斗米蟲蛋白對4T1 荷瘤小鼠的抗腫瘤作用

侯沛穎，孫媭，黃秀鳳，王毅，鮑慶華，歐陽東興，徐華潮*

（1.浙江農林大學林業(yè)與生物技術學院，浙江杭州 311300）（2.杭州富陽國有農林資產經營有限公司，浙江杭州 311400）

關鍵字：斗米蟲蛋白；4T1 荷瘤小鼠；體內抗腫瘤

斗米蟲，異名云實蛀蟲，主要是指寄生于豆科植物云實（Caesalpinia decapetala(Roth)Alston）樹莖中的銹色粒肩天牛（Apriona swainsoniHope）和桑天牛（Apriona germari）的天牛全蟲幼蟲[1]，古人常用一斗米來換取一條蟲，故稱此蟲為斗米蟲。早在《中華本草》中就記載了斗米蟲有治療勞傷、透疹和增強筋骨的藥用價值，《本草綱目》一書中記載食用此蟲可治療小兒疳積、麻毒內陷、筋骨疼痛、肝硬化等疾病。江西上饒及浙江某些地區(qū)不少癌癥病人長期食用斗米蟲，病情都有所好轉[2]。

當前治療腫瘤的主要手段是化療，但經過化療人體會產生許多毒副作用如損傷免疫功能、損害胃腸道、破壞肝功能和骨髓抑制等，這些毒副作用限制了化療藥物療效的進一步提高和發(fā)展。中醫(yī)認為腫瘤的發(fā)病根基是氣血兩虧，且在臨床常常見到痰凝、血瘀等癥狀，因此中醫(yī)治療以活血化瘀、扶正培本、軟堅散結、清熱解毒、利濕逐水為主[3]。目前藥用昆蟲在治療腫瘤的研究中已發(fā)現(xiàn)有增效減毒作用，而且能增加腫瘤對化療藥物的敏感性[4]。例如，斑蝥素對人低分化胃癌細胞細胞有顯著抑制作用，且對比于其他抗腫瘤藥物可以顯著激活骨髓的活性，以增強生物體自身的免疫力抵御腫瘤[5]；蟑螂提取物具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、增強肌體免疫力等作用[6-7]；蠐螬提取物對人胃癌細胞、人宮頸癌細胞具有誘導凋亡作用[8-10]等。因此，越來越多的研究者開始關注新型抗腫瘤藥物的研發(fā)，從天然藥用昆蟲中發(fā)現(xiàn)高效、低毒且特異性調節(jié)癌細胞增殖和轉移的成分，利用藥用昆蟲治療腫瘤或者輔助治療腫瘤達到增效減毒的目的，則具有極其重要的意義。

鑒于其臨床應用前景及廣闊的市場前景，課題組前期對斗米蟲開展了相關研究。首先關于斗米蟲的人工飼養(yǎng)技術探究，基于蟲體生長指標、營養(yǎng)成分、保護酶活性三方面篩選出了適合斗米蟲生長的飼料配方，為人工大規(guī)模養(yǎng)殖斗米蟲提供理論依據[11]。其次關于食用斗米蟲微生物安全性評價方面，基于高通量測序技術發(fā)現(xiàn)新鮮斗米蟲存在多種潛在腐敗細菌和食物病原體，但經過熱處理等有微生物滅活效果的加工流程可避免或最小化食用昆蟲帶來的微生物風險，這可對食用昆蟲衛(wèi)生標準提供參考依據[12]。對于斗米蟲蛋白抗腫瘤功效方面的研究，已有體外抗腫瘤效果初探：斗米蟲蛋白能抑制小鼠胃癌細胞（MFC）和小鼠乳腺癌細胞（4T1）的增殖，抑制4T1 細胞的遷移率，且能誘導4T1 及MFC 細胞凋亡，斗米蟲蛋白能促進小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7）細胞增殖，提高其吞噬活性，說明斗米蟲蛋白具有較強的體外抗腫瘤活性及免疫調節(jié)活性[13]。本實驗以斗米蟲蛋白為對象，通過構建BALB/c-4T1 荷瘤小鼠模型來研究斗米蟲蛋白的體內抗腫瘤作用，這將為斗米蟲的蛋白活性價值研究及其保健食品的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料與試劑

實驗用斗米蟲（經浙江農林大學徐華潮教授鑒定為銹色粒肩天牛幼蟲）200 條，購自江西省上饒市橫峰縣斗米蟲養(yǎng)殖場。

RPMI1640、青-鏈霉素、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶均購自美國Gibco 公司；熒光素鉀鹽購自上海普飛生物有限公司。

1.1.2 實驗動物與供試瘤株

雌性SPF 級BALB/c 小鼠40 只，18～22 g，6～8周齡，由中國科學院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK(滬)2017-0005。

本實驗BALB/c 小鼠在浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心SPF 級小鼠飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，使用許可證號：SYXK(浙)2018-0012，飼養(yǎng)條件：恒溫（22±2 ℃），保濕（50%～60%），光照每12 h 明暗交替，換風次數15～20 次／h。每日兩次即8:00～9:00 和15:00～16:00定時喂養(yǎng)試驗小鼠。所有實驗步驟均嚴格按照中國關于實驗動物使用和護理的立法進行，經浙江中醫(yī)藥大學動物福利與倫理審查委員會批準，倫理審批號：20200706-08。

小鼠乳腺癌4T1 細胞株，購自于中國科學院上海細胞研究所。

1.1.3 儀器設備

臺式高速冷凍離心機（H1650R），湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；臺式低速離心機（TD5A），湖南凱達實業(yè)發(fā)展有限公司；小動物麻醉呼吸機，美國Hallowell 公司；IVISLuminaLT 型小動物成像系統(tǒng)，美國Caliper 公司。

1.2 方法

1.2.1 斗米蟲總蛋白提取

取200 條，單頭體質量為1.70 g 左右，蟲齡為5齡的新鮮斗米蟲，放入-80 ℃冰箱中冷凍處死，隨后置于冷凍干燥機中，脫水干燥5 d 后取出幼蟲。將凍干的蟲體研磨成粉狀，加入500 mL預冷的PBS buffer。冰浴超聲提取30 min，4 ℃冰箱提取過夜。4 ℃，12000 r/min 離心15 min，取上清，舍棄沉淀，冷凍干燥[13]。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和收集

用含10%胎牛血清50 IU/mL 青霉素50 μg/mL 鏈霉素的RPM1640 培養(yǎng)基作為小鼠乳腺癌4T1 細胞的培養(yǎng)液，置于5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)細胞。待復蘇后第3 代細胞長至70%～80%融合，用0.25%胰酶消化3～5 min，1000 r/min 離心5 min，棄去上清液，PBS 洗滌3 次，計數，細胞濃度調整至5×106cells/mL。

1.2.3 BALB/c-4T1 荷瘤小鼠模型建立

參考相關文獻[14-16]，取體重為18～22 g 的BALB/c雌性小鼠40 只，自由采食和飲水，預適應一周后開始進行實驗。小鼠用異氟烷呼吸麻醉，仰臥固定，在BALB/c 小鼠右側倒數第2 對乳腺脂肪墊處，注入100 μL 4T1 細胞懸液，每只小鼠接種5×105cells，制作BALB/c-4T1 荷瘤小鼠模型，注射后出現(xiàn)局部包塊，無細胞懸液滲出及出血，每日觀察小鼠和腫瘤生長情況，接種后一周，開始第一次給藥。

1.2.4 分組及給藥

40 只小鼠接種后按體重隨機分為5 組，斗米蟲蛋白低劑量組（50 mg/kg 體重，ig）、斗米蟲蛋白中劑量組（100 mg/kg 體重，ig）、斗米蟲蛋白高劑量組（200 mg/kg 體重，ig），順鉑（DDP）陽性藥對照組（30 mg/kg，ip）和模型對照組（等體積生理鹽水），每組8 只。按0.1 mL/10 g 體重的給藥體積配制為相應濃度，斗米蟲蛋白低、中、高試驗組和模型對照組每日灌胃給藥，連續(xù)27 d，順鉑陽性藥組每周三次（隔日）腹腔注射給藥，周期27 d。每日觀察小鼠飲食、活動及死亡情況。

1.2.5 指標測定

1.2.5.1 斗米蟲蛋白對4T1 荷瘤小鼠體重及腫瘤的影響

從給藥后，開始每周三次（隔日）用電子天平給荷瘤小鼠稱重和用游標卡尺進行活體腫瘤大小測量（包括腫瘤最大長徑a和腫瘤橫徑b）。參見相關文獻[17-19]，相關計算公式如下：

1.2.5.2 斗米蟲蛋白對4T1 荷瘤小鼠臟器質量及指數的影響

第28 d 處死小鼠，用電子天平給小鼠稱重，眼眶靜脈采血，頸椎脫臼處死小鼠后，剝離腫瘤組織和各臟器，用生理鹽水洗滌，然后用濾紙吸干稱重。根據以下公式[3,20]，計算荷瘤小鼠各主要臟器指數：

1.2.5.3 小動物成像系統(tǒng)檢測體內4T1 腫瘤細胞生長情況

給藥第7、14、21 d 時，各組小鼠腹腔注射100 μL/10 g 的15 mg/mL 熒光素鉀鹽酶底物（劑量為150 mg/kg），底物腹腔注射15 min 后，用麻醉機進行異氟烷麻醉后，置于小動物活體成像儀中觀測小鼠乳腺癌腫瘤細胞生長情況。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 21.0 軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，結果均采用以均值±標準誤表示（mean±SEM），多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），p＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計數據采用GraphPadprism 6 軟件進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 荷瘤小鼠一般情況

整個實驗過程中，各組別BALB/c-4T1 荷瘤小鼠（除陽性對照組）飲水、進食均正常，而陽性對照組給藥一段時間后食欲表現(xiàn)欠佳；各組別荷瘤小鼠均未見有堅毛、運動失調或活動受限、呼吸困難、煩躁等反應，所有小鼠均能耐受實驗。

2.2 斗米蟲蛋白對4T1 荷瘤小鼠體重的影響

小鼠的體重變化被認為是評價安全性的指標之一，體質量呈緩慢增長趨勢都是符合荷瘤小鼠的正常生長情況的。由圖1 可知：模型對照組和斗米蟲蛋白各劑量組，小鼠體重均呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，而陽性對照組在給藥一段時間后，體重呈現(xiàn)下降趨勢。如表1 所示：給藥前，與模型對照組相比，各組荷瘤小鼠體重均無統(tǒng)計學差異；給藥后，與模型對照組相比，斗米蟲蛋白各劑量組均無顯著差異性，說明斗米蟲蛋白對小鼠沒有明顯的藥物毒性，而陽性對照組具有統(tǒng)計學差異（p＜0.05）。荷瘤小鼠體重增長量最大的是斗米蟲蛋白高劑量組（200 mg/kg），體重變化率由大到小依次為：斗米蟲蛋白高劑量組（+8.96%）＞模型對照組（+6.86%）＞低劑量組（+6.67%）＞中劑量組（+3.70%）＞DDP 組（-12.62%）。陽性對照組荷瘤小鼠體重呈負增長趨勢，可能是因為化療藥物在抑制腫瘤過程中，會致使荷瘤小鼠食欲不振，對機體有較強的毒副作用。

圖1 不同處理方式對4T1 荷瘤小鼠體重的影響Fig.1 Effect of different treatment methods on body weight in 4T1 tumor-bearing mice

表1 不同處理方式對4T1 荷瘤小鼠給藥前后體重的影響（mean±SEM）Table 1 Effect of different treatment methods on body weight before and after dosing in 4T1 tumor-bearing mice

綜合以上，表明斗米蟲蛋白對4T1 荷瘤小鼠體重無顯著影響，小鼠生長環(huán)境適宜，與順鉑相比，不會引起小鼠食欲不振，具有對荷瘤小鼠體重無影響的優(yōu)勢。

2.3 斗米蟲蛋白對4T1 荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

2.3.1 斗米蟲蛋白對4T1 荷瘤小鼠腫瘤體積的影響

由圖2 可知：模型對照組荷瘤小鼠腫瘤生長正常，而陽性對照組和斗米蟲各劑量組荷瘤小鼠腫瘤體積增長速度變慢。從圖3 可以看出：模型對照組腫瘤體積增長量最大，陽性對照組腫瘤體積增長量最小，斗米蟲蛋白各劑量組則介于中間；給藥前，與模型對照組相比，各組別荷瘤小鼠腫瘤體積均無統(tǒng)計學差異；給藥后，與模型對照組相比，陽性對照組和斗米蟲蛋白中濃度劑量組（100 mg/kg）的腫瘤體積增長量具有統(tǒng)計學差異性（p＜0.05），腫瘤體積抑制率分別為38.57%和23.08%。

圖2 不同處理方式對4T1 荷瘤小鼠腫瘤體積的影響Fig.2 Effect of different treatment methods on tumor volume in 4T1 tumor-bearing mice

圖3 不同處理方式對4T1 荷瘤小鼠腫瘤體積增長量的影響Fig.3 Effect of different treatment methods on tumor volume growth in 4T1 tumor-bearing mice

2.3.2 斗米蟲蛋白對4T1 荷瘤小鼠腫瘤質量的影響

實驗結束后，脫頸處死小鼠，摘取腫瘤稱重并拍照，腫瘤實物圖見圖4。

圖4 不同處理方式4T1 荷瘤小鼠腫瘤實物圖Fig.4 Tumor images of different treatment methods on 4T1 tumor-bearing mice

結合表2 可發(fā)現(xiàn)，陽性對照組腫瘤質量最小，斗米蟲蛋白中劑量組次之，且與模型對照組相比，均有顯著差異性（p＜0.05），而中劑量組與陽性對照組相比，腫瘤質量無統(tǒng)計學差異性（p＞0.05），表明斗米蟲蛋白中劑量組（100 mg/kg）在體內對4T1 腫瘤有較強的抑制效果，這與孫媭等[13]研究結果相互印證。孫媭等研究發(fā)現(xiàn)，斗米蟲蛋白體外可以抑制4T1 細胞的遷移，誘導4T1 細胞的凋亡，能顯著抑制4T1 細胞的增殖作用（p＜0.05），體外4T1 細胞增值抑制率最高能達到53%。本實驗腫瘤質量抑制率從高到低依次為：陽性對照組（48.08%）＞斗米蟲蛋白中劑量組（36.06%）＞低劑量組（23.08%）＞高劑量組（21.63%）。

表2 不同處理方式對4T1 荷瘤小鼠腫瘤質量的影響（mean±SEM）Table 2 Effect of different treatment methods on tumor weight in 4T1 tumor-bearing mice (mean±SEM)

綜合以上，表明斗米蟲蛋白在體內對4T1 腫瘤生長有一定抑制作用，且斗米蟲蛋白中劑量組（100 mg/kg）體內抑制4T1 腫瘤效果最顯著，抑瘤率達到36.06%。

2.4 斗米蟲蛋白對4T1 荷瘤小鼠臟器質量及臟器指數的影響

從圖5 可看出，陽性對照組荷瘤小鼠的各主要臟器質量最小，斗米蟲蛋白各劑量組與模型對照組的各主要臟器質量相比沒有顯著差異性，而與陽性對照組相比具有統(tǒng)計學差異性（?p＜0.05）；與模型對照組相比，僅有陽性對照組荷瘤小鼠的肝臟、脾臟、肺臟、腎臟質量明顯降低，具有統(tǒng)計學差異性（*p＜0.05），說明順鉑會對荷瘤小鼠各主要臟器表現(xiàn)出一定的毒副作用，而斗米蟲蛋白則未表現(xiàn)出明顯毒副作用。

圖5 不同處理方式對4T1 荷瘤小鼠主要臟器質量的影響Fig.5 Effects of different treatment methods on the main viscera weight in 4T1 tumor-bearing mice

如表3 所示：就心臟指數、肺臟指數、腎臟指數而言，各處理組之間均無統(tǒng)計學差異性；與模型對照組相比，陽性對照組的肝臟指數和脾臟指數顯著降低（*p＜0.05），而斗米蟲蛋白各劑量組均無顯著差異性，說明順鉑對臟器有一定的毒害作用，而斗米蟲蛋白組未表現(xiàn)明顯毒副作用。

表3 不同處理方式對4T1 荷瘤小鼠主要臟器指數的影響（mean±SEM）Table 3 Effects of different treatment methods on the main viscera index of 4T1 tumor-bearing mice (mean±SEM)

脾臟屬于免疫器官，其與機體免疫反應的發(fā)生息息相關。本實驗結果顯示，陽性對照組的脾臟質量和脾臟系數與模型對照組相比均顯著減?。╬＜0.05），說明順鉑在一定程度上抑制了荷瘤小鼠機體免疫作用。而斗米蟲蛋白各劑量組的脾臟質量和脾臟指數與模型對照組相比雖均無統(tǒng)計學差異，但有減小的趨勢，推測斗米蟲蛋白可能通過免疫調節(jié)的方式發(fā)揮體內抗腫瘤作用。孫媭等[13]體外試驗表明：斗米蟲蛋白能促進巨噬細胞（RAW264.7）的細胞增殖作用（p＜0.05），提高RAW264.7 吞噬活性、NO 釋放量、TNF-α、1L-1β和IL-6 分泌量及TNF-α、IL-1、TLR4、MIR-7、IFN-γ和IL-6 細胞因子的mRNA 水平以及能顯著下調4T1 細胞中MMP2、MMP9、STAT3、c-Myc和Sdf1mRNA 水平（p＜0.05，p＜0.01），斗米蟲蛋白還能明顯增加RAW264.7 細胞MyD88 和TRIF 蛋白的表達量，證實了斗米蟲蛋白在體外具有潛在免疫調節(jié)作用。而關于斗米蟲蛋白體內是否通過免疫調控的途徑以參與抗腫瘤的過程，還需進行下一步的探討和補充。

綜合以上，表明斗米蟲蛋白對荷瘤小鼠各主要臟器無明顯毒副作用，與順鉑相比，具有對荷瘤小鼠各主要臟器無明顯毒害的優(yōu)勢。

2.5 小動物成像系統(tǒng)檢測體內4T1 腫瘤細胞生長情況

小動物成像系統(tǒng)可以檢測荷瘤小鼠4T1 腫瘤細胞熒光信號。由圖6 可以看出：模型對照組荷瘤裸小鼠隨著接種時間的延長，熒光信號也不斷升高，說明腫瘤生長良好。與模型對照組相比，斗米蟲蛋白各劑量組熒光信號相對減弱，但不及陽性對照組，與腫瘤生長情況相符合，表明斗米蟲蛋白在體內對4T1 腫瘤細胞有一定的抑制作用。

圖6 不同處理方式的荷瘤小鼠IVIT 成像Fig.6 IVIT imaging of 4T1 tumor-bearing mice treated with different treatment methods

3 結論

本實驗表明：斗米蟲蛋白呈現(xiàn)出一定的體內抑制4T1 腫瘤細胞作用，且對4T1 荷瘤小鼠機體或各主要臟器無明顯毒副作用。斗米蟲蛋白劑量為100 mg/kg時，對體內腫瘤抑制效果最強，抑瘤率達到36.06%。但是針對其抗腫瘤機理，是否是通過免疫調節(jié)能力來抵御腫瘤細胞，還有待進一步探究。