lncRNA PRKCQ-AS1調(diào)控miR-143-3p/IL-6/STAT3通路影響肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

石 鑫 陳 虎 王 威 張敬坡（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院肝膽外科，石家莊 050000）

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展以及醫(yī)療水平的提高，肝癌的治療手段已不再局限于傳統(tǒng)手段，靶向治療正逐漸成為肝癌治療的主要途徑之一，而治療靶點(diǎn)的選擇對(duì)于靶向治療至關(guān)重要［1］。研究表明lncRNA參與了多種疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控過(guò)程，有望成為新型腫瘤診斷標(biāo)志物和腫瘤治療的靶點(diǎn)［2］。研究報(bào)道lncRNA PRKCQ-AS1的上調(diào)與結(jié)直腸癌患者生存率的顯著降低有關(guān)，其具有預(yù)后價(jià) 值［3］。抑 制PRKCQ-AS1的 表 達(dá) 通 過(guò) 調(diào) 節(jié)miR-1287-5p/YBX1軸抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力［4］。然而lncRNA PRKCQ-AS1對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及可能的機(jī)制尚未清楚。有研究報(bào)道m(xù)iR-143-3p可通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因FGF1的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲［5］。circ_0003998通過(guò)使miR-143-3p海綿化，促進(jìn)肝細(xì)胞癌的上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化［6］。此外，重組人IL-37b通過(guò)抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［7］。PHACTR4通過(guò)抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路抑制人肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［8］。以上說(shuō)明miR-143-3p和IL-6/STAT3信號(hào)通路均影響肝癌進(jìn)展。且有研究報(bào)道m(xù)iR-143-3p靶向IL-6R/STAT3通路抑制IL-6誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成［9］。說(shuō)明miR-143-3p可調(diào)控IL-6/STAT3信號(hào)通路。此外，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)lncRNA PRKCQ-AS1可靶向結(jié)合miR-143-3p。推測(cè)lncRNA PRKCQ-AS1可能通過(guò)靶向調(diào)控miR-143-3p調(diào)控IL-6/STAT3信號(hào)通路。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究lncRNA PRKCQ-AS1是否通過(guò)調(diào)控miR-143-3p和IL-6/STAT3信號(hào)通路影響肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 選取河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院2017年1月至2020年1月收治的48例肝癌患者的癌組織及相應(yīng)的癌旁組織，患者手術(shù)前未進(jìn)行過(guò)手術(shù)及放化療，所有患者均知情且同意。

1.1.2 細(xì)胞與試劑 正常人肝上皮細(xì)胞THLE-3、肝癌細(xì)胞系MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1（美國(guó)ATCC）；RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；熒光定量試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）；RIPA蛋白裂解液（北京百奧萊博科技有限公司）；BCA試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；MTT試劑盒（美國(guó)Sciencell公司）；Transwell小室、Matrigel（美國(guó)BD公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（日本同仁研究所）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（美國(guó)GeneCopoeia公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理與分組THLE-3和肝癌細(xì)胞系MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1均用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞Hep3B，將si-NC、si-PRKCQ-AS1、pcDNA-NC、pc-DNA-PRKCQ-AS1、miR-NC、miR-143-3p、anti-miRNC、anti-miR-143-3p轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞中，記為si-NC組、si-PRKCQ-AS1組、pcDNA-NC組、pcDNAPRKCQ-AS1組、miR-NC組、miR-143-3p組、antimiR-NC組、anti-miR-143-3p組；將si-PRKCQ-AS1分別與anti-miR-NC、anti-miR-143-3p轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞中，記為si-PRKCQ-AS1+anti-miR-NC組、si-PRKCQ-AS1+anti-miR-143-3p組。

1.2.2 RT-qPCR檢 測(cè)lncRNA PRKCQ-AS1、miR-143-3p和IL-6 mRNA表達(dá)水平 提取組織及細(xì)胞總RNA，合成cDNA后進(jìn)行PCR，循環(huán)條件為95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法 計(jì) 算。PRKCQ-AS1和miR-143-3p分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，PRKCQ-AS1上游引物序列：5'-TCACGCTAGAAAGGGCTTGT-3'，下游引物序列：5'-GCTGTTATCCGTTTGCCATT-3'；IL-6上游引物序列：5'-TTGACAAACAAATTCGGTACA-3'，下游引物序列：5'-GAGGTGCCCATGCTACA-3'；GAPDH上游引物序列：5'-GATACACGGAGCACCAGGTT-3'，下游引物序列：5'-AACAGCAAAGGGGTCACATC-3'；miR-143-3p上游引物序列：5'-TGAGATGAAGCACTGTAGCTC-3'，下游引物序列：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；U6上游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取總蛋白并用BCA試劑盒進(jìn)行定量，取50μl蛋白樣品于10%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳，而后轉(zhuǎn)至PVDF膜（0.45μm孔徑）上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后加入一抗4℃過(guò)夜，加入二抗室溫孵育1 h，用ECL發(fā)光液顯影，用Quantity One軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin為參照計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，每孔加入的MTT溶液20μl，孵育4 h加入DMSO 150μl，振蕩反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度（A）值，代表細(xì)胞增殖活性。

1.2.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 無(wú)血清培養(yǎng)各組細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液（5×105個(gè)/ml）；細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：分別將100μl細(xì)胞懸液和600μl含血清培養(yǎng)液加入到Transwell上室和下室，培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定30 min、0.1%結(jié)晶紫染色30 min，在200倍的顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)目，取其平均值；細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：用Matrigel包被Transwell上室，然后按遷移實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，PBS漂洗2次，用結(jié)合緩沖液重懸，加入10μl的Annexin V-FITC，再加入5μl的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRKCQ-AS1對(duì)miR-143-3p的靶向調(diào)控 構(gòu)建含有miR-143-3p結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA PRKCQ-AS1野生型及突變型報(bào)告基因載體，將其與miR-143-3p mimics轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞中，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在肝癌細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA PRKCQ-AS1和miR-143-3p表達(dá)情況 與正常人肝上皮細(xì)胞THLE-3比較，肝癌細(xì)胞系MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1中l(wèi)nc-RNA PRKCQ-AS1表達(dá)水平升高，miR-143-3p表達(dá)水平降低（P＜0.05，表1）。

表1 肝癌細(xì)胞系中miR-143-3p和lncRNA PRKCQ-AS1表達(dá)量（±s，n=9）Tab.1 Expressions of miR-143-3p and lncRNA PRKCQAS1 in liver cancer cell lines（±s，n=9）

表1 肝癌細(xì)胞系中miR-143-3p和lncRNA PRKCQ-AS1表達(dá)量（±s，n=9）Tab.1 Expressions of miR-143-3p and lncRNA PRKCQAS1 in liver cancer cell lines（±s，n=9）

Note：Compared with THLE-3，1）P＜0.05；THLE-3.Normal human liver epithelial cells.

Groups THLE-3 MHCC97H Hep3B SK-HEP-1 FP lncRNA PRKCQ-AS1 1.00±0.10 2.43±0.211）2.04±0.181）1.82±0.171）113.644 0.000 miR-143-3p 1.02±0.11 0.35±0.031）0.45±0.041）0.53±0.051）186.439 0.000

2.2 lncRNA PRKCQ-AS1低 表達(dá) 對(duì)Hep3B肝癌 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。與si-NC組比較，si-PRKCQ-AS1組肝癌細(xì)胞Hep3B中PRKCQ-AS1表達(dá)水平降低，C-myc、MMP2、MMP9表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平升高，細(xì)胞A值降低，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。

圖1 lncRNA PRKCQ-AS1低表達(dá)對(duì)Hep3B肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Fig.1 Effect of low expression of lncRNA PRKCQ-AS1 on proliferation，migration，invasion and apoptosis of Hep3B liver cancer cells

表2 lncRNA PRKCQ-AS1低表達(dá)對(duì)Hep3B肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of low expression of lncRNA PRKCQ-AS1 on proliferation，migration，invasion and apoptosis of Hep3B liver cancer cells（±s，n=9）

表2 lncRNA PRKCQ-AS1低表達(dá)對(duì)Hep3B肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of low expression of lncRNA PRKCQ-AS1 on proliferation，migration，invasion and apoptosis of Hep3B liver cancer cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC，1）P＜0.05.

Groups NC si-NC si-PRKCQ-AS1 FP PRKCQ-AS1 1.00±0.10 1.02±0.11 0.43±0.041）127.861 0.000 C-myc 0.95±0.08 0.94±0.09 0.34±0.041）204.652 0.000 Cleavedcaspase-3 0.34±0.03 0.31±0.02 0.76±0.071）275.661 0.000 MMP2 0.82±0.08 0.84±0.07 0.42±0.041）117.488 0.000 MMP9 0.73±0.07 0.71±0.06 0.37±0.031）117.574 0.000 A 1.024±0.09 1.104±0.10 0.534±0.051）124.820 0.000 Cell migration number 243.00±21.43 239.00±20.73 114.00±10.251）146.140 0.000 Cell invasion number 161.00±15.43 153.00±13.23 71.00±7.041）144.800 0.000 Apoptosis rate（%）6.35±0.61 6.41±0.54 27.69±2.591）556.213 0.000

2.3 miR-143-3p高表達(dá)對(duì)Hep3B肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-143-3p組肝癌細(xì)胞Hep3B中miR-143-3p表達(dá)水平升高，C-myc、MMP2、MMP9表達(dá)水平降低，Cleavedcaspase-3表達(dá)水平升高，細(xì)胞A值降低，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）（圖2、表3）。

表3 miR-143-3p高表達(dá)對(duì)Hep3B肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of high expressions of miR-143-3p on proliferation，migration，invasion and apoptosis of Hep3B liver cancer cells（±s，n=9）

表3 miR-143-3p高表達(dá)對(duì)Hep3B肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of high expressions of miR-143-3p on proliferation，migration，invasion and apoptosis of Hep3B liver cancer cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-143-3p t P miR-143-3p 1.00±0.10 1.73±0.131）13.353 0.000 C-myc 0.96±0.08 0.48±0.041）16.100 0.000 Cleavedcaspase-3 0.32±0.03 0.82±0.081）17.556 0.000 MMP2 0.85±0.08 0.45±0.041）13.416 0.000 MMP9 0.74±0.07 0.32±0.031）16.545 0.000 A 1.086±0.09 0.469±0.041）18.794 0.000 Cell migration number 239.00±20.11 138.00±12.141）12.899 0.000 Cell invasion number 157.00±13.16 82.00±7.631）14.791 0.000 Apoptosis rate（%）6.48±0.62 21.53±1.921）22.378 0.000

圖2 Western blot檢測(cè)C-myc、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)Fig.2 Western blot detects expressions of C-myc，Cleavedcaspase-3，MMP2 and MMP9 protein

2.4 LncRNA PRKCQ-AS1靶向miR-143-3p Starbase預(yù)測(cè)顯示miR-143-3p和lncRNA PRKCQ-AS1有結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。miR-143-3p與PRKCQ-AS1的野生型報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性降低（P＜0.05），而miR-143-3p與PRKCQ-AS1的突變型報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著變化（P＞0.05，表4）。與pcDNA-NC組比較，pcDNA-PRKCQAS1組miR-143-3p表達(dá)水平降低；與si-NC組比較，si-PRKCQ-AS1組miR-143-3p表達(dá)水平升高（P＜0.05，表5）。

圖3 Starbase對(duì)miR-143-3p和lncRNA PRKCQ-AS1結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖Fig.3 Schematic diagram of Starbase's prediction of binding of miR-143-3p and lncRNA PRKCQ-AS1

表4 miR-NC或miR-143-3p與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)（±s，n=9）Tab.4 Detection of dual luciferase activity after co-transfection of miR-NC or miR-143-3p and reporter plasmid into Hep3B cells（±s，n=9）

表4 miR-NC或miR-143-3p與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)（±s，n=9）Tab.4 Detection of dual luciferase activity after co-transfection of miR-NC or miR-143-3p and reporter plasmid into Hep3B cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-143-3p t P Luciferase activity WT 1.00±0.08 0.43±0.041）19.118 0.000 MUT 1.01±0.10 0.98±0.09 0.669 0.513

表5 qRT-PCR檢 測(cè)lncRNA PRKCQ-AS1的 表 達(dá)（±s，n=9）Tab.5 qRT-PCR to detect expression of lncRNA PRKCQAS1（±s，n=9）

表5 qRT-PCR檢 測(cè)lncRNA PRKCQ-AS1的 表 達(dá)（±s，n=9）Tab.5 qRT-PCR to detect expression of lncRNA PRKCQAS1（±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA-NC，1）P＜0.05；compared with si-NC，2）P＜0.05.

Groups pcDNA-NC pcDNA-PRKCQ-AS1 si-NC si-PRKCQ-AS1 FP miR-143-3p 1.00±0.10 0.47±0.041）1.03±0.11 1.98±0.162）288.341 0.000

2.5 低表達(dá)miR-143-3p可以逆轉(zhuǎn)lncRNA PRKCQAS1低表達(dá)對(duì)Hep3B增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-143-3p組miR-143-3p表達(dá)水平降低，C-myc、MMP2、MMP9表達(dá)水平升高，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平降低，細(xì)胞A值升高，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)增加，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與si-PRKCQ-AS1+anti-miR-NC組比較，si-PRKCQ-AS1+anti-miR-143-3p組miR-143-3p表 達(dá) 水平 降 低，C-myc、MMP2、MMP9表 達(dá) 水 平 升 高，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平降低，細(xì)胞A值升高，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)增加，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05，圖4、表6）。

表6 低表達(dá)miR-143-3p可以逆轉(zhuǎn)lncRNA PRKCQ-AS1低表達(dá)對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 Low expression of miR-143-3p can reverse effect of low expression of lncRNA PRKCQ-AS1 on Hep3B cell proliferation，migration，invasion and apoptosis（±s，n=9）

表6 低表達(dá)miR-143-3p可以逆轉(zhuǎn)lncRNA PRKCQ-AS1低表達(dá)對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.6 Low expression of miR-143-3p can reverse effect of low expression of lncRNA PRKCQ-AS1 on Hep3B cell proliferation，migration，invasion and apoptosis（±s，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC，1）P＜0.05；compared with si-PRKCQ-AS1+anti-miR-NC，2）P＜0.05.

Groups anti-miR-NC anti-miR-143-3p si-PRKCQ-AS1+anti-miR-NC si-PRKCQ-AS1+anti-miR-143-3p FP miR-143-3p 1.00±0.10 0.43±0.041）2.05±0.18 1.28±0.112）291.209 0.000 C-myc 0.97±0.09 1.36±0.121）0.36±0.03 0.86±0.072）215.862 0.000 Cleavedcaspase-3 0.35±0.03 0.07±0.011）0.77±0.071）0.40±0.042）397.440 0.000 MMP2 0.84±0.08 1.24±0.111）0.41±0.04 0.73±0.072）169.824 0.000 MMP9 0.72±0.07 1.08±0.091）0.34±0.03 0.65±0.062）189.857 0.000 A 1.071±0.11 1.489±0.121）0.547±0.05 0.892±0.082）156.283 0.000 Cell migration number 245±21.43 296±25.441）111±9.68 214±19.662）138.170 0.000 Cell invasion number 151±12.59 227±21.621）76±7.41 121±10.522）183.306 0.000 Apoptosis rate（%）6.53±0.61 2.39±0.211）26.88±2.69 9.64±0.912）491.890 0.000

圖4 Western blot檢測(cè)C-myc、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)Fig.4 Western blot detects expressions of C-myc，Cleavedcaspase-3，MMP2 and MMP9 proteins

2.6 IL-6/STAT3信號(hào)通路基因表達(dá) 與si-NC組比較，si-PRKCQ-AS1組IL-6 mRNA和p-STAT3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-143-3p組IL-6 mRNA和p-STAT3蛋 白表 達(dá)水平升高（P＜0.05）；與si-PRKCQ-AS1+anti-miR-NC組比較，si-PRKCQ-AS1+anti-miR-143-3p組IL-6 mRNA和p-STAT3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），而STAT3表達(dá)水平無(wú)顯著變化（圖5、表7）。

圖5 Western blot檢測(cè)STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)Fig.5 Western blot detection of STAT3 and p-STAT3 protein expressions

表7 IL-6/STAT3信號(hào)通路基因表達(dá)（±s，n=9）Tab.7 Gene expression of IL-6/STAT3 signaling pathway（±s，n=9）

表7 IL-6/STAT3信號(hào)通路基因表達(dá)（±s，n=9）Tab.7 Gene expression of IL-6/STAT3 signaling pathway（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC，1）P＜0.05；compared with anti-miR-NC，2）P＜0.05；compared with si-PRKCQ-AS1+anti-miR-NC，3）P＜0.05.

Groups NC si-NC si-PRKCQ-AS1 anti-miR-NC anti-miR-143-3p si-PRKCQ-AS1+anti-miR-NC si-PRKCQ-AS1+anti-miR-143-3p FP IL-6 mRNA 1.00±0.11 1.02±0.09 0.43±0.041）1.04±0.10 1.86±0.152）0.46±0.04 0.87±0.073）234.933 0.000 p-STAT3 protein 0.86±0.08 0.88±0.07 0.32±0.03 1）0.85±0.08 1.28±0.112）0.36±0.02 0.78±0.063）198.770 0.000 STAT3 protein 0.91±0.09 0.87±0.08 0.93±0.09 0.86±0.09 0.88±0.09 0.94±0.09 0.90±0.09 0.986 0.426

2.7 在肝癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA PRKCQ-AS1、IL-6/STAT3及miR-143-3p表達(dá)情況 與癌旁組織相比，肝癌組織中l(wèi)ncRNA PRKCQ-AS1表達(dá)水平升高，miR-143-3p表達(dá)水平降低，IL-6及p-STAT3表達(dá)水平升高（P＜0.05）；而STAT3表達(dá)水平無(wú)顯著變化（P＞0.05，表8、圖6）。

表8 肝癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA PRKCQ-AS1、IL-6/STAT3及miR-143-3p表達(dá)情況（±s，n=48）Tab.8 Expression of lncRNA PRKCQ-AS1，IL-6/STAT3 and miR-143-3p in cancer tissues of patients with liver cancer（±s，n=48）

表8 肝癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA PRKCQ-AS1、IL-6/STAT3及miR-143-3p表達(dá)情況（±s，n=48）Tab.8 Expression of lncRNA PRKCQ-AS1，IL-6/STAT3 and miR-143-3p in cancer tissues of patients with liver cancer（±s，n=48）

Note：Compared with para-cancerous tissue group，1）P＜0.05.

Groups Para-cancerous tissue Cancerous tissue t P lncRNA PRKCQ-AS1 1.00±0.10 3.89±0.351）55.006 0.000 miR-143-3p 1.00±0.11 0.43±0.041）33.739 0.000 IL-6 0.32±0.03 0.74±0.071）38.208 0.000 p-STAT3 0.41±0.04 0.83±0.081）32.533 0.000 STAT3 0.80±0.07 0.78±0.08 1.304 0.196

圖6 Western blot檢測(cè)IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)Fig.6 Western blot detects expression of IL-6，STAT3 and p-STAT3 protein

3 討論

研究表明lncRNA可參與如細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種病理過(guò)程，其在肝癌中的異常表達(dá)可能提供潛在的預(yù)后或診斷生物標(biāo)志物［10］。研究報(bào)道lncAKHE通過(guò)激活NOTCH2信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)肝細(xì)胞癌的細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移［11］。LncRNA CASC2通過(guò)調(diào)節(jié)miR-24-3p抑制肝癌細(xì)胞的生存能力并誘導(dǎo)其凋亡［12］。lncRNA FER1L4的上調(diào)通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移［13］。以上研究表明多種lncRNA參與肝癌的進(jìn)展過(guò)程，而lncRNA PRKCQ-AS1在肝癌中的作用尚不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了肝癌患者組織及肝癌細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA PRKCQ-AS1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，lnc-RNA PRKCQ-AS1高表達(dá)，提示PRKCQ-AS1可能在肝癌中起促癌作用。為研究lncRNA PRKCQ-AS1在肝癌中的作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步低表達(dá)lncRNA PRKCQ-AS1，結(jié) 果 顯 示 肝 癌 細(xì) 胞Hep3B中C-myc、MMP2、MMP9表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平升高，細(xì)胞活性值降低，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率升高；表明lncRNA PRKCQ-AS1低表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞Hep3B增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究報(bào)道lncRNA MALAT1可能通過(guò)使miR-143-3p變海綿來(lái)調(diào)節(jié)ZEB1的表達(dá)并促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展［13］。lncRNA LOXL1-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-143-3p抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡［14］。說(shuō)明miR-143-3p可受lncRNA的調(diào)控，進(jìn)而參與腫瘤進(jìn)展，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)lncRNA PRKCQ-AS1與miR-143-3p具有結(jié)合位點(diǎn)，且通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)lncRNA PRKCQAS1靶向調(diào)控miR-143-3p。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞系中miR-143-3p表達(dá)水平降低；miR-143-3p高表達(dá)抑制了肝癌細(xì)胞Hep3B的增殖、遷移和侵襲，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而低表達(dá)miR-143-3p逆轉(zhuǎn)了lncRNA PRKCQ-AS1低表達(dá)對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。提示，lncRNA PRKCQ-AS1可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-143-3p影響肝癌細(xì)胞的進(jìn)展。

研究報(bào)道lncRNA TPTEP1通過(guò)影響IL-6/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)抑制肝癌細(xì)胞的進(jìn)展［15］。lncRNA DANCR通過(guò)激活肝癌細(xì)胞中的IL-6/STAT3信號(hào)來(lái)促進(jìn)索拉非尼耐藥［16］。lncRNA THOR通過(guò)激活I(lǐng)L-6/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移［17］。以上研究表明lncRNA可通過(guò)調(diào)控IL-6/STAT3信號(hào)通路影響包括肝癌在內(nèi)的腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。為研究lncRNA PRKCQ-AS1是否通過(guò)調(diào)控IL-6/STAT3信號(hào)通路影響肝癌進(jìn)展，本實(shí)驗(yàn)在抑制lncRNA PRKCQ-AS1表達(dá)后檢測(cè)了IL-6 mRNA和p-STAT3的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示IL-6 mRNA和p-STAT3蛋白表達(dá)水平降低；表明lncRNA PRKCQ-AS1低表達(dá)可抑制IL-6/STAT3通路激活。而miR-143-3p和PRKCQ-AS1同時(shí)低表達(dá)時(shí)，IL-6 mRNA和p-STAT3蛋白表達(dá)水平升高；說(shuō)明低表達(dá)miR-143-3p逆轉(zhuǎn)了PRKCQ-AS1低表達(dá)對(duì)IL-6/STAT3通路的影響。

綜上所述，lncRNA PRKCQ-AS1低表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)miR-143-3p進(jìn)一步抑制IL-6/STAT3通路抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。