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    miR-189 對骨形成的影響及作用機制

    2022-01-20 05:57:32劉星宇
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2021年36期
    關(guān)鍵詞:去勢骨量小梁

    劉星宇 王 杰 石 菲

    1.解放軍總醫(yī)院京中醫(yī)療區(qū)綜合內(nèi)科,北京 100011;2.陜西省西安大興醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科,陜西西安 710000;3.空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)院,陜西西安 710032

    我國是世界上老年人口絕對數(shù)量最多的國家,骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為我國社會的沉重負擔(dān)。因此研究其發(fā)病機制及新型藥物具有重要意義[1-3]。近年來,微RNA(microRNA,miRNA)成為研究熱點,其通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種機制參與到骨質(zhì)疏松等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中[4-6]。研究表明miR-189 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、電離輻射后內(nèi)皮細胞損傷和肺癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用[7-9],而miR-189 對骨質(zhì)疏松的調(diào)控作用不明確。本研究旨在探究miR-189 對骨形成的影響及機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    澳洲胎牛血清(10100147)、DMEM 細胞培養(yǎng)基(31330095)和Lipofectamine 2000(11668030)購自美國Gibco 公司;RNA 抽提盒(639505)、反轉(zhuǎn)錄盒(639549)和擴增盒(639503)購自日本TaKaRa 公司;miR-189序列和引物購自生工生物公司;鈣黃綠素(德國Merck 公司,C0875);RUNX2 抗體(ab32147)、OSX 抗體(ab128873)和抗GAPDH 抗體(ab135745)購自美國abcam 公司。

    1.2 研究方法

    1.2.1 模型建立 利用隨機數(shù)字表法將32 只雌性C57BL/6J 小鼠(動物合格證號SYDWZX 京20200211)分為4組:假手術(shù)組、去勢組、對照組和抑制劑組,每組8只。動物飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)動物房,房內(nèi)溫度18~22℃,濕度50%~60%。在小鼠6 個月齡時,切除卵巢(去勢組)或假手術(shù)(假手術(shù)組)。將miR-189 陰性對照序列(對照組)和抑制劑(抑制劑組)注入去勢小鼠體內(nèi)。本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院動物倫理委員會審核通過(編號20191001006)[10]。

    1.2.2 micro CT 掃描參數(shù)設(shè)置為80 kV 和500 mA。分辨率為10 μm,曝光時間800 ms。取邊長3 mm 的立方體作為感興趣區(qū)域檢測。三維重建,計算參數(shù):骨密度(bone mineral density,BMD)、骨體積與總體積比(bone volume-to-total volume ratio,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(trabecular number,Tb.N)、骨小梁連接密度(connectivity density,Conn.D)和骨小梁分離指數(shù)(trabecular separation,Tb.Sp)[11]。

    1.2.3 RT-qPCR 檢測miRNA 表達量 利用RNAiso 進行骨組織裂解。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng):2.0 μl 5×PrimeScript?Buffer、0.5 μl PrimeScript?RT Enzyme Mix Ⅰ、0.5 μl Bulge-loop RT Primer 和RNA,加水補齊10 μl。反轉(zhuǎn)錄:37℃預(yù)熱15 min;42℃加熱15 min;85℃加熱5 s,得到cDNA。擴增反應(yīng)系統(tǒng):10 μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、1.6 μl 引物、0.4 μl ROX Reference DyeⅡ和2 μl cDNA,加水補齊20 μl。擴增:95℃預(yù)變性30 s;95℃維持5 s,60℃維持34 s,40 個循環(huán)[12]。miR-189 引物序列:正向5’-ACACTCCAGCTGGGTTGCAGCTGCCTGGGAGTGA-3’,反向5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’;U6 引物序列:正向5’-CTTCGGCAGCACATATAC-3’,反向5’-GAACGCTTCACGAATTTGC-3’。

    1.2.4 尾靜脈注射 按照1.5 mg/kg 濃度分別將miR-189 陰性對照序列:5’-GUCAUGAAAACACAUCAUGUUU-3’和miR-189 抑制劑:5’-UCGUCGUAACAUGUCCCGAUACU-3’從尾靜脈注入去勢小鼠體內(nèi)[11]。

    1.2.5 鈣黃綠素染色 小鼠在處死前10 d 和3 d 腹腔注射5 mg/kg 鈣黃綠素。取出股骨,固定,脫水,包埋,切片(避光)。利用熒光顯微鏡計算礦物質(zhì)沉積率(mineral apposition rate,MAR)和成骨率(bone formation rate,BFR)等參數(shù)[13]。

    1.2.6 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 小鼠成骨細胞系ME3T3-E1購自上海細胞庫。分組:轉(zhuǎn)染miR-189 陰性對照序列的對照組、轉(zhuǎn)染抑制劑的抑制劑組和轉(zhuǎn)染模擬序列(5’-AGCAGCCUUGUACAGGGCUAUGA-3’)的模擬物組[11]。轉(zhuǎn)染時miRNA 序列濃度為80 nmol/L。

    1.2.7 Western blot 技術(shù) 利用蛋白酶裂解液制備MC3T3-E1 細胞的蛋白樣本。電泳:95 V 維持30 min;轉(zhuǎn)膜:250 mA 維持2 h;室溫孵育一抗4 h 后沖洗,室溫孵育二抗1 h 后發(fā)光[13]。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    利用SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用t 檢驗,三樣本組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建

    與假手術(shù)組比較,去勢組出現(xiàn)骨微結(jié)構(gòu)退化,去勢組骨小梁骨量顯著降低(BMD 和BV/TV 均下降),骨小梁結(jié)構(gòu)明顯受損(Tb.Th、Tb.N 和Conn.D 降低,而Tb.Sp 升高)(P <0.05)。見圖1。

    圖1 micro CT 檢測骨量變化(n=8)

    2.2 去勢小鼠股骨miR-189 表達情況

    與假手術(shù)組比較,去勢組股骨中miR-189 高表達(P <0.05)。見圖2。

    圖2 RT-qPCR 檢測小鼠股骨中miR-189 的含量(n=8)

    2.3 miR-189 抑制劑對股骨中miR-189 含量的影響

    與對照組比較,抑制劑組股骨中miR-189 低表達(P <0.05)。見圖3。

    圖3 RT-qPCR 檢測各組小鼠股骨組織中miR-189 的含量(n=8)

    2.4 miR-189 抑制劑對去勢小鼠骨丟失的影響

    與對照組比較,抑制劑組骨微結(jié)構(gòu)退化得到部分恢復(fù),抑制劑組小鼠骨小梁骨量增加,骨小梁結(jié)構(gòu)改善(P <0.05)。見圖4。

    圖4 microCT 檢測骨量變化(n=8)

    2.5 miR-189 抑制劑對去勢小鼠骨形成的影響

    與對照組比較,抑制劑組MAR 和BFR 增加(P <0.05)。見圖5。

    圖5 鈣黃綠素染色檢測骨形成(n=8)

    2.6 寡核苷酸效率檢測

    與對照組比較,模擬組miR-189 增加(P <0.05),而抑制劑組降低(P <0.05)。見圖6。

    圖6 q-PCR 檢測細胞中miR-189 含量(n=4)

    2.7 miR-189 抑制劑對成骨指標(biāo)的影響

    與對照組比較,模擬物組RUNX2 和OSX 含量降低(P <0.05),抑制劑組RUNX2 和OSX 含量增加(P <0.05)。見圖7。

    圖7 Western blot 檢測細胞中成骨指標(biāo)(n=4)

    3 討論

    本研究利用卵巢去除構(gòu)建小鼠骨質(zhì)疏松模型,micro CT 檢測建模情況,發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較,去勢小鼠骨量減低、骨微結(jié)構(gòu)退化,這和目前研究報道一致[14-16],隨后又發(fā)現(xiàn)去勢組股骨中miR-189 高表達,這暗示miR-189 可能在骨形成中發(fā)揮調(diào)控作用。為驗證猜想,本研究將miR-189 抑制劑注射入小鼠體內(nèi),RT-qPCR 檢測抑制劑效果,證實在體注射抑制劑后,小鼠股骨miR-189 降低,提示在體內(nèi)應(yīng)用miR-189 有效。

    利用micro CT 檢測miR-189 抑制劑對去勢小鼠骨形成的影響,發(fā)現(xiàn)抑制劑能夠?qū)谷菰斐傻墓莵G失,而成骨細胞發(fā)揮了成骨作用的功能細胞[17-18],為了探究miR-189 的靶點,利用鈣黃綠素染色動態(tài)觀測發(fā)現(xiàn)miR-189 抑制劑能夠促進骨形成。

    RUNX2 是RUNT 基因家族的轉(zhuǎn)錄因子。RUNX2是成骨細胞分化過程中最重要的特異性轉(zhuǎn)錄因子,在成骨細胞分化的起始誘導(dǎo)和后續(xù)功能基因的序貫表達中具有重要調(diào)控作用[19-22]。而OSX 是一類含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。在骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的過程中,OSX 是不可缺少的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子[23-25]。為驗證miR-189 對成骨細胞的作用,發(fā)現(xiàn)miR-189 過表達降低RUNX2 和OSX 含量,而敲低miR-189 增加RUNX2 和OSX 含量。結(jié)果顯示,miR-189 抑制成骨細胞的成骨功能。

    綜上所述,骨質(zhì)疏松小鼠股骨高表達miR-189,而miR-189 可通過抑制成骨細胞功能抑制骨形成。

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