miR-29b通過靶向調(diào)節(jié)特異性蛋白1調(diào)控糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用△

牟 琳 劉 蘋 李 來(lái) 岳婭婷

糖尿病性白內(nèi)障是糖尿病患者中發(fā)生較早且具有致盲性的眼部并發(fā)癥之一[1]，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜。晶狀體上皮細(xì)胞全程參與晶狀體纖維的分化過程，其中上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)于開發(fā)新的治療方法具有重要意義[2]。然而，EMT調(diào)節(jié)糖尿病性白內(nèi)障的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。有證據(jù)表明，EMT過程受到多種因素的調(diào)控，如microRNAs (miRNAs)[3-5]。曾凱宏等[6]發(fā)現(xiàn)高糖可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞miR-29b表達(dá)降低，說(shuō)明miR-29b在糖尿病早期視損傷中屬于保護(hù)性因子。郭小雷[5]證實(shí)miR-29b在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中表達(dá)量降低，而黃連素可以通過上調(diào)miR-29b表達(dá)延緩高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT進(jìn)程，因此，我們推斷miR-29b是一類與EMT密切相關(guān)的miRNAs，這種靶向EMT的生物學(xué)分子有望成為預(yù)防或治療糖尿病性白內(nèi)障的重要靶標(biāo)。因此，本研究擬分析miR-29b對(duì)糖尿病性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞EMT的調(diào)控作用，并進(jìn)一步研究其可能的分子機(jī)制，以期為糖尿病性白內(nèi)障的機(jī)制研究及臨床治療提供新的可行性靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞人晶狀體上皮細(xì)胞HLE-B3(ATCC CRL-11421TM)購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心。

1.2 主要試劑及儀器DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RIPA細(xì)胞裂解液和蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR Premix Ex Taq 試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報(bào)告試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Western blot一抗：兔抗人N-鈣黏蛋白(N-Cadherin)多克隆抗體(11000)、兔抗人E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)多克隆抗體(11000)、兔抗人波形蛋白(Vimentin)多克隆抗體(11000)均購(gòu)自美國(guó)CST公司，兔抗人特異性蛋白1(SP-1)單克隆抗體(150)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；免疫熒光一抗：兔抗人N-Cadherin多克隆抗體(1100)、兔抗人E-Cadherin多克隆抗體(11000)、兔抗人Vimentin多克隆抗體(11000)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及高糖處理HLE-B3細(xì)胞用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分組處理，各組細(xì)胞分別用含有5.5 mmol·L-1D-葡萄糖 (正常組)、10.5 mmol·L-1D-葡萄糖 、15.5 mmol·L-1D-葡萄糖 、25.5 mmol·L-1D-葡萄糖、35.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24 h；或用含有35.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-29b和SP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞SP-1蛋白表達(dá)水平。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HLE-B3細(xì)胞分為：正常組(用含有5.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)、高糖組(用含有35.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)、陰性組(轉(zhuǎn)染miRNA模擬物scramble和陰性siRNA序列)、miR-29b mimics組(轉(zhuǎn)染miR-29b模擬物)、miR-29b mimics+SP-1組(轉(zhuǎn)染miR-29b模擬物和SP-1基因序列)，除正常組外其余各組細(xì)胞均用含有35.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。由上海GenePharma公司化學(xué)合成了人miR-29b模擬物和模擬物陰性對(duì)照序列。miR-29b模擬物基因序列為：正向： 5’-UAGCAUCACAGAAAUAUUGGC-3’，反向： 5’-CAAUAUUUCUGUGCUGCUAUU-3’。細(xì)胞在6孔板中的融合率為70%～80%時(shí)，用Lipofectamine RNAiMAX質(zhì)粒轉(zhuǎn)染miR-29b模擬物和模擬物陰性對(duì)照序列48 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-29b相對(duì)表達(dá)量。此外委托上海Sangon Biotech公司以化學(xué)方法合成了人SP-1基因特異性序列和陰性對(duì)照序列。用LipofectamineTM2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h，然后更換培養(yǎng)基。繼續(xù)轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SP-1基因序列為：正向：5’-CCGCTCGAGTTGAUUTGAGGAGACATCTA-3’；反向：5’-ATAAGAATGCGGCCGCAGCATTTACCCACAGCC-3’(該引物序列含有與miR-29b互補(bǔ)的靶序列)；陰性對(duì)照序列為：正向：5’-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3’；反向：5’-GUACUUUUGUGUAGUACAGUU-3’，作為陰性對(duì)照。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞miR-29b和SP-1的mRNA表達(dá)使用總RNA提取試劑盒提取總RNA并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。以小分子U6 mRNA或GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果分析采用2-ΔΔCt法。

1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞垂直遷移活性將細(xì)胞按10×103個(gè)·mL-1接種至Transwell上層小室(孔徑8 μm)中，用200 μL無(wú)血清DMEM(5.5 mmol·L-1D-葡萄糖)培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)在下層小室中加入600 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM(35.5 mmol·L-1D-葡萄糖)培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，用棉簽仔細(xì)擦拭上層小室的細(xì)胞。然后將濾紙固定在40 g·L-1多聚甲醛中30 min，用1 g·L-1結(jié)晶紫染色20 min。在倒置顯微鏡下對(duì)5個(gè)隨機(jī)視野的染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移活性將細(xì)胞按20×103個(gè)·mL-1接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜達(dá)到80%以上融合。用200 mL移液管尖端劃傷單層細(xì)胞，制作人工傷口。分別用含5.5 mmol·L-1或35.5 mmol·L-1D-葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h。倒置顯微鏡下拍照。劃痕愈合率=(劃痕寬度0 h-劃痕寬度24 h)/劃痕寬度0 h×100%。

1.3.6 免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)和定位將細(xì)胞培養(yǎng)于12孔平板中，放置一蓋玻片進(jìn)行細(xì)胞爬片。經(jīng)過不同處理后，用40 g·L-1多聚甲醛固定玻片上的細(xì)胞30 min。PBS洗滌3次×5 min，然后用體積分?jǐn)?shù)1% Triton X-100在PBS中處理30 min，以提高細(xì)胞膜的通透性。為了減少非特異性免疫反應(yīng)，在室溫下將10 g·L-1牛血清白蛋白滴于細(xì)胞上30 min，然后將細(xì)胞與初級(jí)抗體(抗N-Cadherin、抗E-Cadherin、抗Vimentin、抗SP-1)在4 ℃下孵育過夜。用熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育 1 h 后，用DAPI染色細(xì)胞核。采用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察染色細(xì)胞并獲得圖像。

1.3.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)各組細(xì)胞用RIPA裂解液裂解后提取細(xì)胞總蛋白，用蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白定量后，將蛋白在100 g·L-1十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入N-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin、SP-1一抗孵育過夜，然后經(jīng)山羊抗兔IgG二抗孵育后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，蛋白表達(dá)水平根據(jù)β-微管蛋白(β-Tubulin)進(jìn)行標(biāo)化。

1.3.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)使用重疊PCR法擴(kuò)增得到miR-29b及SP-1基因野生型和突變型序列，先用XhoI與Xbal雙酶切pmirGIO載體，再將miR-29b及SP-1目的片段與pmirGIO雙黏載體構(gòu)建成pmirGIO-miR-29b及pmirGIO-SP-1重組載體，最后將細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，用LipofectamineTM2000將重組報(bào)告載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。對(duì)照組轉(zhuǎn)染miR-NC質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24 h，通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 高糖對(duì)HLE-B3細(xì)胞形態(tài)的影響光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組HLE-B3細(xì)胞排列緊密，呈鵝卵石樣貼壁生長(zhǎng)；10.5 mmol·L-1D-葡萄糖組、15.5 mmol·L-1D-葡萄糖組、25.5 mmol·L-1D-葡萄糖組、35.5 mmol·L-1D-葡萄糖組培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，部分細(xì)胞表現(xiàn)出一定的纖維樣細(xì)胞特性，尤其是用25.5 mmol·L-1D-葡萄糖、35.5 mmol·L-1D-葡萄糖處理的細(xì)胞出現(xiàn)變長(zhǎng)趨勢(shì)且數(shù)量減少(圖1)。

圖1 不同濃度D-葡萄糖培養(yǎng)下HLE-B3細(xì)胞形態(tài)特征(×200) A：正常組；B：10.5 mmol·L-1 D-葡萄糖組；C：15.5 mmol·L-1 D-葡萄糖組；D：25.5 mmol·L-1 D-葡萄糖組；E：35.5 mmol·L-1 D-葡萄糖組。

2.2 高糖對(duì)HLE-B3細(xì)胞miR-29b、SP-1 mRNA表達(dá)的影響25.5 mmol·L-1D-葡萄糖組 、35.5 mmol·L-1D-葡萄糖組處理HLE-B3細(xì)胞24 h，細(xì)胞中miR-29b相對(duì)表達(dá)量較正常組、10.5 mmol·L-1D-葡萄糖組、15.5 mmol·L-1D-葡萄糖組均顯著降低，且35.5 mmol·L-1D-葡萄糖組HLE-B3細(xì)胞miR-29b相對(duì)表達(dá)量低于25.5 mmol·L-1D-葡萄糖組(均為P<0.05)；同時(shí)35.5 mmol·L-1D-葡萄糖組處理HLE-B3細(xì)胞24 h，細(xì)胞中SP-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量較正常組，10.5 mmol·L-1、15.5 mmol·L-1D-葡萄糖組均顯著升高(均為P<0.05)(圖2)。故選擇35.5 mmol·L-1D-葡萄糖作為實(shí)驗(yàn)用最佳高糖濃度。此外，用35.5 mmol·L-1D-葡萄糖處理HLE-B3細(xì)胞24 h、48 h時(shí)，細(xì)胞中miR-29b相對(duì)表達(dá)量較0 h、6 h、12 h時(shí)均顯著降低，同時(shí)SP-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(均為P<0.05)；但是處理24 h和48 h時(shí)，HLE-B3細(xì)胞miR-29b、SP-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05，圖3)。

圖2 不同濃度D-葡萄糖對(duì)HLE-B3細(xì)胞miR-29b、SP-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 與正常組相比，*P<0.05；與10.5 mmol·L-1D-葡萄糖組相比，#P<0.05；與15.5 mmol·L-1D-葡萄糖組相比，&P<0.05；與25.5 mmol·L-1D-葡萄糖組相比，ΔP<0.05。

圖3 35.5 mmol·L-1 D-葡萄糖處理不同時(shí)間對(duì)HLE-B3細(xì)胞miR-29b、SP-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 與處理0 h相比，*P<0.05；與處理6 h 相比，#P<0.05；與處理12 h相比，&P<0.05。

2.3 轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證正常組HLE-B3細(xì)胞miR-29b、SP-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量(1.002±0.023、1.010±0.038、0.257±0.091)和陰性組(0.998±0.030、1.004±0.033、0.251±0.049)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。miR-29b mimics組HLE-B3細(xì)胞miR-29b相對(duì)表達(dá)量(2.162±0.103)較正常組和陰性組均升高(均為P<0.05)，同時(shí)miR-29b mimics組HLE-B3細(xì)胞SP-1 mRNA(0.756±0.048)和蛋白(0.159±0.021)相對(duì)表達(dá)量較正常組和陰性組均降低(均為P<0.05)。miR-29b mimics+SP-1組HLE-B3細(xì)胞miR-29b相對(duì)表達(dá)量(2.089±0.095)與miR-29b mimics組基本一致(P>0.05);SP-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量(2.895±0.177、0.890±0.118)較正常組、陰性組和miR-29b mimics組均升高(均為P<0.05)，以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)染成功。

2.4 上調(diào)miR-29b表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞遷移活性的影響高糖組HLE-B3細(xì)胞Transwell小室遷移數(shù)量和劃痕愈合率[(786±95)個(gè)、(81.73±5.39)%]較正常組[(431±61)個(gè)、(54.85±7.08)%]均增加(均為P<0.05)。陰性組HLE-B3細(xì)胞Transwell小室遷移數(shù)量和劃痕愈合率[(760±116)個(gè)、(80.53±6.75)%]與高糖組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。miR-29b mimics組HLE-B3細(xì)胞Transwell小室遷移數(shù)量和劃痕愈合率[(479±86)個(gè)、(61.49±8.62)%]較高糖組和陰性組均明顯減少(均為P<0.05)。此外miR-29b mimics+SP-1組HLE-B3細(xì)胞Transwell小室遷移數(shù)量和劃痕愈合率[(651±102)個(gè)、(76.54±7.75)%]均高于miR-29b mimics組(均為P<0.05)。

2.5 上調(diào)miR-29b表達(dá)對(duì)HLE-B3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響免疫熒光染色和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組細(xì)胞中E-Cadherin蛋白表達(dá)降低，同時(shí)N-Cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)增強(qiáng)。而與高糖組和陰性組相比，miR-29b mimics組細(xì)胞中E-Cadherin蛋白表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)N-Cadherin 和Vimentin蛋白表達(dá)減弱。轉(zhuǎn)染SP-1后，miR-29b mimics+SP-1組細(xì)胞中E-Cadherin蛋白表達(dá)較miR-29b mimics組降低，同時(shí)N-Cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)較miR-29b mimics組均升高(均為P<0.05)(圖4、圖5)。

圖4 免疫熒光染色檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況(×800)

圖5 Western blot檢測(cè)各組HLE-B3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 A：正常組；B：高糖組；C：陰性組；D：miR-29b mimics組；E：miR-29b mimics+SP-1組。

2.6 生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證經(jīng)TargetScan、 miRanda及miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-29b的靶基因包含SP-1。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC質(zhì)粒的對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-29b mimics質(zhì)?？山档蚐P-1-3’UTR-WT熒光素酶活性約57.5%(1.00±0.09vs0.48±0.05,P<0.05)，但不降低SP-1-3’UTR-MUT熒光素酶活性(1.01±0.09vs0.98±0.07,P>0.05)。

3 討論

糖尿病性白內(nèi)障是糖尿病常見的眼部慢性并發(fā)癥，其發(fā)病率正在逐年上升[7]。越來(lái)越多的miRNAs在白內(nèi)障發(fā)展過程中的異常表達(dá)已經(jīng)確定，而相關(guān)機(jī)制研究也引起了科研人員更多的關(guān)注[8]。本研究證實(shí)miR-29b在高糖處理的HLE-B3細(xì)胞中表達(dá)量降低。上調(diào)miR-29b可通過調(diào)節(jié)SP-1依賴性信號(hào)通路抑制高糖條件下HLE-B3細(xì)胞EMT進(jìn)程，進(jìn)而對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

晶狀體上皮細(xì)胞在晶狀體的整個(gè)生命周期中負(fù)責(zé)晶狀體纖維的分化[9]。正常的分化和形態(tài)可以維持晶狀體的正常透明度，而晶狀體上皮細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化和凋亡的病理改變可能導(dǎo)致白內(nèi)障。EMT是一種廣泛存在于真核生物體內(nèi)自然發(fā)生的細(xì)胞生物學(xué)程序，可將上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為更多間充質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞[10-11]，并在各種病理過程中起著重要作用，包括傷口愈合、組織纖維化和癌癥進(jìn)展[4,12-13]。在這個(gè)過程中，晶狀體上皮細(xì)胞失去了正常的形態(tài)特征和轉(zhuǎn)錄程序，但是獲得了間充質(zhì)細(xì)胞的表型特征，包括更強(qiáng)的遷移能力、抗凋亡能力和侵襲性，增加了細(xì)胞外間質(zhì)成分的產(chǎn)生等。然而，EMT調(diào)節(jié)糖尿病性白內(nèi)障的分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探討。其中miRNAs是機(jī)制研究的熱點(diǎn)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖條件下可誘導(dǎo)HLE-B3細(xì)胞中miR-29b表達(dá)降低，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)向間充質(zhì)特征轉(zhuǎn)化。在EMT過程中，HLE-B3細(xì)胞失去了一些上皮特有的特征，包括E-Cadherin表達(dá)減少，典型的間充質(zhì)細(xì)胞特性增強(qiáng)，如Vimentin和N-Cadherin表達(dá)增加。這說(shuō)明高糖促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，而EMT是參與糖尿病性白內(nèi)障形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

研究表明，上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化受到miRNAs的調(diào)控[9,12]，因此，miRNAs被認(rèn)為是參與眼睛發(fā)育和疾病發(fā)生的重要功能性分子。Liu等[15]證實(shí)miR-199a在糖尿病性白內(nèi)障囊膜組織和高糖條件下的晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而且miR-199a被證實(shí)可以直接靶向調(diào)控SP-1蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制糖尿病性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。Ye等[16]也發(fā)現(xiàn)高糖可抑制miR-144-3p表達(dá)，進(jìn)而通過ROS/NRF2/Notch1/Snail途徑影響晶狀體上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-29b mimics質(zhì)粒上調(diào)HLE-B3細(xì)胞中miR-29b表達(dá)，進(jìn)而抑制SP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯， 從而阻止高糖誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞EMT進(jìn)程。生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)，SP-1 mRNA是高度守恒的，是miR-29b的重要目標(biāo)。SP-1是SP/Kruppel-like因子超家族成員，是許多管家基因轉(zhuǎn)錄所需的。其過度表達(dá)與細(xì)胞的異常分化有關(guān)，而SP-1的下調(diào)會(huì)加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)[17]。SP-1亦可以通過相關(guān)基因來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、EMT和侵襲過程[18]。本研究中，EMT被證實(shí)與高糖誘導(dǎo)作用有關(guān)，在經(jīng)高糖處理的HLE-B3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)E-Cadherin蛋白表達(dá)降低，同時(shí)N-Cadherin和 Vimentin 蛋白表達(dá)增強(qiáng)。雙熒光素酶報(bào)告基因分析證實(shí)SP-1直接受到miR-29b的調(diào)控。上調(diào)SP-1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-29b對(duì)HLE-B3細(xì)胞EMT進(jìn)程的抑制作用。這些結(jié)果都表明，上調(diào)miR-29b可能通過調(diào)節(jié)SP-1表達(dá)影響HLE-B3細(xì)胞EMT進(jìn)程，進(jìn)而延緩或阻止糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。說(shuō)明miR-29b-SP-1-EMT網(wǎng)絡(luò)在糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)展中起到一定作用，這為糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的研究提供了新思路。

綜上所述，本研究證實(shí)了miR-29b在糖尿病性白內(nèi)障體外細(xì)胞模型中表達(dá)下調(diào)。上調(diào)miR-29b表達(dá)可通過靶向SP-1基因參與抑制高糖誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞EMT的進(jìn)程。這些結(jié)果為研究糖尿病性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了新的視角，同時(shí)，miR-29b、SP-1可能成為糖尿病性白內(nèi)障治療的新靶點(diǎn)。