有無(wú)瞼板腺功能障礙患者眼表菌群組成對(duì)比△

曹宇辰 張杰鑫 黎穎莉 易果果 符 敏

瞼板腺功能障礙(MGD)是一種慢性的瞼板腺分泌異常的疾病，通常以瞼板腺開口的阻塞和/或瞼脂分泌的質(zhì)和量的變化為特征。它可能導(dǎo)致淚膜改變，從而導(dǎo)致眼部刺激癥狀等臨床癥狀明顯的炎癥和眼表疾病[1]。有研究顯示，亞洲人群中MGD患病率約為60%，其中30歲以下人群患病率為33%，60歲以上人群患病率為72%[1-3]。此前的研究顯示，眼表菌群變化可能與MGD等眼表疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3-4]。但細(xì)菌感染在與MGD相關(guān)的炎癥中的致病作用仍有待進(jìn)一步證實(shí)，即便如此，各類局部抗生素仍常被用于治療MGD[5]。值得注意的是，細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果常很不準(zhǔn)確。不同于皮膚和消化道表面，由于淚膜的抗菌特性和眼瞼的持續(xù)機(jī)械作用，微生物不易附著于眼表面，因此眼表面的微生物群落十分稀疏[6-7]。加之，受細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)局限性的影響，眼表微生物菌群的變化對(duì)MGD患者的影響仍未明確。但研究眼表菌群變化與MGD的聯(lián)系可以向我們提供有關(guān)MGD發(fā)病機(jī)制的線索。

基于上述背景，本研究我們采用16S rRNA高通量測(cè)序，對(duì)包括了非MGD(NMGD)和MGD患者的共89名受試者進(jìn)行了眼表菌群組成的測(cè)定，以期了解MGD患者與NMGD者之間以及不同程度MGD患者之間的眼表菌群的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料2018年6月至2018年10月在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院招募57例MGD患者為MGD組，其中，男29例，女28例，年齡15～84(56±14)歲。同時(shí)招募32名健康志愿者為NMGD組，男15名，女17名，年齡20～77(50±18)歲。MGD組與NMGD組受試者年齡和性別匹配(P=0.322、0.375)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)受試眼停戴角膜接觸鏡6個(gè)月以上；(2)無(wú)全身系統(tǒng)性疾??；(3)無(wú)除MGD外眼部其他疾?。?4)無(wú)眼外傷史或手術(shù)史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近3個(gè)月內(nèi)使用可能影響眼表菌群的藥物或纖維補(bǔ)充劑；(2)有貧血、胃腸道疾病或慢性疾病者；(3)懷孕或哺乳。雙眼同時(shí)符合入選標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，隨機(jī)選取一眼入組。研究團(tuán)隊(duì)成員向每位參與者詳細(xì)解釋了課題內(nèi)容，進(jìn)而取得了受試者的書面知情同意。本研究得到南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并根據(jù)《赫爾辛基宣言》的宗旨進(jìn)行。

1.2 MGD的診斷和分級(jí)由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的眼科醫(yī)生基于臨床表現(xiàn)，參照文獻(xiàn)[8]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)MGD進(jìn)行獨(dú)立診斷：(1)超過(guò)3個(gè)月的眼表癥狀(眼部干燥、疲勞、灼燒感和/或異物感、沙礫感)；(2)裂隙燈檢查見(jiàn)瞼板腺孔堵塞；(3)瞼板腺分泌物的質(zhì)(瞼脂混濁、伴或不伴分泌物中的條絮或顆粒、瞼脂黏稠如膏狀)和/或量異常。按照表1的標(biāo)準(zhǔn)將MGD患者分為3級(jí)，納入研究的57例MGD患者中，25例為Ⅰ級(jí)，20例為Ⅱ級(jí)，12例為Ⅲ級(jí)。

表1 MGD分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.3 樣本收集眼表面麻醉后，由同一名醫(yī)生使用一次性無(wú)菌干棉簽對(duì)受試者的上瞼、下瞼、淚阜和穹隆結(jié)膜分別采集樣本，共得到來(lái)自89名受試者的89份DNA樣本，這些樣本在采集后立即置入無(wú)菌管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA提取物使用DNA提取試劑盒從棉簽中提取細(xì)菌DNA，并按照說(shuō)明書用超微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，MA，美國(guó))測(cè)量濃度和純度。PCR分析之前，向每個(gè)樣品中添加20 mL的洗脫緩沖液，并立即轉(zhuǎn)移到-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增和16S rRNA測(cè)序使用Invitrogen(Carlsbad,CA,美國(guó))合成長(zhǎng)度為12 bp的條形碼引物，以89份DNA樣本為模板，行PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3-V4片段，之后使用Illumina Miseq(PE 300)測(cè)序，SynGene基因分析軟件分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析使用QIMME(版本1.8.046)讀取序列，使用操作分類單位表生成細(xì)菌16S rRNA序列，并在R軟件中顯示。觀測(cè)物種的α多樣性指數(shù)，包括Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Dominance指數(shù)和PD-whole-tree，并使用QIIME(V1.9.1)顯示受試者眼表菌群的多樣性、豐富度或均勻性。通過(guò)R軟件使用k-樣本Fisher-Pitman排列檢驗(yàn)顯示以上數(shù)據(jù)。為了評(píng)估89份樣本在物種多樣性上的差異，使用QIIME軟件計(jì)算了Bray-Curtis相異度、加權(quán)和未加權(quán)的Unifrac Beta多樣性指數(shù)。通過(guò)主坐標(biāo)分析(PCoA)獲取主坐標(biāo)，將復(fù)雜、多維的數(shù)據(jù)可視化，在R軟件中通過(guò)QIIME和ggplot2包顯示?；贐ray-Curtis距離矩陣，對(duì)兩組間門、屬水平前30個(gè)物種的豐度進(jìn)行熱圖分析。進(jìn)行LEfSe分析是為了確定兩組之間是否存在顯著性差異，并尋找每組中特定的生物標(biāo)記物。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA基因序列分析為了確定細(xì)菌的多樣性，整個(gè)修剪的16S rRNA序列被聚集成操作分類單位，這些序列通過(guò)在線軟件(V10；http://www.drive5.com/usearch/)分析，其中，≥97%相似的序列被分配給相同的操作分類單位。PCR擴(kuò)增后共產(chǎn)生了5 365 536個(gè)測(cè)序讀數(shù)。在去除低質(zhì)量或非細(xì)菌的16S rRNA序列讀數(shù)后，對(duì)每個(gè)樣本使用5 001 025個(gè)高質(zhì)量讀數(shù)(占總讀數(shù)的93.21%)進(jìn)行進(jìn)一步分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 MGD組與NMGD組受試者16S rRNA基因序列基本信息表

2.2 兩組受試者眼表菌群對(duì)比將每位受試者的細(xì)菌16S rRNA測(cè)序讀數(shù)分為門水平和屬水平。在門水平上，眼表菌群在MGD組被分成37門，在NMGD組被分成38門(占比在0.01%以上的菌門被納入)。兩組眼表菌群均由14個(gè)主要門類主導(dǎo)(括號(hào)內(nèi)分別為各菌門在MGD組和NMGD組測(cè)序的占比)，包括酸桿菌門(1.70%vs.1.60%)、放線菌門(5.91%vs.6.68%)、擬桿菌門(14.45%vs.14.79%)、綠彎菌門(1.47%vs.1.70%)、藍(lán)細(xì)菌門(1.80%vs.1.80%)、Epsilonbacteraeota(1.11%vs.1.07%)、厚壁菌門(16.75%vs.17.42%)、浮霉菌門(1.36%vs.1.51%)、變形菌門(48.67%vs.50.90%)、異常球菌-棲熱菌門(0.29%vs.0.33%)、梭桿菌門(0.29%vs.0.33%)、Patescibacteria(0.82%vs.0.87%)、螺旋體門(0.27%vs.0.34%)、疣微菌門(0.98%vs.1.03%)，它們一起占所有測(cè)序的約 97%。上述14個(gè)菌群門類占比兩組受試者間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

在屬水平上，MGD組和NMGD組受試者的16S rRNA測(cè)序讀數(shù)被分為15個(gè)菌屬(括號(hào)內(nèi)分別為各菌屬在MGD組和NMGD組測(cè)序的占比)，即不動(dòng)桿菌屬 (8.30%vs.7.95%)、芽孢桿菌屬 (7.39%vs.7.38%)、金黃桿菌屬 (2.55%vs.2.35%)、檸檬酸桿菌屬 (1.02%vs.0.98%)、棒狀桿菌屬(2.61%vs.2.74%)、毛螺旋菌屬(1.06%vs.0.80%)、Pedobacter(2.10%vs.2.10%)、發(fā)光桿菌屬 (2.01%vs.1.49%)、假單胞菌屬 (14.93%vs.14.10%)、羅爾斯頓菌屬 (1.55%vs.1.70%)、紅假單胞菌屬 (0.99%vs.1.07%)、鞘氨醇單胞菌屬(1.95%vs.1.86%)、葡萄球菌屬(1.08%vs.2.36%)、 鏈球菌屬(0.83%vs.0.80%) 和硫桿菌屬 (1.18%vs.1.05%)，上述15個(gè)菌屬兩組受試者間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

2.3 兩組受試者眼表菌群多樣性的比較MGD組與NMGD組受試者間眼表菌群的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao 1指數(shù)及Dominance指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05), 表明MGD組和NMGD組受試者眼表菌群具有相似的豐度和均勻度。 PCoA分析結(jié)果表明，MGD組與NMGD組受試者間結(jié)膜菌群構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(未加權(quán)的Unifrac PCoA;P>0.05)(圖1)。

圖1 使用未加權(quán)的 Unifrac 方法構(gòu)建主坐標(biāo)分析 MGD組和NMGD組受試者的結(jié)膜菌群

LEfSe分析結(jié)果顯示，與NMGD組受試者相比，MGD組患者的眼表富含Sphingorhabdus、AKYH767、Hydrogenobaculaceae、Hydrogenobaculum、Aquificales和Aquificae，這些細(xì)菌可以歸類為 MGD 細(xì)菌。 然而，與 NMGD 組受試者相比，MGD組患者眼表中Kocuria、Cyanobium-PCC-6307、Terrimicrobiaceae、厭氧黏桿菌、Archangiaceae和Chloroflexi-bacterium-RBG-16-58-14的含量顯著降低(LDA 評(píng)分>2分)(圖 2)。

圖2 根據(jù)使用 LEfSe 算法計(jì)算的 MGD組和NMGD組受試者間的比較確定的LDA值列出的分類群

2.4 MGD不同分級(jí)患者間眼表菌群的差異對(duì)MGD組患者的細(xì)菌16S rRNA測(cè)序讀數(shù)進(jìn)行分類，可見(jiàn)10個(gè)菌門占優(yōu)勢(shì)(括號(hào)內(nèi)為各菌門相對(duì)豐度在不同樣本中的范圍)：變形菌門(33.33%～67.78%)、擬桿菌門(8.74%～31.41%) 、放線菌門(1.88%～30.97%)、厚壁菌門(5.56%～30.49%)、Patescibacteria(0.50%～8.88%)、酸桿菌門(0.39%～6.71%)、綠彎菌門(2.11%～5.77%)、藍(lán)細(xì)菌門(3.29%～4.87%)、疣微菌門(0.80%～3.60%)和浮霉?fàn)罹T(0.26%～3.87%)。在這些菌門中，前三位(變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門)共占42.07%～100.00%。

I級(jí)、II級(jí)、III級(jí)MGD患者中擬桿菌門、Epsilonbacteraeota和變形菌門相對(duì)豐度間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與 II 級(jí)MGD患者相比，I級(jí)MGD患者眼表中擬桿菌門(P=0.012) 和Epsilonbacteraeota (P=0.006)均顯著減少，變形菌門(P=0.001)顯著增加(表3)。 尤其，部分患者以單一菌門為主，例如某MGD患者變形菌門總測(cè)序讀數(shù)的相對(duì)豐度為 67.78%。

表3 MGD組不同分級(jí)患者眼表菌群的相對(duì)豐度

在屬層面上，13個(gè)菌屬被確定為MGD患者的常見(jiàn)菌屬(括號(hào)內(nèi)為菌屬相對(duì)豐度在不同樣本中的范圍)，分別為不動(dòng)桿菌屬(5.86%～10.77%)、芽孢桿菌屬 (7.05%～7.50%)、金黃桿菌屬 (2.12%～3.16%)、假單胞菌屬(1.71%～41.23%)、普氏菌屬(0.00%～7.24%)、擬桿菌屬 (0.00%～4.78%)、檸檬酸桿菌屬 (0.84%～1.21%)、代爾夫特菌屬 (0.54%～0.10%)、硫桿菌屬(0.40%～3.75%)、發(fā)光桿菌屬(1.77%～2.08%)、葡萄球菌屬 (0.93%～1.40%)、硫單胞菌屬 (0.40%～2.98%) 和棒狀桿菌屬 (0.17～2.85%)。

在I級(jí)、II級(jí)、III級(jí)MGD患者中，不動(dòng)桿菌屬、普氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、光細(xì)菌屬和未分類菌屬相對(duì)豐度間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與 II 級(jí)MGD患者相比，I級(jí)MGD患者眼表中不動(dòng)桿菌(P=0.001) 和假單胞菌 (P=0.004)顯著增加，代爾夫特菌(P=0.009) 和未分類物種(P=0.002)顯著減少。與III級(jí)MGD患者相比，Cirobacter (P=0.012) 和未分類物種(P=0.005) 在 I 級(jí)中MGD患者顯著減少(表3)。

2.5 MGD不同分級(jí)患者間眼表菌群的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較α多樣性分析結(jié)果表明，I級(jí)、II級(jí)和III級(jí)MGD患者眼表菌群的發(fā)育多樣性(Shannon指數(shù))存在顯著差異(P=0.006)。 根據(jù)Shannon指數(shù)，II級(jí)MGD患者眼表菌群多樣性最高，而I級(jí)MGD患者眼表菌群多樣性最低。 此外，I級(jí)、II級(jí)和III級(jí)MGD患者在Dominance指數(shù)上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)。從Dominance指數(shù)來(lái)看，I級(jí)MGD患者優(yōu)勢(shì)菌最多，II級(jí)MGD患者優(yōu)勢(shì)菌最少。MGD組I級(jí)、II級(jí)和III級(jí)患者之間PD-whole-tree(P=0.117)、Chao 1指數(shù)(P=0.456)和Simpson指數(shù)(P=0.090)相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 I級(jí)、II級(jí)、III級(jí)MGD患者結(jié)膜菌群的α多樣性

使用未加權(quán)的Unifrac(圖4A)和加權(quán)的Unifrac方法(圖4B)構(gòu)建的 PCoA 圖結(jié)果表明，I級(jí)、II級(jí)、III級(jí)MGD患者之間的樣品可以清楚地區(qū)分(未加權(quán)的Unifrac、加權(quán)的Unifrac分別為P=0.013、P=0.039)。 各組菌群培養(yǎng)后，I級(jí)和II級(jí)MGD患者樣本中菌群緊密地聚集在一起，而III級(jí)MGD患者樣本菌群生長(zhǎng)遍布了整個(gè)培養(yǎng)基。 為了進(jìn)一步確定可以區(qū)分MGD患者和正常受試者的生物標(biāo)志物，進(jìn)行了 LEfSe 分析(LDA 評(píng)分 >3.5分，P<0.05)。在I級(jí)、II級(jí)和III級(jí)MGD患者中，共有22個(gè)菌群差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。I級(jí)MGD患者眼表中γ變形桿菌、殺香魚假單胞菌、假單胞菌、不動(dòng)桿菌、莫拉菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌、Caldibacillus、弧桿菌和阿氏芽孢桿菌的相對(duì)豐度較高；II級(jí)MGD患者顯示出最獨(dú)特的眼表菌群，其特征是差異球菌科、異形桿菌科、毛螺螺旋科、腸桿菌科、彎曲桿菌和Epsilonbacteraeota數(shù)量較高；而III級(jí)MGD患者眼表菌群富含檸檬桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、δ-變形菌綱和著色桿菌(圖5)。

圖4 I級(jí)、II級(jí)和III級(jí)MGD 患者結(jié)膜菌群的3D-PCoA分析 A：I級(jí)(黑點(diǎn))、II級(jí)(紅點(diǎn))和III級(jí)(綠點(diǎn))MGD患者中的未加權(quán)的Unifrac PCoA；B：I級(jí)(黑點(diǎn))、II級(jí)(紅點(diǎn))和III級(jí)(綠點(diǎn))MGD患者之間的加權(quán)的Unifrac PCoA。

圖5 根據(jù)使用 LEfSe 算法計(jì)算的 MGD I級(jí)、II級(jí)和III級(jí)患者間的比較確定的LDA值列出分類群

3 討論

健康的眼表菌群可以保護(hù)眼表免受疾病侵害?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，在健康人群的結(jié)膜表面，同時(shí)有需氧菌群(24.0%～90.6%)和厭氧菌群(51.6%～77.3%)附著，其中以凝固酶陰性葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌為主[1-4]。而當(dāng)眼表面菌群失調(diào)，其屏障功能減弱，就可能罹患眼表疾病。已有研究揭示了眼表菌群可能在眼表疾病的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如干眼癥、瞼緣炎和MGD等[9-10]。有研究報(bào)道，在正常健康結(jié)膜中，細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率為24%～75%[11-12]，而在干眼患者結(jié)膜中，細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率高達(dá)97%[12]。此外，與健康人群相比，瞼緣炎和結(jié)膜炎患者結(jié)膜中的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌數(shù)量增加[13]。可見(jiàn)，細(xì)菌數(shù)量與眼表疾病的發(fā)生相關(guān)。

利用高通量測(cè)序技術(shù)，許多研究人員在他們的研究中得到了一些與此前認(rèn)知相悖的結(jié)果。如Huang等[14]曾報(bào)道了一些從未被發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌可能可以代表健康結(jié)膜微生物群的核心屬。而利用16S rDNA PCR技術(shù)，Graham等[12]在MGD和干眼癥患者的結(jié)膜微生物群中都發(fā)現(xiàn)了多種潛在致病菌。此外， Lee等[15]研究表明，與健康人群相比，瞼緣炎患者的結(jié)膜上發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌群落明顯減少。隨著高通量測(cè)序技術(shù)日趨成熟，相關(guān)研究的結(jié)果可能比基于傳統(tǒng)方法的研究結(jié)果具有更高的可信度。

本研究利用高通量16S rRNA測(cè)序，對(duì)比分析了MGD患者和NMGD受試者中結(jié)膜菌群的組成。本研究結(jié)果顯示，MGD患者和NMGD受試者具有類似的結(jié)膜菌群構(gòu)成。值得關(guān)注的是，芽孢桿菌和葡萄球菌被認(rèn)為是干眼、眼瞼炎和其他眼表疾病的共同病原體[16]，但本研究結(jié)果顯示，MGD患者和NMGD受試者眼表菌群構(gòu)成之間沒(méi)有差異。同樣與此前研究結(jié)果相悖的還有，我們通過(guò)α多樣性和PCoA圖得到MGD患者與NMGD受試者的眼表菌群差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)的結(jié)論。在此前基于細(xì)菌培養(yǎng)的研究結(jié)果顯示，分離出的主要物種是表皮葡萄球菌(厭氧菌)和痤瘡丙酸桿菌(厭氧菌)，且MGD患者的結(jié)膜囊和瞼板腺分泌物中細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率顯著提高，需氧菌和厭氧菌的分布范圍更廣，該研究還顯示，MGD患者瞼板腺分泌物(需氧菌為75.6%，厭氧菌為34.3%)和結(jié)膜囊(需氧菌為64.7%，厭氧菌為30.8%)中細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率較健康人群顯著增高(P>0.05)[17]。從這些研究中可以看出，眼表患病者的眼表微生物群落發(fā)生了變化，這種改變可能參與了眼表疾病的發(fā)病過(guò)程。雖然本研究結(jié)果表明，MGD患者的眼表菌群與NMGD受試者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有差異，但這給我們一個(gè)啟示，即眼表菌群的改變?cè)贛GD的發(fā)病中起到的作用可能遠(yuǎn)低于我們的預(yù)估。值得一提的是，在本研究中，MGD組患者和NMGD組受試者眼表均發(fā)現(xiàn)了一些既往研究中發(fā)現(xiàn)的致病菌，如芽孢桿菌和葡萄球菌等。

同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，在不同嚴(yán)重程度的MGD患者之間，包括不動(dòng)桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、普氏菌屬、發(fā)光桿菌屬和未分類菌屬在內(nèi)的眼表菌群，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(均為P<0.05)。而在其他研究中，也曾報(bào)道過(guò)Lysinibacillu、麥?zhǔn)习魻顥U菌等致病菌在不同程度MGD患者中也有顯著差異(均為P<0.01)[17]。此外，眼表菌群發(fā)育多樣性Shannon指數(shù)(P=0.006)和Dominance指數(shù)(P=0.012)在I級(jí)、II級(jí)和III級(jí)MGD患者之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在I級(jí)MGD患者的樣本中培養(yǎng)出了較多的優(yōu)勢(shì)菌，而在II級(jí)MGD患者中則培養(yǎng)得到的優(yōu)勢(shì)菌最少，表明II級(jí)MGD患者中眼表菌群豐度和均勻度均高于其他兩組。PCoA圖也顯示I級(jí)、II級(jí)和III級(jí)MGD患者樣本間的明顯差異(P=0.039)，在I級(jí)和II級(jí)MGD患者的樣本中，菌落緊密相鄰生長(zhǎng)，而在III級(jí)MGD患者的樣本中，菌落生長(zhǎng)遍布了整個(gè)培養(yǎng)基。

此前有研究報(bào)道，在MGD患者和NMGD受試者的瞼緣都發(fā)現(xiàn)了類似的微生物組成，同時(shí)報(bào)道了一些細(xì)菌，如痤瘡丙酸桿菌，與MGD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[18]，這在一定程度上與我們的研究結(jié)果一致。Jiang等[19]研究認(rèn)為，MGD的嚴(yán)重程度與較高的分離率、細(xì)菌菌落數(shù)和細(xì)菌生長(zhǎng)程度呈正相關(guān)，這在一定程度上與我們的研究結(jié)果一致。此外，在Graham等[12]的報(bào)道中也提及，健康人群和疾病程度最嚴(yán)重的MGD患者之間眼表的平均細(xì)菌計(jì)數(shù)有顯著差異(P<0.005)，這也說(shuō)明了MGD的嚴(yán)重程度和眼部微生物群落之間的關(guān)系。據(jù)此，我們可以初步得出結(jié)論，隨著MGD嚴(yán)重程度的變化，眼表微生物群落也會(huì)發(fā)生改變，但改變的方向還仍待進(jìn)一步探究。

此外，盡管細(xì)菌在MGD患者的病理生理過(guò)程中的作用仍然不確定，以阿奇霉素為代表的局部抗生素仍常用于治療MGD，以求抑制某些被認(rèn)為與MGD有關(guān)的致病性微生物生長(zhǎng)[5]，且在臨床中，這樣的治療方案也收到了一定的效果。為了更好地治療MGD，我們應(yīng)該在了解不同嚴(yán)重程度的MGD患者眼表菌群改變的基礎(chǔ)上，進(jìn)行個(gè)性化抗菌治療。我們的研究結(jié)果將進(jìn)一步闡明不同嚴(yán)重程度的MGD患者眼表面菌群的差異，為個(gè)體化和特異性的抗菌治療提供參考依據(jù)。

由于地理、人種等的差異以及樣本量、研究方法、細(xì)菌的演化等因素的影響，我們的研究得到了不同于此前研究的一些結(jié)果。我們認(rèn)為，本研究使用的16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)得到的結(jié)果更可信。但在現(xiàn)有條件下，16S rRNA高通量測(cè)序?qū)τ诨钗⑸锖退劳鑫⑸锏谋鎰e仍然存在缺陷[18，20]。此外，不同程度MGD患者中眼表菌群改變所帶來(lái)的功能和代謝通路改變?nèi)圆幻鞔_，針對(duì)這些細(xì)菌改變的個(gè)體化和特異性治療方法也有待深入探索。