基于氣相色譜法的驢皮真?zhèn)慰焖勹b別

李蘭杰，張華宸，石婧，魏子翔，張寧，劉桂芹*

（1.聊城大學農(nóng)學院，山東聊城 252000）（2.聊城大學生物制藥研究院，山東聊城 252000）

阿膠，由馬科動物驢（Equus asinusL.）的皮去毛后經(jīng)過熬制而成的一類膠塊。阿膠具有補血養(yǎng)血、美容養(yǎng)顏、強身健體的作用[1]。阿膠可增強免疫力，促進營養(yǎng)物質的吸收，預防癌癥，滋養(yǎng)腎陰，也是安胎的良藥，在生活和臨床中具有廣泛的用處[2]。

隨著人類的生活水平的快速提高，阿膠越來越受到人們的青睞，擁有廣大的市場和光明的發(fā)展前景[3]。由于驢皮資源有限，阿膠、驢皮的價格持續(xù)推高，因此，以其它動物皮制備阿膠的現(xiàn)象普遍存在。此類事件給正品阿膠的推廣以及消費者帶來巨大的沖擊和憂慮，同時對阿膠的質量控制帶來新的考驗和挑戰(zhàn)。

目前對于阿膠熬制所用原料-驢皮的鑒別方法主要有物理鑒別法、化學成分分析法、驢屬DNA 和驢源特異性肽段的檢測等。史兆松等[4]基于光學手段用哈氏切片器對待測驢皮，馬皮和牛皮的附屬物毛進行切片，采用光學顯微鏡觀察，對比各動物毛纖維表面及橫切面的顯微結構，結果差異明顯，可作為毛皮種類的鑒別依據(jù)。田俊生等[5]利用核磁共振（NMR）代謝組學技術，從驢皮、馬皮、騾皮中提取水溶性成分，在得出的42 種水溶液成分中，三者的含量差異很大，因此可以將三種皮區(qū)別開。Xue 等[6]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術，比對了多個物種的皮源性特異性蛋白的成分，成功的用于檢測是否用非驢皮來熬制阿膠產(chǎn)品。史碧云等[7]通過建立驢皮藥材RAPD 分析方法并用于偽品馬皮的鑒別，其RAPD 反應結果中，300～400 bp 處的條帶具有特異性，可作為鑒別驢皮及其偽品的依據(jù)。Zhao 等[8]研究中利用細胞色素c 氧化酶亞基I 型基因聚合酶鏈反應，為阿膠所用的原料包括驢皮、馬皮、騾皮、牛皮和豬皮做出了鑒定。另外，嚴華等[9]的研究中采用細胞色素c 氧化酶亞基1 基因片段序列的方法，鑒定區(qū)別阿膠所用原材料驢皮及其偽品（馬皮、牛皮），并通過鄰接法構建出系統(tǒng)樹，結果表明驢皮、馬皮、牛皮的樣品中具有比較好的單系性，均分別獨立聚為一個分支，能夠顯著區(qū)別開。王芳等[10]利用生物學軟件模擬和超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜等技術，對牛、驢、豬的皮中來源I型膠原蛋白α1 鏈酶解肽段進行了分析對比，成功篩選出了12 個關于驢皮的特異性肽段。鞏麗萍等[11]、石峰等[12]利用序列比對技術，得到了理論馬皮膠原蛋白特征肽以及驢皮特征肽，其再利用胰蛋白酶酶切樣品，通過采用納升液相-高分辨質譜技術，明確阿膠特征肽GPTGEPGKPGDK和馬皮特征肽GASGPAGVR，成功的建立了檢測阿膠中驢皮源和馬皮源成分專屬性的方法。

通過上述方法進行驢皮的質量控制，在一定程度上遏制了在阿膠中摻雜馬皮、牛皮、羊皮等其他種屬動物皮的現(xiàn)象，同時也存在諸多不足，如耗時較長、前處理繁瑣、檢測成本高等。不同種屬動物的脂肪酸組成及含量均存在差異性。胡晶紅等[13]利用GC-MS方法，對驢、牛、馬的皮脂成分進行了分析，其研究表明驢皮皮脂中飽和脂肪酸占88.82%，而不飽和脂肪酸占2.69%；牛皮皮脂中飽和脂肪酸占37.62%，而不飽和脂肪酸占39.74%；馬皮皮脂中飽和脂肪酸占45.15%，而不飽和脂肪酸占50.31%。驢皮是以飽和脂肪酸為主，主要由棕櫚酸、(E)-9-十八碳烯酸、硬脂酸和8-十八碳烯酸構成；馬皮與牛皮是由飽和及不飽和脂肪酸構成，兩者最大量不飽和脂肪酸均為(E)-9-十八碳烯酸，其余的成分馬皮主要含(Z)-9-十六碳烯酸、硬脂酸和十六酸，而牛皮中主要含9-十六碳烯酸、對苯二甲酸和棕櫚酸，可為區(qū)分驢皮，馬皮和牛皮提供參考依據(jù)。因此，基于皮脂中脂肪酸組成的分析來進行不同種屬動物皮的鑒別在理論上切實可行。

本文首先對不同動物的皮脂進行提取，然后對其脂肪酸進行甲酯化預處理，并利用氣相色譜法初步構建了驢皮、羊皮、牛皮中脂肪酸成分的指紋圖譜，并對驢皮中特異性脂肪酸肉豆蔻酸和棕櫚油酸進行了含量測定，以期為驢皮的真?zhèn)慰焖勹b別提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

驢皮，購自東阿縣新城曲山驢肉直營店；羊皮、牛皮，購自聊城市東昌府區(qū)龍山農(nóng)貿(mào)市場。

14%三氟化硼-甲醇、十七烷酸甲酯、2,2-二甲基丙烷、37 種脂肪酸甲酯混標等試劑，購自sigma 公司。正己烷、乙酸乙酯、乙醚等藥品試劑都是分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

氣相色譜儀（7890B），美國Agilent；氮吹儀（MD200），杭州奧盛；脂肪測定儀（SOX406），濟南海能；電熱鼓風干燥箱（GZX9140MBE），上海博迅；脂肪測定儀（SOX406），濟南海能；高速分散器（T18），德國IKA；真空泵（SHZ-D），河南予華；旋轉蒸發(fā)儀（RE52-86A），上海亞榮。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物皮脂的提取

將樣品進行刮毛、除脂處理，得到干凈光滑的皮，用剪刀將其剪成5.00 mm×5.00 mm 碎片，放入烘箱烘干（80 ℃，5 h）。用粉碎機粉碎干燥好的皮樣小顆粒，稱取15.00 g樣品放入250 mL圓底燒瓶中，加入150.00 mL 乙酸乙酯常溫攪拌24 h，抽濾得濾液，將濾液用旋轉蒸發(fā)儀進行旋蒸，回收溶劑后得到三種動物皮樣的油脂。

1.3.2 脂肪酸的甲酯化

根據(jù)周光宏等[14]方法，分別取三種皮樣的油脂10.00 mg，加入14%三氟化硼-甲醇溶液2.00 mL，滴入2,2-二甲基丙烷幾滴，此時需要進行水浴30 min，溫度設定為60 ℃，目的是使脂肪酸完全甲酯化。待其冷卻后加入正己烷1.00 mL、水1.00 mL，隨之將其充分震蕩，待其靜置分層后充分吸取有機層，加入十七烷酸甲酯正己烷溶液，濃度為400 μg/mL，量為0.10 mL。氮吹儀吹干后，加入正己烷400 μL 進行溶解，然后進行氣相色譜測定。

1.3.3 氣相色譜分析

根據(jù)劉桂芹等[15]的方法，氣相色譜分析的配置及條件如下：Agilent 7890B 型氣相色譜儀，Agilent 7683型自動進樣器，TR-FAME柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm，Thermo 公司）；進樣口溫度280 ℃，火焰離子檢測器（FID）溫度260 ℃；柱升溫程序：140 ℃保持5 min，140 ℃～240 ℃，4 ℃/min，240 ℃保持15 min；載氣：高純氮氣，流速：1.00 mL/min，進樣量：1 μL，分流比：1:40。

根據(jù)37 種脂肪酸甲酯色譜圖，定性分析脂肪酸的種類；根據(jù)內標物十七烷酸甲酯的峰面積，定量分析脂肪酸含量。

1.4 統(tǒng)計分析

利用Excel 2003、Origin 7.5 和SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2.1 驢皮、羊皮、牛皮皮脂氣相色譜指紋圖譜分析

指紋圖譜包含了樣本中脂肪酸的所有信息，對于驢皮、羊皮、牛皮皮脂脂肪酸的定性分析具有重要意義。利用色譜工作站，對未加內標物樣本中的脂肪酸進行氣相色譜指紋圖譜比較分析，其結果如圖1 所示。

由圖1 可知，驢皮和牛皮皮脂中脂肪酸氣相色譜指紋圖譜具有很高的相似性，除驢皮中含有特有成分C16:1X（24.44 min）和C20:1n9（32.60 min）外，其它脂肪酸成分完全吻合。羊皮皮脂的氣相色譜指紋圖譜則表現(xiàn)出一定的差異性。在短鏈和中鏈脂肪酸區(qū)，羊皮皮脂中含有的脂肪酸種類豐富，如在12.66 min處出現(xiàn)了驢皮、牛皮皮脂中均不存在的特異峰癸酸（C10:0），且含量較高；在15.50 min 處，羊皮皮脂中含有的月桂酸（C12:0）明顯高于驢皮和牛皮；而在20.10 min 處，羊皮皮脂中含有的肉豆蔻酸（C14:1）則明顯低于驢皮和牛皮。在長鏈區(qū)，驢皮、牛皮皮脂中無明顯峰出現(xiàn)，在35.70 min 處，羊皮皮脂中出現(xiàn)了二十四碳酸（C24:0）。驢皮皮脂中出現(xiàn)的特異性脂肪酸C16:1X（24.44 min）和C20:1n9（32.60 min）需經(jīng)氣質聯(lián)用技術進一步確定結構。

圖1 驢皮、羊皮、牛皮皮脂中脂肪酸氣相色譜指紋圖譜Fig.1 The GC fingerprint analysis of fatty acid component in donkey skin,sheepskin and cowhide

2.2 驢皮、羊皮、牛皮皮脂中脂肪酸相對含量測定

利用色譜工作站，對無內標物（十七烷酸甲酯）的驢、羊、牛皮的皮脂中脂肪酸成分進行氣相色譜分析，利用面積歸一化法測定皮脂樣品中脂肪酸的相對含量。結果從驢皮、羊皮與牛皮皮脂中共檢出43、45和40 種脂肪酸成分，高于目前的研究。胡晶紅等[13]從德州烏驢皮中檢出23 種脂肪酸類成分；在牛皮中檢出23 種脂肪酸。李昊等[16]從小尾寒羊肌肉組織的脂肪酸的含量中共檢出31 種脂肪酸。本文中相對含量超過1.0%的脂肪酸分別有8（驢皮）、11（羊皮）、和7（牛皮）種，相差不大，結果如表1 示。

由表1 可知，驢皮、羊皮與牛皮皮脂中含量較高的脂肪酸為油酸（32.30%、21.97%、30.87%）、棕櫚酸（26.33%、19.48%、25.70%）和亞油酸（12.90%、18.51%、12.68%），其中牛皮皮脂中的棕櫚油酸含量也較高，為13.46%。根據(jù)胡晶紅等[14]的研究，驢皮中含量較高的脂肪酸為棕櫚酸25.00%，8-十八碳烯酸16.65%，硬脂酸12.64%；牛皮中含量較高的脂肪酸為(E)-9-十八碳烯酸28.88%，棕櫚酸23.85%，對苯二甲酸11.34%，與本研究結果稍有差異。分析原因可能與驢皮油脂的提取方法有關。根據(jù)張秀媛等[17]的研究，小尾寒羊皮下脂肪中含量較高的脂肪酸為油酸55.53%，棕櫚酸16.84%，硬脂酸9.26%，則與本研究結果基本一致。另外，本研究中在驢皮中檢出了二十一碳酸（0.49%）成分，與樊雨梅等[18]研究關于二十一碳酸為羊油和牛油特有的脂肪酸的表述不一致。

表1 驢皮、羊皮與牛皮中脂肪酸相對含量Table 1 The relative content of fatty acid in donkey skin,sheepskin and cowhide

根據(jù)結果統(tǒng)計，驢皮、羊皮與牛皮皮脂中飽和脂肪酸含量分別是34.59%、42.77%、32.27%，不飽和脂肪酸含量分別是58.83%、47.03%、62.38%；驢皮皮脂和牛皮皮脂中不飽和脂肪酸所占的比例相差不大，并且含量較高，相比之下羊皮皮脂中脂肪酸飽和程度較高。根據(jù)胡晶紅等[13]通過GC-MS 的方法測定不同動物皮脂肪中的主要成分可得，德州烏驢皮脂中飽和脂肪酸占88.82%，不飽和脂肪酸占2.69%；牛皮皮脂中飽和脂肪酸占37.62%，不飽和脂肪酸占39.74%。與本研究（GC-FID）結果差異較大，分析原因可能與提取、分析方法有關，GC-MS 的方法在定性分析方面具有絕對的優(yōu)勢，但在定量分析中并不具有優(yōu)勢。根據(jù)張秀媛等[17]研究表明，小尾寒羊皮下脂肪中，飽和脂肪酸占32.94%，不飽和脂肪酸占65.52%，則與本研究結果基本一致。

驢皮、羊皮與牛皮樣品中，肉豆蔻酸與棕櫚油酸的相對含量差異最為明顯，羊皮中肉豆蔻酸的相對含量（8.94%）約為驢皮（2.98%）和牛皮（3.03%）的3 倍，而驢皮、牛皮皮脂中棕櫚油酸的相對含量（9.98%、13.46%）為羊皮（2.78%）的3.6 倍和4.8倍。

2.3 驢皮、羊皮與牛皮皮脂中肉豆蔻酸、棕櫚油酸含量測定

脂肪酸的相對含量與皮脂的提取方法、提取溶劑種類等因素有關，干擾因素較多，難以形成穩(wěn)定的質量控制體系，因此，脂肪酸的絕對含量測定更具有質量控制的意義。本文以十七烷酸甲酯為內標，利用氣相色譜法對皮脂中肉豆蔻酸、棕櫚油酸的含量進行了含量測定。由于三種皮脂樣品中可能含有十七烷酸甲酯，因此對加內標物和不加內標物的樣品分別進行了氣相色譜分析，計算樣品中2 種脂肪酸的含量。結果如表2 所示。

表2 驢皮、羊皮與牛皮皮脂中肉豆蔻酸、棕櫚油酸含量Table 2 The content of myristic acid and palmitoleic acid in donkey skin,sheepskin and cowhide

由表2 可知，驢皮、羊皮與牛皮皮脂中肉豆蔻酸、棕櫚油酸含量差異明顯（p＜0.05）。在肉豆蔻酸含量方面，羊皮（0.46%）最高，牛皮（0.38%）次之，驢皮（0.32%）最低，差異性顯著（p＜0.05）；在棕櫚油酸含量方面，牛皮（1.62%）最高，驢皮（1.07%）次之，羊皮（0.16%）最低，差異性顯著（p＜0.05）。

根據(jù)樊雨梅等[18]研究報道了驢板油以及羊油、牛油的脂肪酸組成，其中驢油肉豆蔻酸含量1.48%，羊油含量3.78%，牛油含量2.93%。驢油中棕櫚油酸含量3.40%，羊油含量2.05%，牛油含量2.85%。與本試驗研究結果差異較大，原因可能與樣本提取部位不同有關。

3 結論

3.1 本文建立了一種基于氣相色譜法的驢皮真?zhèn)慰焖勹b別的方法。動物皮脂經(jīng)過提取并進行甲酯化處理，利用氣相色譜法初步構建了驢皮、羊皮、牛皮中總脂肪酸成分的指紋圖譜，通過面積歸一化法測定驢、羊、牛皮中各種脂肪酸的相對含量。結果表明，含量超過2%的脂肪酸依次為：1）驢皮，油酸32.30%、棕櫚酸26.33%、亞油酸12.90%、棕櫚油酸9.98%、硬脂酸4.36%、肉豆蔻酸2.98%、反油酸2.55%。2）羊皮，油酸21.97%、棕櫚酸19.48%、亞油酸18.51%、肉豆蔻酸8.94%、硬脂酸7.72%、棕櫚油酸2.78%。3）牛皮，油酸30.87 棕櫚酸25.70%、棕櫚油酸13.46%、亞油酸12.68%、硬脂酸3.54%、反油酸3.43%、肉豆蔻酸3.03%。羊皮的飽和脂肪酸較驢皮和牛皮含量高，牛皮的棕櫚油酸要比其亞油酸含量高，而驢皮的棕櫚油酸含量比其亞油酸含量低。另外，羊皮中肉豆蔻酸的相對含量約為驢皮和牛皮的3 倍，而驢皮、牛皮皮脂中棕櫚油酸的相對含量為羊皮的3.6 倍和4.8 倍。依據(jù)此可以將驢皮，羊皮和牛皮區(qū)分開。

3.2 通過內標法測定樣品中肉豆蔻酸、棕櫚油酸的絕對含量。結果表明，肉豆蔻酸含量高低順序為：羊皮0.46%、牛皮0.38%、驢皮0.32%；棕櫚油酸含量高低順序為：牛皮1.62%、驢皮1.07%、羊皮0.16%。通過數(shù)據(jù)可得三種皮脂中羊皮的肉豆蔻酸含量最高，棕櫚油酸含量最低；驢皮的肉豆蔻酸含量最低；牛皮的棕櫚油酸含量最高。因此，通過動物皮脂中豆蔻酸和棕櫚油酸含量差異性分析，可以完成對驢皮的真?zhèn)慰焖勹b別。