糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測方法研究進(jìn)展

戴煌，武旭悅，黃金發(fā)，畢潔，王加華，舒在習(xí)，肖安紅*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023）（2.大宗糧油精深加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢輕工大學(xué)，湖北武漢 430023）（3.湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023）（4.山東新希望六和集團(tuán)有限公司，山東青島 266100）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），化學(xué)名為3α,7α,15-三羥基草鐮孢菌-9-烯-8-酮，分子式為C15H20O6，相對分子量為296.32，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。DON 屬單端孢霉烯族化合物，主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生[1]，其熔點(diǎn)為151～153 ℃，易溶于水、乙醇等溶劑，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有耐熱、耐壓、耐酸、耐儲存等穩(wěn)定性能[2]，在加工過程中很難被破壞，一直是糧食生產(chǎn)加工過程中的重要隱患。

圖1 DON 化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of DON

DON 具有細(xì)胞毒性和致癌性，易引起嘔吐、不想進(jìn)食、胃腸炎、腹瀉、免疫抑制和血液病[3-6]，也稱為嘔吐毒素，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為第3 類致癌物[7]。DON 廣泛存在于食品和環(huán)境中，主要污染小麥、大麥、玉米等糧食作物，人和動物在誤食被DON 污染的食物后會產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)。DON 常與其它的真菌毒素，如黃曲霉毒素，共同污染農(nóng)作物，進(jìn)入人體后可以相互影響[8]。國家和各省市市場監(jiān)督管理局在2015～2020 年面粉的質(zhì)量抽查數(shù)據(jù)顯示，小麥粉不合格原因主要為真菌毒素超標(biāo)，其中DON 含量超標(biāo)最突出，占比高達(dá)76.60%[9]。DON 超標(biāo)成為糧食，特別是小麥安全生產(chǎn)、消費(fèi)和產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展的限制因素，對人類健康構(gòu)成很大威脅，并引發(fā)巨大經(jīng)濟(jì)損失[10-11]。

DON 對糧食的嚴(yán)重污染引起了各國的高度重視，我國GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》、美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）均規(guī)定DON 的最大限量值為1000 μg/kg；歐盟規(guī)定DON 的濃度不得超過750 μg/kg[11]。為保障食品安全、維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，準(zhǔn)確檢測糧食中DON 含量對確定DON 污染程度至關(guān)重要。各國政府、企業(yè)、消費(fèi)者以及相關(guān)專家迫切需要使用最經(jīng)濟(jì)、最有效的手段來提高糧食中DON 的可檢測性。因此，為了有效降低DON 污染，保障食品安全，需要開發(fā)準(zhǔn)確、快速的現(xiàn)場檢測技術(shù)來監(jiān)控糧食在種植、生產(chǎn)加工、流通等環(huán)節(jié)中的DON 污染水平。近年來，消費(fèi)者對食品安全越來越關(guān)注，市場對現(xiàn)場快速檢測技術(shù)需求也日益旺盛。隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，針對糧食中DON 的檢測方法也越來越多[12-13]。2017 年國家食品藥品監(jiān)管總局組織制定了《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》，為開發(fā)DON 快速檢測方法提供了標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)。本文對常見的定性定量檢測方法進(jìn)行系統(tǒng)闡述，著重概述國內(nèi)外DON 的快速檢測方法，尤其是近年來發(fā)展的現(xiàn)場快速檢測技術(shù)和方法，主要包括：薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrography，LC-MS）、高效液相色譜-質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-mass spectrography，HPLC-MS）、超高效液相色譜-質(zhì)譜法（ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）、酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、側(cè)流免疫層析法（lateral flow immunoassay strips，LFIAs）、拉曼光譜法、電化學(xué)法、表面等離子共振法（surface plasmon resonance，SPR）等。通過對各種檢測方法的基本原理、檢測效果和應(yīng)用價值進(jìn)行對比，綜述國內(nèi)外研究情況，分析各方法存在的問題，指出現(xiàn)場快速檢測發(fā)展方向，為開發(fā)出具有靈敏度高、準(zhǔn)確度強(qiáng)、便捷式、快速檢測的方法提供新思路，以期開發(fā)出滿足糧食中DON 檢測需求的新方法。

1 色譜法

1.1 薄層色譜法

薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）系將固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上成均勻薄層。根據(jù)待點(diǎn)樣展開后的比移值（Rf）與標(biāo)準(zhǔn)物色譜圖的Rf相對比進(jìn)行測定。該方法適用于糧食（小麥、玉米、大麥等）及其制品中DON的測定。DON在波長365 nm紫外光下顯藍(lán)色熒光，與標(biāo)準(zhǔn)品比較，計(jì)算其含量[14]。TLC 法的優(yōu)點(diǎn)為所需設(shè)備簡單、操作方便，檢測成本低；缺點(diǎn)在于樣品前處理復(fù)雜、操作繁瑣、費(fèi)時費(fèi)力、測定時受周圍環(huán)境影響，所得結(jié)果的準(zhǔn)確性差、誤差較大。該方法在基層糧食企業(yè)中的應(yīng)用存在局限性，難適用于糧食及飼料中DON的快速篩查和精準(zhǔn)檢測，故此方法使用較少。

1.2 液相色譜法

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）是以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器（紫外檢測器、質(zhì)譜檢測器等）進(jìn)行檢測，是DON 檢測的國標(biāo)采用方法。采用HPLC 法檢測糧食中的DON 需要對樣品進(jìn)行前處理，去除基質(zhì)干擾物，降低離子抑制，富集目標(biāo)分析物來提高分析性能。傳統(tǒng)HPLC 法對含DON的樣品前處理一般采用液/液萃取法，目前研究人員嘗試開發(fā)新型富集方法來提升檢測性能，如Karami 等[15]使用Fe3O4磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）對DON 進(jìn)行富集，并采用HPLC-紫外檢測法對其進(jìn)行分析，該方法簡便、快速、經(jīng)濟(jì)，檢測限（limit of detection，LOD）低至45 μg/kg，可用于小麥樣品中DON 的分析檢測。羅穎鵬等人[16]使用固相萃取-高效液相色譜法對小麥中的DON 進(jìn)行了測定，結(jié)果表明該檢測方法的DON 回收率達(dá)到90.12%～106.25%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為4.51%。但該方法的提取、凈化需要根據(jù)不同極性的真菌毒素采用不同的方法，操作復(fù)雜、時間長、成本高。未來需要結(jié)合DON 的性質(zhì)，針對糧食基質(zhì)復(fù)雜特點(diǎn)，開發(fā)高效、特異性強(qiáng)的萃取和凈化材料，以提高HPLC 法的檢測性能。

超高效液相色譜（UHPLC）克服了傳統(tǒng)HPLC 分離能力差、分析速度慢的缺陷，UHPLC 使用更小粒徑（＜2 μm）的包裝材料來提高分辨率和靈敏度，以及支持更高壓力（＞13000 bar）[17-18]。而串聯(lián)質(zhì)譜儀具備的高靈敏度、高選擇性以及UHPLC 的高分辨率，所以UHPLC與質(zhì)譜檢測器的結(jié)合顯示出明顯的優(yōu)勢，使得在較短的分析時間內(nèi)能同時分析多種真菌毒素，并達(dá)到較低的LOD 和定量限[17-18]。HPLC/UHPLC-MS/MS 檢測靈敏度高，但該方法前處理操作繁瑣、成本高、時間長、效率低，亟需開發(fā)適合我國糧食真菌毒素污染特點(diǎn)，便于在基層實(shí)驗(yàn)室推廣的簡便、快速、高效的檢測方法。

2 免疫法

2.1 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是把抗原-抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來的檢測技術(shù)。簡而言之，即為抗原被附著在微孔板上的特異性抗體捕獲，形成抗原-抗體復(fù)合物，然后添加顯色底物，底物被酶催化產(chǎn)生有色產(chǎn)物，如圖2b 所示。此方法易于檢測，提供了靈敏、可量化的比色信號，可用于推斷靶標(biāo)的存在與否及濃度的定量。由于所有的DON 都是半抗原，為了得到特異性好的抗體，需要將DON與蛋白質(zhì)連接形成DON-蛋白復(fù)合物來制備抗體。在抗體濃度固定時，免疫法檢測DON主要有直接競爭和間接競爭模式，如圖2 所示。

圖2 DON 的主要免疫測定模式：直接競爭（A）和間接競爭（B）Fig.2 Main immunoassay models:direct competitive (A) and indirect competitive (B)

目前對糧食中DON 的檢測多數(shù)使用直接競爭酶聯(lián)免疫法（competitive direct enzyme-linked immunosorbent assay，cd-ELISA），如圖2A所示，和間接競爭酶聯(lián)免疫法（competitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay，ci-ELISA），如圖2B 所示。cd-ELISA 具有穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能充分評價基質(zhì)效應(yīng)，適合作為糧食中DON 殘留檢測的方法。Han 等[19]建立了cd-ELISA 檢測食品和飼料 DON 的試劑盒，其線性范圍為1.00～113.24 ng/mL，LOD 為0.62 ng/mL，半數(shù)最大抑制濃度（IC50）為 6.61 ng/mL，平均回收率為77.10%～107.00%，RSD 為4.20%～11.90%。該試劑盒具有特異性高、穩(wěn)定性好、有效期長、樣品基質(zhì)干擾小等優(yōu)點(diǎn)，適用于糧食中DON 的快速篩選。目前部分商業(yè)ELISA 試劑盒已在全球市場上得到優(yōu)化和應(yīng)用，但多數(shù)試劑盒在基質(zhì)效應(yīng)、有效樣品預(yù)處理或?qū)ON 高交叉反應(yīng)性等方面評估有限，限制了其實(shí)際應(yīng)用[20]。為了克服這一缺點(diǎn)，Zhang 等[21]研究開發(fā)了一種cd-ELISA 來檢測DON，樣品的檢出限在0.15～0.48 mg/kg 之間，低于DON 在我國的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。ci-ELISA 具有快速、半定量檢測的優(yōu)點(diǎn)，Li 等[22]建立了ci-ELISA 快速、靈敏測定糧食中的DON。該方法的IC50為61.10 ng/mL，LOD 為6.12 ng/mL，表明ci-ELISA 法測定糧食樣品的可靠性。事實(shí)上，目前用于DON檢測的ELISA試劑盒對3-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-Acetyl-DON，3-AcDON）、15-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-Acetyl-DON，15-AcDON）、葡萄糖苷化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON-3-glucoside，DON-3-G）的交叉反應(yīng)性高，當(dāng)用準(zhǔn)確的LC-MS/MS作為參考對天然污染糧食中的DON 進(jìn)行分析時，ELISA 試劑盒的回收率通常超過100%，使DON 難以準(zhǔn)確定量檢測[23]。此外，由于糧食在加工過程中DON會轉(zhuǎn)化成其衍生物形式（3-AcDON，15-AcDON 等），這些衍生物具有毒性，而以往的檢測常常忽略這類衍生物，目前ELISA 法中未針對這類衍生物特異性地開發(fā)抗體來定量檢測其含量[24-25]。當(dāng)在不確定區(qū)域的法律限制范圍使用時，ELISA 法容易造成DON 類毒素的低估，引起錯誤判斷。因此，DON 商業(yè)化試劑盒應(yīng)該通過監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行嚴(yán)格檢查，針對DON 及衍生物分別開發(fā)方法進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，綜合評判DON 類毒素含量。

ELISA 靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、設(shè)備簡單，不需要專業(yè)的人員操作，可以用于實(shí)驗(yàn)室、企業(yè)、其他部門等的現(xiàn)場快速檢測。目前，市場上已有許多商業(yè)化的ELISA 試劑盒[24,26]，其準(zhǔn)確性、檢測范圍等方面都已較為成熟，可為現(xiàn)場快速篩查提供支持，特別是對滿足發(fā)展中國家和不發(fā)達(dá)國家檢測需求具有重要意義。但ELISA 法也存在不足之處，由于ELISA 是通過抗原和抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行檢測，ELISA 的性能與抗體特異性強(qiáng)弱直接相關(guān)，DON 需要與牛血清蛋白等大分子蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)后才會產(chǎn)生免疫原性，然而并不是所有的小分子物質(zhì)都能夠制造出相應(yīng)的抗體。當(dāng)前抗體制作繁瑣、成本昂貴、穩(wěn)定差，導(dǎo)致使用成本高。需要發(fā)展或合成具有高親力的親和新配體，特別是需要開發(fā)特異性強(qiáng)、穩(wěn)定好、成本低的親和配體，如適配體、重組抗體通過新突破來克服生物識別單元中特異性的限制，著眼于開發(fā)更靈敏的抗體/人工抗體，以及更廉價的抗體制備方法。

2.2 側(cè)流免疫層析法

側(cè)流免疫層析法（lateral flow immunoassay strips，LFIAs）是將特異抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品溶液后，由于毛細(xì)管虹吸作用，樣品沿著硝酸纖維素膜向前移動，當(dāng)移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷，信號帶可用肉眼定性和半定量估計(jì)，也可使用信號讀取裝置進(jìn)行量化讀取。為了保證抗體活性和有效性，在對照線上固定IgG 來捕獲抗體-標(biāo)記物，產(chǎn)生對照線信號帶來確認(rèn)，如圖3 所示。

圖3 側(cè)流免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)和檢測模式Fig.3 Structure and detection mode of lateral flow immunoassay strips

在大多數(shù)情況下，LFIAs 的敏感性通常低于ELISA[27]。為了提高LFIAs 的靈敏度，學(xué)者將目光集中于納米材料的引入，與微粒和塊狀材料相比，納米顆粒（nanoparticles，NPs）具有獨(dú)特的熱學(xué)、光學(xué)、磁性和化學(xué)性質(zhì)，同時具有出色的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和量子效應(yīng)，容易實(shí)現(xiàn)較低的檢測限、較短的檢測時間和更高的靈敏度。常用于LFIAs 的NPs 包括納米金（AuNPs）[28]、量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）[29]、普魯士藍(lán)納米顆粒（prussian blue nanoparticles，PBNPs）[30]、無定形納米炭等。Yu 等[31]建立了一種快速、簡便、低成本的LFIAs，同時檢測DON、伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）和黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）。利用抗體修飾的AuNPs 作為信號標(biāo)記物，建立競爭性抑制LFIAs 法，該法對DON、FB1和AFB1的LOD 分別為10.00 ng/mL、30.00 ng/mL 和10.00 ng/mL。為了更進(jìn)一步提高靈敏度，Tian 等[30]用PBNPs代替AuNPs 作為標(biāo)記物，用于信號產(chǎn)生和放大。通過免疫結(jié)合誘導(dǎo)的藍(lán)色PBNPs 聚集產(chǎn)生信號，利用PBNPs 具有過氧化物模擬酶催化TMB 顯色進(jìn)行信號放大。在最佳條件下，PBNPs-LFIA 試紙條的動態(tài)檢測范圍為10.00 pg/mL～1.00 μg/mL，LOD 為10.00 pg/mL。該平臺能夠快速、靈敏、低成本地檢測糧食中的DON，在傳統(tǒng)基于AuNPs 作為標(biāo)記物的基礎(chǔ)上，靈敏度增加了近1000 倍。為了實(shí)現(xiàn)DON 的現(xiàn)場檢測以及提高檢測的效率，Liu 等[28]建立了基于智能手機(jī)的定量雙重檢測模式LFIAs 帶，該設(shè)備集成了AuNPs和時間分辨熒光微球，可便捷、快速地測定糧食中多種真菌毒素，對DON 的LOD 為0.32 μg/kg，回收率在84.00%～110.00%。目前顯色信號研究中AuNPs 研究最多，需要進(jìn)一步開發(fā)新型信號標(biāo)記物來提高檢測靈敏度。

LFIAs 法通常用于低分子量化合物的測定，具有價格低廉、操作簡便、快速便捷，能通過裸眼直接讀出檢測結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用廣泛。但存在敏感性不如其他免疫法的缺點(diǎn)。在對結(jié)果進(jìn)行裸眼觀察的情況下，由于無法準(zhǔn)確記錄顏色強(qiáng)度的變化，難以實(shí)現(xiàn)定量檢測，導(dǎo)致?lián)p失了1～2 個數(shù)量級的靈敏度。隨著先進(jìn)制造技術(shù)的發(fā)展，特別是智能手機(jī)的普及，手機(jī)攝像頭將為顯色信號帶成像以及分析研究帶來便利，未來針對性開發(fā)相應(yīng)的手機(jī)APP對LFIAs信號帶的顏色強(qiáng)度進(jìn)行快速分析和定性判別，對LFIAs 的現(xiàn)場實(shí)際使用有很大推動。同時，DON 抗體的結(jié)合并不完全依賴于抗體與DON 相互作用的能力[32]，結(jié)合環(huán)境和食品基質(zhì)的干擾而導(dǎo)致假陽性結(jié)果，開發(fā)特異性強(qiáng)的抗體能有效降低假陽性率。

3 光譜法

3.1 拉曼光譜法

單色光照射在分子表面會發(fā)生散射，部分散射光與分子發(fā)生能量交換，光譜的波長會發(fā)生改變，這種光譜即為拉曼光譜[33]。光譜中尖銳的峰可用來表征物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)特性，可用于分析和鑒別相似物質(zhì)，識別未知物質(zhì)。常規(guī)拉曼散射截面分別只有紅外和熒光過程的10-6和10-14，這種低靈敏度制約了拉曼光譜的應(yīng)用[34]。為了增強(qiáng)拉曼信號，人們利用粗糙貴金屬設(shè)計(jì)來進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhancement raman spectroscopy，SERS），使其檢測限提高了4～10個數(shù)量級，在物質(zhì)快速檢測和結(jié)構(gòu)分析方面顯示出巨大的潛力[35]。

為了提高檢測的靈敏度、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性，學(xué)者開發(fā)了各種類型的納米材料對拉曼光譜信號進(jìn)行增強(qiáng)，如Tegegne 等[36]開發(fā)了聚多巴胺包裹銀納米立方核殼結(jié)構(gòu)（AgNCs@PDA）對飼料中DON 進(jìn)行定量檢測。AgNCs@PDA 超薄PDA 殼層（1.60 nm）襯底通過氫鍵和π-π堆積作用增強(qiáng)了DON 的吸收，提高了襯底的穩(wěn)定性，增強(qiáng)因子高達(dá)1.82×107，LOD 低至飛秒級（0.82 fmol/L）。Li 等[37]在涂有聚二甲基硅氧烷的陽極氧化鋁表面濺射AuNPs，制備了花椰菜型3D-SERS 基底，三維納米花椰菜SERS 基底可以實(shí)現(xiàn)玉米中AFB1、玉米赤霉烯酮（ZEN）和DON 的同時無標(biāo)記檢測，LOD 分別為1.80 ng/mL、47.70 ng/mL和24.80 ng/mL。該基底具有顯著的SERS效應(yīng)和活性，有望成為快速、無標(biāo)記檢測的SERS 基底。為了實(shí)現(xiàn)DON 的快速檢測，Liu 等[38]使用雙光子聚合法制備了200～600 nm 的納米柱陣列作為SERS 基底，通過主成分分析法可對兩種真菌毒素進(jìn)行快速鑒別。SERS 基底的制作對信號增強(qiáng)程度至關(guān)重要，甚至直接決定SERS 法的最終檢測性能。制作信號增強(qiáng)高、穩(wěn)定、簡便的基底是研究重點(diǎn)，隨著柔性材料的發(fā)展，制作柔性SERS 基底來更好得貼合在被檢測物體表面，更容易實(shí)現(xiàn)原位檢測和實(shí)時監(jiān)控，是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

3.2 近紅外光譜法

近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIRs）技術(shù)是通過獲取待測物樣本組成成分和分子結(jié)構(gòu)的無損檢測技術(shù)，具有高效、低成本以及多組分同時檢測等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[39]。Peiris 等[40]利用傅里葉變換近紅外光譜（FT-NIR）對小麥?zhǔn)斋@籽粒樣品中DON 含量進(jìn)行評價，在1000～2500 nm 光譜范圍，對試驗(yàn)樣品DON 含量的預(yù)測相關(guān)系數(shù)R2=0.62，預(yù)測均方根誤差為8.01×10-6，對低/高 DON 含量小麥的分類準(zhǔn)確率分別為60.80%～82.30%和82.30%～94.00%。FT-NIR 可以用于快速預(yù)篩選小麥污染情況。Liang 等[41]利用可見NIRs和短波NIRs 快速、無損檢測受赤霉病感染加工而成的小麥粉，利用遺傳算法篩選波長，并建立支持向量機(jī)判別模型，該方法對被DON 感染超標(biāo)的小麥粉鑒別準(zhǔn)確率達(dá)到96.00%。He 等[42]利用可見-NIRs 和計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)模擬了正常小麥和受DON 污染小麥籽粒的在線識別系統(tǒng)，建立了基于光譜和紋理特征的線性判別分析模型，其識別準(zhǔn)確率分別為95.06%和91.36%，可用于受DON 污染小麥的在線檢測，具有很強(qiáng)實(shí)際應(yīng)用價值。

光譜法具有靈敏、可靠、無損、實(shí)時的優(yōu)點(diǎn)，不需要均質(zhì)、萃取、使用染料或其他標(biāo)記劑，也無需對樣品進(jìn)行預(yù)處理，檢測范圍廣且檢測過程無污染，能夠真正地實(shí)現(xiàn)快速、無損檢測。同時，結(jié)合計(jì)算機(jī)技術(shù)，光譜法可進(jìn)行實(shí)時、實(shí)地在線監(jiān)測和快速速篩查，極大地提高了分析效率，具有很強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價值。實(shí)際應(yīng)用中需要注意的是，樣本品種、產(chǎn)地、生長時間對光譜信號有干擾，并最終影響模型的準(zhǔn)確度和檢測限，需采集大量的樣本光譜和實(shí)際測量值進(jìn)行定標(biāo)建模。隨著大數(shù)據(jù)和人工智能技術(shù)的發(fā)展，建立糧食中DON 污染情況的指紋庫，對糧食中的DON 含量進(jìn)行智能化判別和預(yù)測，甚至對DON 污染和危害情況進(jìn)行風(fēng)險評估，是未來發(fā)展的方向。拉曼光譜儀器精密高、功能完備、價格昂貴，難以適應(yīng)我國食品行業(yè)大規(guī)模檢測的要求。因此，開發(fā)便攜式拉曼光譜儀是拉曼技術(shù)在食品檢測業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵。

4 生物傳感器方法

生物傳感器是以生物活性單位（如酶、抗體、核酸、細(xì)胞等）作為生物敏感基元，對被測目標(biāo)物具有高度選擇性的檢測器。通過各種物理、化學(xué)信號轉(zhuǎn)換器（如氧電極、光敏管、場效應(yīng)管、壓電晶體等）捕捉目標(biāo)物與敏感基元之間的反應(yīng)，將反應(yīng)程度用離散或連續(xù)的電信號表達(dá)出來，從而檢測出被測物的濃度[43-44]。常用生物傳感方法有電化學(xué)生物傳感法和表面等離子共振法等。

4.1 電化學(xué)法

電化學(xué)分析法是根據(jù)溶液中物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)及其變化規(guī)律，建立在以電位、電導(dǎo)、電流和電量等電學(xué)量與被測物質(zhì)濃度之間計(jì)量關(guān)系的基礎(chǔ)之上，對組分進(jìn)行定性和定量的分析方法，其結(jié)構(gòu)和檢測模式如圖4 所示。電化學(xué)分析法一般采用三電極系統(tǒng)，包含工作電極、對電極和參比電極。常用的信號檢測方法有：循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）、差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）、方波伏安法（square wave voltammetry，AWV）、電化學(xué)阻抗譜法（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）等。

圖4 電化學(xué)法的結(jié)構(gòu)和檢測模式Fig.4 Structure and detection mode of electrochemical analysis

電化學(xué)法具有靈敏度高、操作簡便、反應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全、疾病檢測和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。Valera 等[45]采用DON 生物功能化磁性粒子（DON-BSAMP）和CdSNP-DON 作為電化學(xué)納米探針，建立電化學(xué)免疫傳感器檢測DON，CdSNPs 釋放的鎘離子在工作電極上被還原，并通過陽極AWV 法讀取電信號，LOD 為342.40 μg/kg，低于歐盟規(guī)定的DON 最大殘留限量。為了提高檢測性能，一般在工作電極表面修飾功能材料，這些功能材料的修飾，提升了工作電極的電子傳導(dǎo)效率，同時能提高抗原、抗體或適配體在界面的負(fù)載量，進(jìn)而提高檢測靈敏度。Lu 等[46]使用DPV 法對玉米中DON 進(jìn)行快速、靈敏地檢測，利用AuNPs-聚吡咯-還原氧化石墨烯納米復(fù)合膜修飾工作電極，復(fù)合物能有效固定抗體，增強(qiáng)電導(dǎo)率和生物相容性。在最適條件下，該方法對DON 檢測的線性范圍為0.05～1.00 mg/L，LOD為8.60 μg/L。該傳感器可在多種毒素共存環(huán)境中特異性檢測DON，表現(xiàn)出高靈敏度和抗基質(zhì)干擾性能。單一目標(biāo)物檢測方案限制了電化學(xué)法應(yīng)用，需要開發(fā)多分析物傳感器和陣列對DON 進(jìn)行快速篩查。Wei 等[47]開發(fā)了3D 打印的“蜂窩”電化學(xué)生物傳感器，開發(fā)的碳納米纖維/明膠甲基丙烯酰基導(dǎo)電復(fù)合水凝膠具有良好加工性能，能很好印在8 通道絲網(wǎng)印刷碳電極上，使用EIS 法來評估DON、3-ADON 和15-ADON 的毒性，發(fā)現(xiàn)DON、3-AcDON 和15-AcDON 的濃度在0.10～10.00 μg/mL、0.05～100.00 μg/mL 和0.10～10.00 μg/mL 范圍內(nèi)時，對應(yīng)的LOD 分別為0.07 μg/mL、0.10 μg/mL 和0.06 μg/mL，該方法可以評價真菌毒素的綜合毒性，提高了檢測效率。

與光譜法和色譜法相比，電化學(xué)法更便宜、簡單、易于小型化，且具有成本低廉、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、響應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，但電化學(xué)法存在基質(zhì)干擾、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。近年來，比表面積大、生物相容性好、導(dǎo)電性好的納米材料，如QDs、碳納米管、石墨烯、MNPs、納米聚合物等受到了廣泛關(guān)注[48]。具有多孔結(jié)構(gòu)的三維（3D）層次結(jié)構(gòu)因其高的表面體積比，比傳統(tǒng)的納米晶體顯示出獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)[49]。基于納米材料的電化學(xué)免疫傳感器在糧食檢測中的應(yīng)用也越來越受到人們的關(guān)注，為了驗(yàn)證電化學(xué)檢測方法的可靠性，應(yīng)對電化學(xué)法與納米材料進(jìn)行更深層的研究，充分探索電化學(xué)法的性能、使用范圍和條件。隨著微納加工制造技術(shù)的發(fā)展，特別是微流控技術(shù)的發(fā)展和成熟，將清洗、富集、孵育、檢測等操作步驟集成在一個平臺上能有效提高檢測效率，降低成本。

4.2 表面等離子共振法

當(dāng)入射光以一定的入射角照射到金表面時，一部分光能穿過金層與金表面層中的電子耦合，電子由于激發(fā)在平行于金屬表面方向上移動，發(fā)生表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR），物質(zhì)附著在金屬表面時會導(dǎo)致SPR 頻率變化，即SPR 共振角變化[50]，如圖5a 所示。當(dāng)DON與SPR 傳感器芯片上抗體或者適配體結(jié)合時，會引起金屬表面質(zhì)量濃度的變化，產(chǎn)生明顯的SPR 信號響應(yīng)，如圖5b 所示。

圖5 （a）SPR 原理圖和（b）抗體修飾SPR 芯片直接檢測DON的傳感圖Fig.5 (a) the schematic diagram and (b) senorgram for the direct SPR detection of DON using antibody coated chip

SPR 技術(shù)具有高選擇性、高靈敏度、高通量、實(shí)時監(jiān)測和低樣品消耗等優(yōu)點(diǎn)，在檢測方面發(fā)揮著重要的作用。Choi 等[51]利用分子印跡（molecular imprinting，MIP）技術(shù)與SPR 傳感器相結(jié)合來檢測DON。在模板分子DON 存在下，將吡咯電聚合到裸Au-SPR 芯片上制備了聚合物，分子印跡聚吡咯（MIPPy）-SPR 傳感器對 DON 的檢測范圍為0.10～100.00 ng/mL，檢測限＞1.00 ng/mL。該方法對DON、3-AcDON 和15-AcDON 的選擇性效率分別為100.00%、19.00%和44.00%，選擇性強(qiáng)。SPR 法可同時檢測糧食中多種真菌毒素，如Wei 等[52]建立了利用SPR 技術(shù)同時檢測玉米和小麥中AFB1、赭曲霉毒素A、ZEN 和DON，其LOD 分別為0.59 ng/mL、7.07 ng/mL、1.27 ng/mL 和3.26 ng/mL，四種真菌毒素的交叉反應(yīng)性均較低，與HPLC-MS/MS 分析結(jié)果具有很好的一致性。SPR 方法具有靈敏度高、實(shí)時、免標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，但是SPR 法也存在設(shè)備體積大、價格昂貴、消費(fèi)者較難承受的問題，限制了該方法的實(shí)際應(yīng)用。目前SPR 法在理論研究中不足，需要進(jìn)一步探索，同時對應(yīng)的設(shè)備應(yīng)往小型化、便捷化方向發(fā)展。

5 結(jié)論與展望

DON 是小麥中檢出率最高、危害最嚴(yán)重的真菌毒素之一，已成為關(guān)系糧食安全和食品安全的重要問題。開發(fā)準(zhǔn)確、快速的現(xiàn)場檢測方法對實(shí)時了解DON的污染情況，針對性地對其進(jìn)行防控，以及對確保糧食和食品安全具有重要意義。在本文綜述的方法中，TCL 法操作簡便，但樣品前處理復(fù)雜、易受周圍環(huán)境影響，結(jié)果準(zhǔn)確性差、靈敏度低，難以廣泛使用。傳統(tǒng)的LC/LC-MS/HPLC/HPLC-MS 檢測方法結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，是國標(biāo)中采用的方法，但需要專業(yè)性強(qiáng)的技術(shù)人員和高昂精密的儀器，樣本的前處理繁瑣，不適合于現(xiàn)場、快速檢測。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，快速、簡便、特異、靈敏、低耗的DON 檢測方法是未來發(fā)展的方向。其中ELISA 和LFIAs 法操作簡便、成本低，結(jié)果可以通過肉眼直接觀察，可用于現(xiàn)場快速檢測和篩查，具有很強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用潛力，但其靈敏度不高，難以實(shí)現(xiàn)定量檢測。光譜法可以實(shí)現(xiàn)快速、簡單、可重復(fù)、無損傷的定性定量分析，無需前處理，可用于DON 的在線快速篩查，具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力，但存在需要建立大量樣本模型，SERS 基底制作穩(wěn)定性差的不足。電化學(xué)分析法成本低廉、靈敏度高、體積小，已被證明是很有實(shí)際應(yīng)用價值的檢測方法。以上介紹的傳統(tǒng)和新型檢測方法各有優(yōu)勢，需要結(jié)合實(shí)際情況選取合適的檢測方法。未來主要發(fā)展方向有：（1）在免疫法檢測中，需要發(fā)展或合成具有高親力的親和新配體，特別是需要開發(fā)特異性強(qiáng)、穩(wěn)定好、成本低的親和配體，通過新突破來克服生物識別單元中特異性的限制來提高檢測靈敏度，避免嚴(yán)重的基質(zhì)干擾。利用生物技術(shù)開發(fā)更靈敏的納米抗體和人工抗體，以及更廉價的抗體制備方法。（2）在ELISA 法和電化學(xué)法中，酶活性是影響檢測性能的關(guān)鍵因素，可以通過改善酶的熱穩(wěn)定性或者開發(fā)新材料/酶增加熱穩(wěn)定性。最近研究表明，部分納米材料具有類似酶的特性和良好的熱穩(wěn)定性，可用于構(gòu)建新型傳感器[53]。還可以將酶固定在納米材料內(nèi)部/表面，以提高酶催化環(huán)境的穩(wěn)定性。（3）在電化學(xué)方法中，開發(fā)新型簡便的修飾方法將酶/抗體固定在納米材料上，降低電子轉(zhuǎn)移電阻、納米材料對酶/抗體活性影響，來提高電極的穩(wěn)定性、靈敏度、選擇性和使用壽命。（4）需要開發(fā)高效的分離、富集技術(shù)對樣本進(jìn)行前處理，縮短樣品處理時間，同時避免基質(zhì)效應(yīng)和非特異性吸附等問題。（5）隨著便攜式拉曼光譜儀的開發(fā)，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)圖庫的建立，拉曼成像技術(shù)的提高以及新型的拉曼技術(shù)（如紫外拉曼和時間分辨拉曼等）的應(yīng)用，拉曼技術(shù)將會在DON檢測有廣泛的應(yīng)用前景。由于糧食成分復(fù)雜，環(huán)境中的污染無法徹底消除，目前DON 的檢測方法難以在糧食安全指標(biāo)測試中便捷使用，需要進(jìn)一步研究。我們相信DON 檢測技術(shù)將在未來得到更多的發(fā)展，來滿足靈敏度、簡便性、智能性和便攜性的需求。