-2]。黑老虎主要分布于我國南方山地丘陵地區(qū)，湖南、廣西、云南、貴州、福建等?。▍^(qū)）均有少量分布[3]。在湖南省懷化市通道縣黑老虎基地有大規(guī)模種植。黑老虎全身是寶，果實甘甜可口，其各器官在醫(yī)藥、美容、食品等深加工領(lǐng)域的應(yīng)用前景也十分廣闊[4]。目前，關(guān)于黑老虎的研究主要集中在豐產(chǎn)栽培[5]、種子果皮活性物質(zhì)的抑菌抗氧化活性[6]、基因組SSR 特征[7]等。

黑老虎精油是黑老虎主要活性組分之一，黑老虎中的活性成分具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌等作用[8]。植物精油是從植物各器官中提取出來的具有強烈天然香氣的芳香油，又稱為揮發(fā)油[9]。植物精油主要成分為醇類、醛類、酚類、丙酮類、萜烯類等物質(zhì)，多具有抑菌、抗炎癥、加速新陳代謝等作用，因其具有天然綠色、香氣襲人等特點，在化妝品、食品防腐劑等領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注[10-11]。精油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、二氧化碳萃取法、冷凍壓縮法等，其中水蒸氣蒸餾法具有操作簡便、節(jié)約成本等優(yōu)點[12]。

為提高黑老虎資源的利用效率，并為黑老虎產(chǎn)品深加工提供參考，本研究中采用水蒸氣蒸餾法提取黑老虎各器官精油并對精油得率進(jìn)行比較，采用氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）對不同品系黑老虎各器官精油進(jìn)行檢測，并采用面積歸一法計算黑老虎精油成分相對含量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在湖南省懷化市通道縣黑老虎基地，選取長勢良好的2年生不同品系（‘紫黑’‘大紅’‘虎綠’）的黑老虎苗作為試驗材料。用枝剪將所采集黑老虎樣品植株的根、莖、葉分離，分裝入自封袋，帶回實驗室，放入4 ℃冰箱中進(jìn)行保存。

1.2 儀器與試劑

儀器：恒溫加熱套（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、超純水機（上海和泰儀器有限公司）、破壁機（上海電子科技有限公司）、7890A-5975C型氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）。試劑：去離子水、無水硫酸鈉（分析純）。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑老虎精油的制備

在中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點實驗室進(jìn)行黑老虎精油的制備。

用清水洗凈樣品表面的灰塵等雜質(zhì)。因用破壁機打碎后黑老虎葉片流出的粘稠液體大幅多于根和莖，所以按照根和莖的料液比1∶6，葉的料液比1∶8 進(jìn)行試驗，取黑老虎根、莖、葉樣品各400 g，粉碎后分別加2 400、2 400、3 200 mL 的去離子水。分別放入5 000 mL 蒸餾瓶中，用水蒸氣蒸餾裝置冷凝回流6 h，關(guān)掉恒溫加熱套。待收集裝置管壁冷卻后，用移液槍吸取收集裝置中不溶于水的一層淡黃色油狀液體，并裝入2 mL 離心管中。在離心管中加入適量無水硫酸鈉干燥除水，用封口膜封口以防精油揮發(fā)，放入4 ℃冰箱保存。

1.3.2 黑老虎精油的GC-MS 分析

GC-MS 分析在杭州研趣信息技術(shù)有限公司 完成。

北京大學(xué)韓光輝教授《金遷上京于燕京、復(fù)建上京及相關(guān)問題研究》的報告圍繞金代海陵王遷都燕京、金世宗復(fù)建上京這一系列歷史事件，對海陵王遷都燕京的過程，世宗恢復(fù)會寧府為上京、進(jìn)而復(fù)建上京形成金代六京等問題進(jìn)行了探索，特別是對上京等四路的城市管理機構(gòu)——警巡院的籍貫意義予以了制度史層面的深入考察，對金上京及金源文化的研究提供了有價值的研究思路。

色譜條件：色譜柱為HP-5MS（30.0 m× 250 μm×0.25 μm）；色譜柱起始溫度50 ℃，保持 2 min，以5 ℃/min 的速度升至130 ℃，以2 ℃/min 的速度升至155 ℃，以8 ℃/min的速度升至180 ℃， 最后以10 ℃/min 的速度升至250 ℃，保持2 min； 氣化室溫度250 ℃，傳輸線溫度280 ℃；載氣He；載氣流量1.0 mL/min；分流比為20∶1；進(jìn)樣量為1 μL。

質(zhì)譜條件：EI 源；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；四極桿150 ℃；掃描模式為Scan；掃描質(zhì)量范圍為35 ～500 u；溶劑延遲2.5 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

式中：R為精油提取率，M為精油凈質(zhì)量，M1為黑老虎樣品質(zhì)量。

經(jīng)GC-MS 檢測后，采用化合物譜庫（NIST17）結(jié)合CAS 號的方法分析黑老虎精油，得到各峰的物質(zhì)和匹配度，統(tǒng)計各峰匹配度大于80%的物質(zhì)，繪制表格。采用色譜峰面積歸一化法求得各成分相對含量。

使用SPSS 22.0 和Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和表格繪制，使用Origin 2019b 軟件繪制離子流量圖和柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品系黑老虎各器官精油提取率

‘紫黑’‘大紅’‘虎綠’3 個品系黑老虎各器官精油提取率見表1。由表1 可知，3 個品系黑老虎各器官精油提取率存在顯著性差異?！蠹t’根、莖、葉的精油提取率分別為0.472%、0.114%、0.213%，‘紫黑’根、莖、葉的精油提取率分別為0.543%、0.122%、0.327%，‘虎綠’根、莖、葉的精油提取率分別為0.439%、0.141%、0.286%。就不同品系的相同器官來說，‘紫黑’與‘虎綠’根的精油提取率存在顯著差異（P＜0.05），‘虎綠’與‘大紅’‘紫黑’莖的精油提取率存在顯著差異（P＜0.05），3 個品系黑老虎葉的精油提取率均存在顯著差異（P＜0.05）。同一品系黑老虎不同器官間的精油提取率由高到低依次均為根、葉、莖。3 個品系黑老虎各器官精油均呈現(xiàn)淡黃色，且有芳香氣味，顏色由莖、葉到根逐漸加深。

表1 3 個品系黑老虎各器官精油提取率?Table 1 Oil production rate of different organs of three K.coccinea strains

2.2 不同品系黑老虎各器官精油揮發(fā)性成分

‘紫黑’‘大紅’‘虎綠’3 個品系黑老虎各器官精油揮發(fā)性組分豐度如圖1 所示，其中相對含量大于0.5%的主要化學(xué)成分共116 種（表2）。由表2 可知，‘大紅’根、莖、葉中分別鑒定出化學(xué)成分53、36、45 種，‘紫黑’根、莖、葉中分別鑒定出化學(xué)成分58、56、51 種，‘虎綠’根、莖、葉中分別鑒定出化學(xué)成分58、51、45 種。‘大紅’根的主要揮發(fā)性成分有β-石竹烯（18.85%）、1,5-環(huán)癸二烯,1,5-二甲基-8-(1-甲基亞乙基)-,(1E,5E)-（8.69%）、Δ-杜松烯（7.91%）、立方醇（6.04%）；‘大紅’莖的主要揮發(fā)性成分有β-石竹烯（20.27%）、左旋-β-蒎烯（17.32%）、3,7,11,11-四甲基雙環(huán)[8.1.0]2,6-十一二烯（6.29%）、Δ-杜松烯（6.28%）；‘大紅’葉的主要揮發(fā)性成分有6,6-三甲基-(1θ)-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯（20.37%）、β-石竹烯（19.53%）、α-蒎烯（8.14%）、γ-桉葉醇（6.58%）；‘紫黑’根的主要揮發(fā)性成分有β-石竹烯（14.26%）、白菖烯（8.66%）、Δ-杜松烯（7.52%）、β-廣藿香烯（5.32%）；‘紫黑’莖的主要揮發(fā)性成分有β-石竹烯（17.51%）、萘,1,2,3,7,8,8a-六氫-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)-(1R,8aS)-（7.61%）、左旋-α-蒎烯（7.49%）、左旋-β-蒎烯（7.26%）、A-畢橙茄醇（6.69%）、Δ-杜松烯（6.36%）；‘紫黑’葉的主要揮發(fā)性成分有3-蒈烯（20.97%）、β-石竹烯（14.44%）、α- 蒎烯（11.11%）、3,7,11,11-四甲基雙環(huán)[8.1.0]2,6-十一二烯（6.09%）、橙花叔醇（6.02%）；‘虎綠’根的主要揮發(fā)性成分有β- 石竹烯（18.78%）、Δ- 杜松烯（11.38%）、萘,十氫-4a-甲基-1-亞甲基-7-(1-甲基亞乙基)-, (4aR-反式)-（7.63%）、α-古巴烯（5.86%）、1-萘酚,1,2,3,4,4a,7,8,8a-八氫-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)-,[1S-(1a,4a,4aa,8aa)]-（5.25%）；‘虎綠’莖的主要揮發(fā)性成分有β-石竹烯（27.65%）、γ-桉葉醇（10.28%）、β-蒎烯（7.58%）、2-((4aR)-1,2,3,4,4α,5,6,7-八氫-4α,8-二甲基萘-2-基)-丙-2-醇（6.08%）、橙花叔醇（5.54%）；‘虎綠’葉的主要揮發(fā)性成分有β-石竹烯（23.60%）、Δ-杜松烯（11.19%）、1-萘酚,1,2,3,4,4a,7,8,8a-八氫-1,6-二甲基-4-(1- 甲基乙基)-,[1S-(1a,4a,4aa,8aa)]-（6.46%）、(-)-g-欖香烯（5.51%）、2-異丙基-4a,8-二甲基-1,2,3,4,4a,5,6,7-辛烷萘（5.23%）。

表2 3 個品系黑老虎各器官精油揮發(fā)性成分及其相對含量?Table 2 Volatile components and relative contents of essential oils from different organs of three K.coccinea strains %

圖1 3 個品系黑老虎各器官精油揮發(fā)性成分的豐度Fig.1 Abundance of volatile components in essential oils of different organs of three K.coccinea strains

續(xù)表2Continuation of table 2

續(xù)表2Continuation of table 2

2.3 不同品系黑老虎各器官精油品質(zhì)

2.3.1 各種揮發(fā)性成分的數(shù)量

‘紫黑’‘大紅’‘虎綠’3 個品系黑老虎根、莖、葉中各種揮發(fā)性成分的數(shù)量如圖2 所示。由圖2可知，3 個品系黑老虎根精油的揮發(fā)性成分以烴類為主，有34 ～36 種，其次為醇類，有10 ～14 種，萘類有1 ～5 種，其他類有4 ～8 種；莖精油的揮發(fā)性成分以烴類為主，有18 ～28 種，其次為醇類，有7～14種，萘類有4～6種，其他類有2～5種；葉精油的揮發(fā)性成分以烴類為主，有24 ～29種，其次為醇類，有8 ～14 種，萘類有5 ～6 種，其他類有2 ～5 種?？傮w上看，在揮發(fā)性成分中，烴類數(shù)量所占比例最高，可達(dá)50.0%～64.4%；黑老虎莖精油的揮發(fā)性成分種類的數(shù)量較根、葉少。

圖2 3 個品系黑老虎不同器官中各種揮發(fā)性成分的數(shù)量Fig.2 Number of volatile components in roots, stems and leaves of three K.coccinea strains

2.3.2 各種揮發(fā)性成分的相對含量

‘紫黑’‘大紅’‘虎綠’3 個品系黑老虎不同器官中各種揮發(fā)性成分的相對含量如圖3 所示。由圖3 可知，3 個品系黑老虎根精油的揮發(fā)性成分以烴類為主，相對含量為64.68%～72.77%，醇類和萘類相對含量分別為8.71%～10.92%、3.55%～15.59%，其中‘虎綠’根精油的萘類相對含量分別是‘大紅’‘紫黑’的4.39、2.47 倍。3 個品系黑老虎莖精油的揮發(fā)性成分以烴類為主，相對含量為56.24%～78.05%，醇類和萘類相對含量分別為8.03%～32.31%、3.41%～16.15%，其中‘大紅’莖精油的烴類相對含量分別是‘紫黑’‘虎綠’的1.34、1.39 倍，‘虎綠’莖精油的醇類含對含量分別是‘大紅’‘紫黑’的4.02、1.88 倍，‘紫黑’莖精油的萘類相對含量分別是‘大紅’‘虎綠’的4.74、2.50 倍。3 個品系黑老虎葉精油的揮發(fā)性成分以烴類為主，相對含量為60.18%～75.25%，醇類和萘類相對含量分別為14.71%～20.93%、5.07%～12.20%，其中‘虎綠’葉精油的萘類相對含量分別是‘大紅’‘紫黑’的2.41、2.17 倍?？傮w上看，在揮發(fā)性成分中，烴類相對含量最高，在不同品系或器官間存在一定差異。

圖3 3 個品系黑老虎不同器官中各種揮發(fā)性成分的相對含量Fig.3 Relative content of volatile components in roots, stems and leaves of three K.coccinea strains

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，不同品系黑老虎各器官精油的提取率存在顯著性差異，‘紫黑’‘大紅’‘虎綠’3個品系黑老虎根精油提取率為0.439%～0.543%，莖精油提取率為0.114%～0.141%，葉精油提取率為0.213%～0.327%，總體上各器官精油提取率由高到低依次為根、葉、莖。GC-MS 分析結(jié)果表明，3個品系黑老虎各器官共有116種揮發(fā)性成分，其中，‘大紅’根、莖、葉中分別鑒定出化學(xué)成分53、36、45 種，‘紫黑’根、莖、葉中分別鑒定出化學(xué)成分58、36、51 種，‘虎綠’根、莖、葉中分別鑒定出化學(xué)成分58、51、45 種。3 個品系黑老虎根、莖、葉精油的揮發(fā)性成分以烴類為主，有16～36種，相對含量為56.24%～78.05%，代表成分有β-石竹烯、α-蒎烯、Δ-杜松烯、左旋-β-蒎烯等；其次為醇類，有7 ～14 種，相對含量為8.71%～32.31%，代表成分有γ-桉葉醇、橙花叔醇、A-畢橙茄醇等；萘類有1 ～6 種；其他類有2 ～8 種。

植物根、莖、葉等器官的精油提取率與植物種類、提取劑種類、提取時間、提取溫度等因素有關(guān)[16]。毛日文等[17]采用超臨界流體CO2提取法對南五味子果實揮發(fā)油進(jìn)行提取，其提取率為8.2%；林雄平等[18]使用無水乙醇對南五味子根、莖、葉中活性物質(zhì)進(jìn)行提取，提取率為10.15%～17.44%；楊艷等[13]采用水蒸氣蒸餾法對黑老虎根、莖、葉中揮發(fā)油進(jìn)行提取，提取率為0.534%～0.630%。本研究中，3 個品系黑老虎精油提取率為0.114%～0.543%，與楊艷等[13]報道的研究結(jié)果相近。

彭富全等[19]對黑老虎莖段（去除木心）的揮發(fā)性成分進(jìn)行了鑒定，得出其主要成分為萜烯類化合物，如石竹烯、欖香烯、蒎烯、古巴烯等。本研究中對3 個品系黑老虎根、莖、葉精油的揮發(fā)性成分進(jìn)行了GC-MS 鑒定，結(jié)果表明其主要成分為烴類，有16 ～36 種，相對含量為56.24%～78.05%，主要包括β-石竹烯、Δ-杜松烯、蒎烯、蓽澄茄烯等，其次為醇類，有7 ～14 種，相對含量為8.71%～32.31%，主要包括γ-桉葉醇、橙花叔醇等。烴類成分的種類及其含量與彭富全等[19]、石焱芳等[20]報道的研究結(jié)果相似，但醇類成分有較大差異。

3 個品系黑老虎根、莖、葉精油的主要揮發(fā)性成分具有一定的保健和藥用功效。石竹烯對于治療皮膚炎癥具有良好效果，也是治療慢性支氣管炎藥物的有效成分之一[21]。本研究結(jié)果表明，3 個品系黑老虎各器官精油中石竹烯的相對含量為14.44%～27.65%，具有良好的開發(fā)利用價值。蒎烯具有止咳、祛痰、抗真菌等功效[22]。本研究結(jié)果表明，3 個品系黑老虎各器官精油中蒎烯的相對含量為6.31%～22.11%，其中‘大紅’莖精油蒎烯的相對含量最高，‘紫黑’葉精油蒎烯的相對含量最高，為藥品或化工的良好原料。本試驗中所研究黑老虎的品系和產(chǎn)地的數(shù)量有限，下一步可增加黑老虎品系數(shù)量，并對不同產(chǎn)地黑老虎進(jìn)行精油提取和成分研究。