番茄MYB44基因敲除載體構(gòu)建研究

●婁紅梅 楊慶玲 向小雪（重慶大學(xué)生物工程學(xué)院 重慶 404100）

基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，為基因功能的深入研究和作物有益性狀的改良提供了重要的技術(shù)支撐。CRISPR/Cas系統(tǒng)基因編輯技術(shù)，具有載體構(gòu)建過程簡單、編輯效率高，可對特異功能基因進(jìn)行敲除，因此在植物中得以廣泛應(yīng)用[1]。

CRISPR-Cas系統(tǒng)包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR關(guān)聯(lián)基因）兩部分[2]。CRISPR是原核生物基因組內(nèi)的一段重復(fù)序列，分布在40%已測序細(xì)菌和90%已測序古細(xì)菌中。CRISPR基因序列主要由前導(dǎo)序列（leader）、重復(fù)序列（repeat）和間隔序列（spacer）構(gòu)成。前導(dǎo)序列：富含AT堿基，位于CRISPR基因上游。重復(fù)序列：長度20～50 bp堿基且包含5～7 bp回文序列。間隔序列：是被細(xì)菌俘獲的外源DNA序列。細(xì)菌的免疫系統(tǒng)會對外源遺傳物質(zhì)產(chǎn)生記憶，再次入侵時CRISPR/Cas系統(tǒng)就會精準(zhǔn) 識別[3]。

Cas基因編碼的Cas蛋白在防御過程中至關(guān)重要。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Cas1～Cas10等多種類型的Cas基因。CRISPR/Cas基于Cas基因和CRISPR序列分成3種類型（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型），其中屬于TypeⅡ型的CRISPR/Cas9最為普遍[4]。

Cas9蛋白切割靶標(biāo)基因造成雙鏈斷裂后，會優(yōu)先啟動編輯受體中的非同源末端連接修復(fù)途徑，使得切割位點發(fā)生堿基的插入缺失（Indel），當(dāng)Indel位于基因外顯子且堿基數(shù)不是3的倍數(shù)時，便會造成密碼子的移碼突變。如果2個等位基因同時發(fā)生相同的編輯，則形成純合突變，若2個基因同時發(fā)生不同的編輯，則產(chǎn)生雙等位突變，兩種突變均能實現(xiàn)基因的敲除[5]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與植物生長發(fā)育和代謝的各個方面。MYB轉(zhuǎn)錄因子具有共同的結(jié)構(gòu)特征，C端是包含酸性氨基酸的轉(zhuǎn)錄激活功能域，N端末端包含一段高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域。MYB結(jié)構(gòu)域通常是由1～4個不完全重復(fù)（Repeat. R）的序列構(gòu)成，每段重復(fù)序列含有50～53個氨基酸殘基，并且每隔約18個氨基酸中間存在著1個色氨酸 殘基[6]。

根據(jù)所含相鄰重復(fù)序列的數(shù)量差異，MYB家族可以分為不同的亞類。在c-MYB蛋白中3個重復(fù)序列的名稱分別為R1、R2和R3，MYB蛋白按照與c-MYB重復(fù)序列的相似性，將家族成員 分 為4R-MYB、3R-MYB、1R-MYB、R2R3-MYB四類[7]。MYB基因作為一類轉(zhuǎn)錄因子，可參與細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、葉綠體發(fā)育、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、種子休眠、植物晝夜節(jié)律、次生代謝等 過程[8]。

通過對MYB44基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)番茄中MYB44屬于MYB家族轉(zhuǎn)錄因子，與已報道的擬南芥中的MYB44高度同源。研究表明，擬南芥中的MYB44基因參與調(diào)節(jié)ABA介導(dǎo)的對干旱、鹽度和損傷等非生物脅迫的耐受性。在鹽脅迫條件下，擬南芥植株中MYB44啟動子激活，誘導(dǎo)MYB44轉(zhuǎn)錄本增加，在擬南芥植株中超表達(dá)MYB44有助于提高其耐鹽性[9]。而在干旱脅迫下超表達(dá)MYB44，擬南芥植株表現(xiàn)出葉片卷曲、葉片白化、蒸騰作用加快等特征，表明該基因參與干旱脅迫調(diào)節(jié)過程[10]。若發(fā)生機(jī)械損傷或花瓣掉落，相應(yīng)部位的MYB44會被迅速大量激活，進(jìn)一步啟動防御基因的轉(zhuǎn)錄，提高植物抗性。因此，研究番茄中MYB44基因的功能，有助于提高番茄植株非生物脅迫的 抗性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料 野生型番茄AC++、大腸桿菌感受態(tài)DH5α、質(zhì)粒pKSE-401、helper菌、農(nóng)桿菌LBA4404。

1.1.2 試驗儀器 恒溫?fù)u床、光照培養(yǎng)箱、超凈工作臺、電泳儀、凝膠成像儀、恒溫水浴鍋、電子天平、滅菌鍋、PCR儀、恒溫金屬浴、離心機(jī)、紫外分光光度計。

1.2 試驗方法

根據(jù)前期已經(jīng)克隆得到的MYB44基因序列（圖1），設(shè)計sgRNA靶位點序列，退火制備sgRNA雙鏈，再與線性pKSE-401-Cas9載體連接獲得重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，再對其進(jìn)行PCR鑒定及序列比對分析。

圖1 MYB44基因及sgRNA序列

2 結(jié)果

2.1 靶向MYB44的sgRNA設(shè)計

根據(jù)MYB44基因的NCBI登錄號XM_010317694.3， 找出外顯子區(qū)域。再利用在線數(shù)據(jù)庫（http：//crispr.mit.edu）設(shè)計MYB44基因的sgRNA，序列為5′-TAGCCCG ACTTCTTAATGGG-3′，長 度 是20 bp，GC含量達(dá)到50%，并包含PAM識別位點。

2.2 重組載體的構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ對pKSE-401載體進(jìn)行切割，從而獲得一個14 800 bp的線性載體和一個1221 bp的短片段，并將sgRNA寡核苷酸單鏈以逐步降溫的方法退火形成雙鏈，利用連接酶solutionⅠ將sgRNA與線性載體在16℃中連接2～4 h。

2.3 轉(zhuǎn)化

將凍存的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（每管100 μL）置于冰上融化，取連接產(chǎn)物在冰上預(yù)冷2 min后加入其中，輕輕撥動5～10次，在冰上放置 30 min，42℃的水浴鍋中熱激90 s后迅速放冰上 5 min，在超凈工作臺中加入700 μL LB液體培養(yǎng)基，在37℃ 150 r/min的搖床中孵育60 min，之后7000 r/min離心3 min，吸去部分上清液，留 100 μL重懸沉淀，并涂布于含卡那抗性的LB平板，干后用封口膜封閉，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)12～16 h。

2.4 菌斑檢測

在超凈工作臺挑出單菌后，以通用型引物U6-26p-F和U6-26t-R對重組載體進(jìn)行PCR鑒定，正確結(jié)果為423 bp大小片段，試驗結(jié)果與預(yù)期一致，初步判斷sgRNA與pKSE-401載體準(zhǔn)確連接（圖2），將陽性克隆菌液送至上海生工進(jìn)行測序，結(jié)果顯示插入片段無突變基因，表明MYB44基因的敲除載體構(gòu)建成功。

圖2 重組載體pKSE-401-Cas9-sgRNA的PCR鑒定

2.5 三菌合一

將上述測序正確的大腸桿菌以及helper菌分 別接種于含有卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)16 h。農(nóng)桿菌LBA4404則接種于含有利福平和鏈霉素的YEB固體培養(yǎng)上，暗培養(yǎng)3 d，將3種 菌混合涂布于YEB培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)1 d。 第2天將3菌混合物重新接種到Y(jié)EB（SM+Kan+Rif） 中篩選重組農(nóng)桿菌，28℃暗培養(yǎng)3 d。挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測，條帶正確后搖菌保存菌種。

2.6 CRISPR/Cas9/MYB44 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄子葉

將番茄AC++種子進(jìn)行次氯酸鈉消毒后，置于4℃冰箱中過夜，使得種子發(fā)芽時間一致。在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)2 d，將萌發(fā)的種子播種到不含抗生素的MS培養(yǎng)基上，于光照環(huán)境培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)長出兩片子葉，將子葉兩端剪掉，中間部分傷口朝下置于培養(yǎng)基（IAA+ZT）中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，第2天于超凈工作臺中進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染后，再將子葉兩端翹起放回平板中，28℃暗培養(yǎng)2 d。將子葉轉(zhuǎn)移到含有IAA+ZT+Kan+Carb的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，兩端傷口1/2插入到培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，15 d左右形成愈傷組織。將其轉(zhuǎn)移至組培瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，待分化出幼苗后，切取幼苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中（Kan+Carb），將生根的組培苗進(jìn)行繼代。

3 結(jié)果分析

針對已生根的組培苗，取少量葉片進(jìn)行基因組DNA的提取，并通過引物MYB44-F和MYB44-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到884 bp大小的片段后，將PCR產(chǎn)物送往上海生工公司進(jìn)行測序，其結(jié)果與野生型WT的序列進(jìn)行比較，得到的結(jié)果為sgRNA靶序列發(fā)生了3種不同類型的編輯，即形成3個獨立的株系（圖3）。

圖3 重組載體pKSE-401-Cas9-sgRNA的測序結(jié)果

4 討論與展望

CRISPR/Cas系統(tǒng)是植物基礎(chǔ)研究和應(yīng)用的重要工具，因其強(qiáng)大的編輯能力，已經(jīng)獲得數(shù)百種具有改良農(nóng)業(yè)性能的農(nóng)作物品種[11]。CRISPR/Cas9作為植物中特定基因靶向突變的一種手段，2014年首次在番茄中用于探究基因功能，首先構(gòu)建SlSHR基因的缺失突變體，通過侵染番茄根組織，發(fā)現(xiàn)SlSHR基因影響下游靶標(biāo)基因SISCR的表達(dá)，并導(dǎo)致番茄根毛變短，這與擬南芥中觀察到的表型一致，證明了該基因的保守性[12]。2014年Brooks等[13]對番茄SLAGO7基因進(jìn)行研究，設(shè)計了2個靶位點序列的載體，并采用侵染葉片的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化試驗，通過檢測發(fā)現(xiàn)T0代植株接近1/2的位點均發(fā)生突變，再次對突變植株進(jìn)行PCR檢測，最終得到一個純合體，一個小片段缺失突變體，兩個嵌合體。2017年，在番茄中構(gòu)建CRISPR篩選文庫，用于研究富含亮氨酸重復(fù)序列的受體樣激酶亞家族（LRR-XⅡ）基因的功能[14]。結(jié)果表明，CRISPR/Cas9技術(shù)能夠在番茄中實現(xiàn)精準(zhǔn)編輯并通過種系穩(wěn)定傳播，以期通過該技術(shù)提高番茄產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗脅迫，抗病能力。