電針干預(yù)對LPS 誘導(dǎo)帕金森病小鼠黑質(zhì)NADPH 氧化酶表達(dá)的影響

亢愷雯 尹發(fā)明 王 淵 袁 偉 魯 剛 白秋菊 王 強(qiáng)

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽 712046；2.青島市中醫(yī)醫(yī)院康復(fù)科，山東青島 266000；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，陜西咸陽 712046

帕金森?。≒arkinson disease，PD）又稱為震顫麻痹，多好發(fā)于中老年人，其發(fā)病率隨著年齡增長逐年升高[1]。臨床發(fā)現(xiàn)PD 大部分為散發(fā)，約20%患者有家族遺傳史[2]。其典型臨床表現(xiàn)為肌肉強(qiáng)直、運動遲緩、震顫等運動系統(tǒng)癥狀，部分患者存在嗅覺障礙[3]。病理表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大量丟失，紋狀體內(nèi)多巴胺水平顯著降低[4]。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）是小膠質(zhì)細(xì)胞激活后產(chǎn)生的氧化酶。胞質(zhì)內(nèi)的亞基p47phox 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜與p22phox 共同產(chǎn)生損傷神經(jīng)元的超氧自由基O2-[5-6]。LPS 來源于細(xì)胞壁，可激活小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子損傷黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元[7]。本研究擬通過經(jīng)鼻滴注脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）構(gòu)建小鼠PD 模型，觀察“嗅三針”對PD 小鼠黑質(zhì)區(qū)NADPH 氧化酶亞基p22phox 及p47phox 蛋白表達(dá)的影響，探究“嗅三針”對PD 小鼠的抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取40 只6～8 周清潔級成年健康雄性質(zhì)量22～25 g 的C57BL/6 小鼠，恒溫22℃，濕度40%～70%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。動物由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供，實驗使用許可證號：SYXK（陜）2018-001，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2020-001。對動物處理遵循2006 年國家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定[8]。

1.2 試劑與儀器

LPS（美國Sigma 公司，批號：SV30010）；芐絲肼（美國Sigma 公司，批號：FSP100）；左旋多巴（美國Sigma 公司，批號：GKT137831）；抗p47phox 抗體兔來源多克?。ㄓ鴄bcam，批號：ab166930）；抗p22phox抗體兔來源多克?。ㄓ鴄bcam，貨號：ab75941）；SABC（兔IgG）免疫組織化學(xué)試劑盒（英國abcam，批號：SA1022）；DAB 顯色劑（biosharp，貨號：AR1022）；BA200Digital 數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)；組織切片機(jī)（德國Leica 公司）；SDZ-Ⅱ型電針儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；小動物呼吸機(jī)（瑞沃德R407）。

1.3 模型制備

按照隨機(jī)數(shù)字表法將40 只小鼠分為空白組、模型組、左旋多巴組、電針組，每組10 只，對除空白組外的小鼠進(jìn)行造模。氣體乙醚麻醉小鼠后，提起頸部，將10 μl LPS（濃度：1 g/L，溶于0.9%氯化鈉溶液中）用移液槍緩慢滴加入鼻孔。每日1 次，共1 個月，出現(xiàn)PD體征視為造模成功。空白組滴入等量的0.9%氯化鈉溶液[9]。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 電針組 參照《實驗針灸學(xué)》進(jìn)行穴位定位[10]，“印堂”穴：內(nèi)眥連線中點上2 mm 處?！坝恪毖ǎ罕乔煌鈧?cè)向上被毛分界處。迎香穴為斜刺，指向內(nèi)上方約30°角，印堂穴為平刺，指向鼻根，進(jìn)針均為3 mm。參數(shù)設(shè)置：疏密波，頻率為2 Hz/100 Hz；正極接印堂穴，負(fù)極接迎香穴（每側(cè)10 min，共20 min），電流強(qiáng)度為1 mA；電針干預(yù)與造模當(dāng)日同步進(jìn)行，每日1 次，5 d為1 個療程，療程間休息2 d，總共2 個療程。

1.4.2 左旋多巴組 每日定時腹腔注射0.2 ml 復(fù)方左旋多巴注射液（2.5 mg/kg 的芐絲肼與10 mg/kg 的左旋多巴共同溶解于0.9%氯化鈉溶液中），每日1 次，5 d為1 個療程，療程間休息2 d，總共2 個療程。

1.4.3 模型組及空白組 模型組與空白組進(jìn)行與電針組和左旋多巴組相同程度的抓取，不對其固定及進(jìn)行其他干預(yù)。

1.5 行為學(xué)檢測方法

自發(fā)交替行為（spontaneous alternation behavior，SAB）測試：采用Y-maze 裝置在黑暗環(huán)境中對小鼠進(jìn)行自發(fā)交替行為的探索和空間記憶能力的評估。實驗前30 min 暗適應(yīng)。將小鼠放入Y-maze 的任一臂中，閉合上方遮光擋板，觀察并記錄其活動情況。每只小鼠測試1 次，每次10 min，記錄其進(jìn)入不同臂的順序，統(tǒng)計總進(jìn)臂次數(shù)及正確率。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測p22phox 及p47phox 蛋白的表達(dá)

4%多聚甲醛固定小鼠腦組織，包埋后以5 μm 厚度連續(xù)切片（黑質(zhì)部分），烘干處理。脫蠟水化，放入檸檬酸抗原修復(fù)液中，中火15 min，PBS 清洗，封閉，孵育一抗：抗p22phox（濃度1∶100），抗p47phox（濃度1∶50），4℃過夜。室溫放置30 min 后PBS 沖洗，孵育二抗，PBS 沖洗，滴加SABC 1 h，加顯色劑DAB 在暗處避光顯色。沖洗后蘇木精復(fù)染1 min，脫水后透明封片，鏡下觀察陽性細(xì)胞數(shù)目并拍片。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠自發(fā)交替行為測試結(jié)果比較

與空白組比較，模型組總進(jìn)臂次數(shù)及正確率均明顯減少（P ＜0.01）；與模型組比較，電針組總進(jìn)臂次數(shù)增加，正確率提高（P ＜0.05）。見圖1。

2.2 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)p22phox 及p47phox 蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組黑質(zhì)區(qū)p47phox、p22phox蛋白陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增加（P ＜0.01）；與模型組比較，電針組中黑質(zhì)區(qū)p47phox、p22phox 蛋白陽性細(xì)胞數(shù)均降低（P ＜0.05）。見圖2～3。

圖2 各組小鼠黑質(zhì)中p47phox 蛋白表達(dá)比較

圖3 各組小鼠黑質(zhì)中p22phox 蛋白表達(dá)比較

3 討論

NADPH 氧化酶的功能為傳遞細(xì)胞間信號、改善記憶，其胞膜含催化亞基p22phox，胞漿含調(diào)節(jié)蛋白p47phox 等[11-12]。激活時p47phox 磷酸化并結(jié)合p22phox導(dǎo)致胞質(zhì)蛋白移位至胞膜形成酶活性復(fù)合物[13]，傳遞電子形成超氧化物并產(chǎn)生活性氧自由基（reactive oxyradical，ROS）[14]。本研究結(jié)果顯示p47phox、p22phox在LPS 誘導(dǎo)的PD 模型中表達(dá)增加，電針干預(yù)可減少關(guān)鍵性調(diào)節(jié)亞基表達(dá)。

PD 患者黑質(zhì)細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激損傷[15]，氧化應(yīng)激可促進(jìn)致病蛋白質(zhì)聚集，干擾自噬[16]。多巴胺代謝失衡可破壞體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)[17]，NADPH 復(fù)合物是細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的主要來源[18]。ROS 激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量毒性物質(zhì)，對神經(jīng)元產(chǎn)生不可逆的損傷[19-21]。小膠質(zhì)細(xì)胞增殖后介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷可導(dǎo)致PD 慢性炎癥[22-23]。在MPP+誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元中加入NADPH 非特異性抑制劑加拿大麻素，可減緩神經(jīng)元損傷[24]。NADPH 氧化酶是潛在的PD干預(yù)靶點[25]，電針干預(yù)可能通過相似機(jī)制作用于PD進(jìn)展。

中醫(yī)認(rèn)為PD 歸于“顫證”“痙病”。迎香穴屬手陽明大腸經(jīng)可治療嗅覺障礙；印堂穴屬督脈可醒腦開竅。本研究結(jié)果顯示，早期電針干預(yù)抑制了NADPH 氧化酶并減弱了氧化應(yīng)激所帶來的損傷，改善了LPS 誘導(dǎo)小鼠的探索和空間記憶能力障礙，為“嗅三針”治療PD 增加新的理論依據(jù)及治療靶向。