基于重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增-側(cè)流層析試紙條的褐飛虱快速鑒定方法

羅舉 唐健 王愛英 楊保軍 劉淑華

基于重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增-側(cè)流層析試紙條的褐飛虱快速鑒定方法

羅舉 唐健 王愛英 楊保軍 劉淑華*

(中國水稻研究所水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310006；*通信聯(lián)系人，E-mail: liushuhua@caas.cn)

【】針對(duì)測報(bào)燈下褐飛虱鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力這一問題，建立褐飛虱快速定性鑒定技術(shù)。以褐飛虱、偽褐飛虱及擬褐飛虱為材料，篩選褐飛虱特異性引物對(duì)，優(yōu)化基于重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增和側(cè)流層析試紙條檢測方法的快速鑒定體系(RAA-LFD)，并分析其溫度及模板魯棒性。本研究建立的RAA-LFD方法操作簡單、速度快、不依賴于任何精密儀器、體溫可觸發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)，且對(duì)粗組織液模板具有很好的魯棒性。盲樣檢測結(jié)果表明，56個(gè)樣本從樣本獲取到結(jié)果輸出的整個(gè)過程可在45 min內(nèi)完成，準(zhǔn)確率可達(dá)100%。本研究建立的褐飛虱RAA-LFD鑒定技術(shù)可以用于褐飛虱及其近似種的快速區(qū)分，適用于基層植保站或田間地頭對(duì)樣本的現(xiàn)場即時(shí)檢測。

褐飛虱；偽褐飛虱；擬褐飛虱；RAA-LFD；現(xiàn)場即時(shí)檢測

褐飛虱[(St?l)]是亞洲稻區(qū)危害最嚴(yán)重的水稻害蟲之一，不僅可以刺吸汁液為害，還可以傳播病毒病[1-4]。準(zhǔn)確的蟲情預(yù)測預(yù)報(bào)是害蟲防治的關(guān)鍵，褐飛虱測報(bào)主要依賴于人工下田調(diào)查和地面燈誘捕監(jiān)測。人工下田調(diào)查存在勞動(dòng)強(qiáng)度大、效率低、時(shí)效性差、主觀性強(qiáng)等缺點(diǎn)。隨著基層植保工作人員的流失，地面燈誘監(jiān)測受到了植保站及種糧大戶的青睞。測報(bào)燈下褐飛虱的始見日、遷入量、遷入峰是預(yù)測預(yù)報(bào)的關(guān)鍵依據(jù)，也是褐飛虱防治策略制定的關(guān)鍵信息依據(jù)。目前市場上的智慧型測報(bào)燈，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)收集、烘干、傳輸、識(shí)別與計(jì)數(shù)，大大提高了測報(bào)的準(zhǔn)確度和時(shí)效性，節(jié)省了人力物力。然而，所有的基于RGB圖像識(shí)別原理的智慧型測報(bào)燈對(duì)昆蟲同屬近似種的分類鑒定無能為力，后期仍需大量人力介入。

偽褐飛虱[China]和擬褐飛虱[(Muir)]是褐飛虱的同屬近似種，屬于半翅目(Hemiptera)飛虱科(Delphacidae)褐飛虱屬(Distant)。偽褐飛虱和擬褐飛虱并不取食水稻，而是以禾本科的游草()和秕谷草()為最適宜寄主[5]。在人為干預(yù)下，兩者雖可在水稻上完成世代發(fā)育，但種群趨勢指數(shù)分別為0.2和0.02，不能持續(xù)繁衍[5]。然而，偽褐飛虱、擬褐飛虱與褐飛虱具有廣泛的共同分布區(qū)域，發(fā)生季節(jié)也有交叉(4月－10月)，且都具有撲燈習(xí)性，對(duì)預(yù)測預(yù)報(bào)的準(zhǔn)確性造成了嚴(yán)重影響[6, 7]。褐飛虱、偽褐飛虱和擬褐飛虱形態(tài)、體色和外部特征均非常相似，肉眼難以區(qū)分，需專業(yè)人員借助于顯微鏡才能鑒別[8]。顯微鏡下的分類特征主要有3個(gè)方面，分別為顏面、雌性外生殖器和雄性外生殖器[9]。人工進(jìn)行褐飛虱屬近似種鑒定耗時(shí)費(fèi)力，對(duì)人員專業(yè)技能要求高，且不能鑒別殘缺的飛虱個(gè)體。因此，亟需研發(fā)快速、簡便、準(zhǔn)確的分類鑒定方法。

基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)的核酸檢測為物種的鑒定提供了新的手段，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的諸多不足，可以檢測物種間及同種個(gè)體間的細(xì)微差別。崔亞麗[10]曾利用核糖體間隔區(qū)基因(Ribosomal intergenic spacer, ITS)設(shè)計(jì)引物，初步建立了褐飛虱、擬褐飛虱和偽褐飛虱的多重PCR檢測技術(shù)(需PCR儀+電泳儀)，由于是以純基因組DNA為模板，具有耗時(shí)長、耗費(fèi)大等缺點(diǎn)。Liu等[11]在此基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)引物對(duì)，以加水研磨的粗組織液為模板建立了三種飛虱的直接多重PCR檢測方法，該方法不需要提取DNA，將檢測時(shí)間大大縮短。這兩種方法雖然都能準(zhǔn)確鑒定褐飛虱，但都依賴于昂貴的儀器設(shè)備(PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀)，不易推廣應(yīng)用。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)是Piepenburg等[12]于2006年提出的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，無需昂貴精密的儀器，在37℃～42℃恒溫下即可完成指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，與側(cè)流層析試紙條(lateral flow dipstick, LFD)結(jié)合應(yīng)用能實(shí)現(xiàn)裸眼可視化檢測，非常適用于臨床以及室外的檢測與分析。重組酶介導(dǎo)的擴(kuò)增(Recomninase Aided Amplification, RAA)技術(shù)與RPA擴(kuò)增原理相似，是國內(nèi)公司開發(fā)的一種技術(shù)，兩者的區(qū)別在于重組酶的來源不同，RPA重組酶來源于T4噬菌體，RAA重組酶來源于細(xì)菌或真菌[13]。近幾年，RAA技術(shù)也逐漸被大眾所認(rèn)知和應(yīng)用[14-16]。

本研究通過篩選常見的條形碼基因，建立了以線粒體細(xì)胞色素b基因(Mitochondrial cytochrome b,)為檢測靶標(biāo)的褐飛虱RAA+LFD快速鑒定方法，評(píng)價(jià)了其特異性與靈敏度，分析了其溫度適用范圍與模板質(zhì)量魯棒性，并對(duì)隨機(jī)盲樣進(jìn)行了檢測體系效果評(píng)估。該方法簡單、快速、靈敏，將很大程度上減輕植保工作人員工作量，提高褐飛虱預(yù)測預(yù)報(bào)工作的準(zhǔn)確度及時(shí)效性，為精準(zhǔn)綠色防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)室收集保存的2017－2018年度廣西昭平、湖南邵東、江西萬安和浙江富陽的褐飛虱、擬褐飛虱和偽褐飛虱干蟲樣本。粗組織液制備方法：取單頭待測飛虱放入1.5 mL離心管中，加入200 μL ddH2O，手動(dòng)研磨或自動(dòng)研磨機(jī)研磨，自動(dòng)研磨機(jī)的參數(shù)為8 HZ×60 s。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

研磨機(jī)(LC-TG-48，上海力辰邦西儀器科技有限公司)；恒溫金屬?。荒z電泳儀(DYCP-31DN，中國六一公司)；凝膠成像系統(tǒng)(V140130，美國Bio-Rad公司)；酶試劑盒(KME-101，日本TOYOBO公司)；電泳法RAA擴(kuò)增試劑盒(RAA-basic)(B00000，江蘇奇天基因公司)；試紙條法RAA擴(kuò)增試劑盒(RAA-nfo)(T00001，江蘇奇天基因公司)；試紙條法RPA擴(kuò)增試劑盒(RPA-nfo) (TANFO02kit，英國TwistDx公司)；LFD試紙條(MGHD 1，德國Milenia Biotec公司)。

1.3 引物探針設(shè)計(jì)與篩選

根據(jù)NCBI中登錄的褐飛虱(JX880069.1)、偽褐飛虱(NC_024627.1)和擬褐飛虱(NC_033388.1)的線粒體基因組序列，參照文獻(xiàn)尋找并提取COI及Cytb基因序列[17]，使用Vector NTI 11.5.1軟件進(jìn)行序列比對(duì)，在種間變異區(qū)及種內(nèi)保守區(qū)設(shè)計(jì)RPA/RAA引物及探針。參考Liu等[11]報(bào)道的ITS序列以同樣的方法設(shè)計(jì)引物和探針。因?yàn)镽PA技術(shù)還沒有成熟的引物設(shè)計(jì)輔助軟件，本研究中引物和探針主要是參照英國TwistDx公司網(wǎng)站(http://www.twistdx. co.uk)的注意事項(xiàng)進(jìn)行人工設(shè)計(jì)。本研究所用的引物及探針序列見表1，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RPA引物設(shè)計(jì)原則為：引物長度30～35 bp；避免5＇端長的G序列，否則會(huì)影響重組酶與引物結(jié)合；推薦3＇端用G、C序列；自由能應(yīng)＜4 kcal /mol。以褐飛虱基因組DNA(10 ng /μL)為模板，參照電泳法RAA試劑盒(RAA-basic)說明書的體系及方法進(jìn)行檢測。具體如下：ddH2O 17.5 μL、正向引物(10 μmol/L)2.0 μL、反向引物(10 μmol/L)2.0 μL、不含引物的水化緩沖液(Primer Free Rehydration buffer )25.0 μL、DNA 1 μL，最后加入乙酸鎂2.5 μL觸發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：37℃下恒溫?cái)U(kuò)增30 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入等體積的苯酚/氯仿混合液(1∶1)，劇烈渦旋混勻后12000 r/min下離心3 min，取上清液進(jìn)行電泳檢測。

表2 樣本收集地點(diǎn)

篩選出引物對(duì)后，設(shè)計(jì)RAA探針，設(shè)計(jì)原則為：長46～52 bp；在距5＇端最短30 bp，距3＇端最短15 bp處堿基由四氫呋喃(THF)替代；5＇端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)。另外，需重新合成有生物素標(biāo)記的下游引物，以用于后續(xù)基于三明治法原理的側(cè)向流試紙條檢測[18]。以褐飛虱基因組DNA(10 ng /μL)為模板，參照RAA-nfo試劑盒說明書的體系及方法進(jìn)行檢測。具體如下：ddH2O 16.7 μL、正向引物(10 μmol/L)2.1 μL、反向引物(10 μmol/L)2.1 μL、探針(10 μmol/L)0.6μL、不含引物的水化緩沖液(Primer Free Rehydration buffer )25.0 μL、DNA 1 μL，最后加入乙酸鎂2.5 μL觸發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：39℃恒溫?cái)U(kuò)增20 min。反應(yīng)結(jié)束后，取2.5 μL反應(yīng)液與97.5 μL試紙條擴(kuò)展緩沖液(Milenia GenLine Dipstick Aassay Buffer)混合，再將試紙條垂直放置于此混合液中，室溫放置2 min后觀察結(jié)果。剩余的反應(yīng)液亦可參照上述方法進(jìn)行電泳檢測。RPA-nfo試劑盒加樣體系及反應(yīng)條件與RAA-nfo試劑盒大致相同。

1.4 特異性檢測

分別以褐飛虱、偽褐飛虱、擬褐飛虱的基因組DNA(10 ng /μL)為模板，參照1.3的體系及方法進(jìn)行RAA擴(kuò)增，并用電泳法和試紙條法檢測以評(píng)價(jià)反應(yīng)體系的特異性。

1.5 靈敏度測定

將褐飛虱基因組DNA 10×梯度稀釋為100 fg/μL、1 pg/μL、10 pg/μL、100 pg/μL、1 ng/μL，在39℃×20 min擴(kuò)增條件下評(píng)價(jià)所建立RAA-LFD反應(yīng)體系的靈敏度。

1.6 檢測條件適用范圍分析

分別以33℃、35℃、37℃、39℃和41℃為反應(yīng)條件，以褐飛虱基因組DNA(50 ng/μL)和粗組織液為模板，評(píng)價(jià)所建立RAA-LFD方法的適用溫度范圍及模板魯棒性，并分析了體溫觸發(fā)擴(kuò)增的可行性。在39℃下，以褐飛虱粗組織研磨液為模板，分別擴(kuò)增4 min、8 min、12 min及16 min，在保證檢出率的情況下評(píng)價(jià)所建立RAA-LFD方法的最短擴(kuò)增時(shí)長。

1.7 盲樣測試評(píng)價(jià)

使用優(yōu)化的RAA-LFD方法對(duì)取自2017與2018年度不同地區(qū)的褐飛虱及其他飛虱共56個(gè)樣本(表2)進(jìn)行測試，并與專家形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果比較，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度及實(shí)用價(jià)值。另外，粗略對(duì)比評(píng)估了RPA-nfo與RAA-nfo試劑的擴(kuò)增活性。

A－RAA-LFD擴(kuò)增引物篩選；B－RAA-LFD檢測探針驗(yàn)證。+代表褐飛虱基因組DNA；-代表ddH2O。

Fig. 1. Primer and probe selection for RAA-LFD method.

Nl－褐飛虱；Nm－偽褐飛虱；Nb－擬褐飛虱。粗字體序列代表P4引物位置，下劃線序列代表探針位置。

Fig. 2. Multiple alignment ofgenes fromand its two sibling species.

2 結(jié)果與分析

2.1 引物與探針的確定

根據(jù)RAA引物設(shè)計(jì)原則，針對(duì)褐飛虱ITS1、COI及Cytb條形碼基因保守區(qū)段共設(shè)計(jì)了4組引物(表1)，分別為P1～P4。以RAA-basic試劑盒進(jìn)行引物篩選，結(jié)果表明(圖1-A)，4組引物都能擴(kuò)增出單一特異條帶，但P1/P2/P3的空白對(duì)照雜帶較亮，因此選定P4引物對(duì)進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。參照探針設(shè)計(jì)原則，人工設(shè)計(jì)了試紙條法檢測用探針，同時(shí)重新合成帶有生物素標(biāo)記的P4下游引物Cytb-326-R30-Bio(表1)。在39℃×20 min擴(kuò)增條件下，基于P4引物對(duì)的RAA-LFD法可以出現(xiàn)明顯的檢測線(圖1-B)，說明探針設(shè)計(jì)正確。P4引物對(duì)與三種飛虱的基因序列多序列比對(duì)結(jié)果及引物探針位置如圖2。

Nl－褐飛虱；Nm－偽褐飛虱；Nb－擬褐飛虱；F－雌成蟲；M－雄成蟲。

Nl,; Nm,; Nb,; F, Female adult; M, Male adult.

圖3 基于P4引物對(duì)的RAA-LFD方法特異性分析結(jié)果

Fig. 3. Specificity analysis of the RAA-LFD method based on P4 primer.

2.2 RAA-LFD法檢測特異性的確定

因?yàn)楸狙芯磕康氖呛Y選近似種快速鑒定定性引物，所以首先驗(yàn)證了P4引物對(duì)的特異性。以褐飛虱、偽褐飛虱及擬褐飛虱的基因組DNA為模板(10 ng/μL)，RAA-LFD試劑在39℃×20 min擴(kuò)增條件下，褐飛虱雌、雄蟲都有明顯檢測線與質(zhì)控線，偽褐飛虱和擬褐飛虱都只有質(zhì)控線(圖3)。以上結(jié)果表明，P4引物對(duì)具有物種特異性，可以很好地區(qū)分褐飛虱及其近似種。

2.3 RAA-LFD法檢測靈敏度的分析

在39℃×20 min擴(kuò)增條件下，以10×稀釋的褐飛虱基因組DNA為模板測定P4引物對(duì)的靈敏度。結(jié)果表明，當(dāng)模板濃度為10 pg/μL時(shí)試紙條上可見明顯的檢測線，且模板濃度越高，檢測帶顏色越深(圖4)，說明所建立的RAA-LFD法最低檢測線為10 pg/μL。因?yàn)楸狙芯康哪康氖呛Y選快速簡便的定性鑒定引物，所以對(duì)其靈敏度要求不高，10 pg/μL的檢測靈敏度足可滿足物種鑒定要求。

2.4 RAA-LFD法檢測條件范圍的確定

本研究目的是建立可用于實(shí)驗(yàn)室外的、簡單快速的定性鑒定技術(shù)，因此評(píng)估了所建立RAA-LFD方法的適用范圍，包括擴(kuò)增溫度、模板質(zhì)量和擴(kuò)增時(shí)長。以基因組DNA(50 ng/μL)為模板，測定了RAA-LFD法在不同溫度下的檢測能力，包括33℃、35℃、37℃、39℃和41℃。溫度范圍篩選結(jié)果表明，基于P4引物對(duì)建立的RAA -LFD法在33～41℃都具有較好的檢測效果(圖5-A)。不借助任何加熱模塊，本實(shí)驗(yàn)室兩名工作人員通過將PCR管握在手心20 min，亦可高效完成擴(kuò)增與準(zhǔn)確檢測。為了提高檢測效率，以褐飛虱粗組織液(2017年雄成蟲樣本)為模板測定了RAA-LFD法在39℃下擴(kuò)增4 min、8 min、12 min及16 min后的檢測效果。擴(kuò)增時(shí)長實(shí)驗(yàn)表明，RAA -LFD試劑在擴(kuò)增4 min時(shí)有模糊檢測線，8 min時(shí)檢測線即清晰可見(圖5-B)。

圖4 基于P4引物對(duì)的RAA-LFD方法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Fig. 4. Sensitivity analysis of the RAA-LFD method based on P4 primer.

2.5 盲樣測試評(píng)價(jià)結(jié)果

為評(píng)估該RAA-LFD檢測體系的實(shí)際應(yīng)用效果，對(duì)取自2017、2018年度4個(gè)不同省份的共56個(gè)飛虱盲樣進(jìn)行檢測(表2)。結(jié)果表明，其中19個(gè)樣本檢測為褐飛虱，37個(gè)樣本為非褐飛虱，與人工鑒定結(jié)果完全一致，檢出率與準(zhǔn)確率均達(dá)到100%。本研究中，利用高通量組織研磨儀制備樣本粗組織液1～2 min，39℃下恒溫?cái)U(kuò)增8 min，試紙條檢測2 min，單樣本從樣本獲取到結(jié)果輸出的整個(gè)過程可在20 min內(nèi)完成，56個(gè)樣本可在45 min內(nèi)完成。為了篩選更優(yōu)的試劑，本研究粗略對(duì)比了國產(chǎn)RAA-nfo試劑與進(jìn)口RPA-nfo試劑的擴(kuò)增活性。結(jié)果表明，在相同的擴(kuò)增溫度與時(shí)長下，RAA-nfo試劑擴(kuò)增活性略低于RPA-nfo試劑。采用RPA-LFD法，單樣本檢測時(shí)間可在15 min內(nèi)完成，56個(gè)樣本可在40 min內(nèi)完成，部分對(duì)比結(jié)果見圖6。

3 討論

本研究以條形碼基因?yàn)檫z傳標(biāo)記，建立了基于恒低溫核酸擴(kuò)增及可視化檢測的褐飛虱快速鑒定方法，即RAA-LFD法(重組酶聚合酶擴(kuò)增-側(cè)流層析試紙條法)。該方法在33～41℃溫度范圍內(nèi)對(duì)褐飛虱都有很好的檢測效果，且可以脫離加熱模塊由體溫觸發(fā)擴(kuò)增；具有較好的模板魯棒性，可高效擴(kuò)增樣本粗組織液；檢測迅速，56個(gè)樣本可在45 min內(nèi)完成；大樣本盲樣檢測結(jié)果表明，該方法對(duì)褐飛虱的檢出率及準(zhǔn)確率均為100%；最低檢測限為10 pg/μL。該檢測方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、易操作、反應(yīng)快速，能擺脫對(duì)大型專業(yè)儀器、專業(yè)操作人員及實(shí)驗(yàn)室的依賴，在基層植保站或種糧大戶，尤其在野外及現(xiàn)場檢測中具有應(yīng)用潛力。

A－擴(kuò)增溫度分析；B－擴(kuò)增時(shí)長分析。Nl－褐飛虱，Nm－偽褐飛虱，Nb－擬褐飛虱。

Fig. 5. Applicability analysis of the RAA-LFD method based on P4 primer.

Nl－褐飛虱；Nm－偽褐飛虱；Nb－擬褐飛虱。

Fig. 6. Amplification ability analysis between RPA-nfo and RAA-nfo reagents.

近年來，恒溫PCR法在現(xiàn)場即時(shí)檢測(Point of Care Testing, POCT)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，主要包括醫(yī)療衛(wèi)生、食品安全及環(huán)境檢測領(lǐng)域[19-24]。目前，恒溫PCR技術(shù)也逐漸應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)和RPA/RAA技術(shù)。RPA/RAA擴(kuò)增后一般有3種檢測方法，有瓊脂糖凝膠電泳法、熒光定量法和試紙條法[18]。馮黎霞等[25]建立了基于RPA-電泳檢測技術(shù)的玉米褪綠斑駁病毒速測方法；謝實(shí)龍等[26]建立了轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系的實(shí)時(shí)熒光檢測方法；王燕等[27]建立了基于RPA-LFD技術(shù)的櫻桃病毒A(CVA)的速測方法。一般情況下，實(shí)時(shí)熒光定量與試紙條法檢測靈敏度高于電泳法。本研究目標(biāo)是建立簡單快速、適用于田間地頭的褐飛虱現(xiàn)場鑒定技術(shù)，因此選擇了可裸眼觀察的試紙條法。RPA/RAA結(jié)合LFD或熒光實(shí)時(shí)檢測系統(tǒng)，最低檢測線可達(dá)到8～10拷貝/反應(yīng)[21, 28]或20 fg/μL[29]。近年來，科學(xué)家們創(chuàng)新性地引入了CRISPR檢測技術(shù)，將基因檢測靈敏度提高到了單分子水平。張鋒實(shí)驗(yàn)室建立了檢測登革熱和寨卡病毒的SHERLOCK系統(tǒng)[30]；Jennifer Doudna實(shí)驗(yàn)室建立了檢測人乳頭瘤病毒的DETECTR系統(tǒng)[31]。SHERLOCK和DETECTR分別利用Cas13和Cas12a對(duì)鄰近ssRNA和ssDNA的切割降解來激活報(bào)告基團(tuán)。隨后通過對(duì)報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行測定，即可確定感興趣的DNA、RNA或突變是否存在[30, 31]。王永明團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將RPA擴(kuò)增與結(jié)果檢測環(huán)節(jié)整合，建立了一步法支原體的可視化檢測Cas12aVDet系統(tǒng)，降低了操作復(fù)雜度及交叉污染風(fēng)險(xiǎn)[32]。本研究目標(biāo)是建立褐飛虱的快速定性檢測方法，即使是殘缺蟲體也含有足夠的模板DNA。本研究所建立方法的最低檢測限為10 pg/μL，雖然低于SHERLOCK、DETECTR及Cas12aVDet系統(tǒng)，但亦能保證檢出率及準(zhǔn)確率均達(dá)100%。

RPA/RAA引物長度一般要求30～35 bp，但有多項(xiàng)研究表明19～29 bp長度的引物也有較好的擴(kuò)增效果。趙巧雅等[33]建立了兔源肺炎克雷伯氏菌的RPA檢測方法，其上下游引物分別為21 bp、19 bp，檢測靈敏度為8.3×101CFU/mL，是傳統(tǒng)PCR的100倍；王秋平等[34]應(yīng)用RPA建立了煙曲霉菌速測方法，其上下游引物分別為25 bp、26 bp。由此可見，某些情況下可用普通PCR引物進(jìn)行RPA/RAA擴(kuò)增。本研究所篩選的引物長度分別為29 bp和30 bp，具有較高的擴(kuò)增活性及特異性，未進(jìn)行其他長度引物特性的比較分析。相對(duì)于LAMP方法需要4～6條引物不同，RPA/RAA方法只需要2條引物，因此更容易進(jìn)行多重檢測體系的建立。Crannell等[35]建立了基于多重LFD試紙條的糞便病原體的多重RPA核酸擴(kuò)增體系，可同時(shí)檢測鞭毛蟲、隱孢子蟲和內(nèi)阿米巴原蟲；Lau等[36]基于表面增強(qiáng)拉曼散射檢測技術(shù)，建立了植物病原體的多重RPA核酸擴(kuò)增體系，可同時(shí)檢測灰霉病菌、丁香假單胞菌和尖孢鐮刀菌。本研究所建立的褐飛虱單重檢測方法為基于RPA/RAA技術(shù)的褐飛虱、偽褐飛虱、擬褐飛虱三重檢測系統(tǒng)的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究建立的RAA-LFD法檢測體系，提高了褐飛虱鑒定準(zhǔn)確性、縮短了鑒定時(shí)間、脫離了對(duì)精密儀器的依賴，擺脫了對(duì)分類專業(yè)技能的要求，突破了核酸檢測在植保領(lǐng)域大范圍推廣的技術(shù)瓶頸，可為褐飛虱的精準(zhǔn)綠色防控提供技術(shù)支撐。唯一不足是RAA試劑及LFD試紙條價(jià)格昂貴，不利于大范圍推廣，且存在氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)。目前，本團(tuán)隊(duì)正在開發(fā)基于RAA+微流控紙基芯片的褐飛虱速測技術(shù)及配套產(chǎn)品，有望解決成本高及交叉污染問題。

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A Rapid Detection Assay ofBased on Recombinase Aided Amplification-lateral Flow Dipstick Technology

LUO Ju, TANG Jian, WANG Aiying, YANG Baojun, LIU Shuhua*

(,,,;Corresponding author, E-mail: tangjian@caas.cn)

【】To solve the time- and labor-costing problem for accurate identification oftrapped by light, we aim to establish a fast and convenient qualitative identification method.】At first, we selected a couple of primers which are species specific for. Then, we established an identification method based on Rapid Aided Amplification-Lateral Flow Dipstick (RAA-LFD) technology. Finally, we analyzed the temperature and template robustness of this method. 【】The RAA-LFD method developed in the present study is convenient and fast, and it does not depend on any sophisticated instrument. Furthermore, this method can amplify effectively with crude tissue fluid as template, and it can be triggered by body temperature. The entire process for 56 specimens, including the crude tissue liquid preparation, isothermal amplification, and LFD detection, can be completed in 45 min with an accuracy of 100%. 【】This RAA-LFD method is a time-saving and easy-to-apply molecular diagnostic method forugens identification from its two sibling species. It is really suitable for Point of Care Test (POCT) in plant protection station or in field.

;China;(Muir); RAA-LFD; Point of Care Test

10.16819/j.1001-7216.2022.210314

2021-03-29；

2021-05-18。

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LGN21C140002）；中國水稻研究所重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（CNRRI-2020-03）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（CPSIBRF-CNRRI-202123）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程資助項(xiàng)目。