中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)檢測方法的研究進(jìn)展①

馬雪妮 程 龍 許慧梅 楊一蕃 張德奎（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，蘭州 730030）

中性粒細(xì)胞是人外周血中最豐富的白細(xì)胞，約占白細(xì)胞總數(shù)的50%～70%，在先天免疫系統(tǒng)中扮演重要角色，是機(jī)體應(yīng)對病原體入侵時(shí)的第一道防線，可通過吞噬作用、脫顆粒、產(chǎn)生活性氧等多種途徑抵御外界病原體的入侵［1］。除以上方式外，作為一種有別于細(xì)胞壞死和凋亡的特殊細(xì)胞死亡程序，中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）在機(jī)體先天性免疫中同樣也發(fā)揮重要作用。越來越多的證據(jù)表明，NETs在宿主穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮雙重作用，既能保護(hù)宿主免受病原體的侵襲，也參與組織損傷、炎癥進(jìn)展、血栓形成，引起一系列病理生理學(xué)改變，導(dǎo)致相應(yīng)自身免疫性/炎癥性疾病和代謝性疾?。?-4］。因此，NETs作為機(jī)體多種自身免疫性/炎癥性疾病、代謝性疾病、血栓、腫瘤等病理生理過程的重要參與者和標(biāo)志物，檢測其濃度具有重要的臨床意義。因其組成部分的復(fù)雜性、釋放類型的差異性及釋放過程中的易降解性，NETs目前沒有檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，本文結(jié)合國內(nèi)外研究對NETs檢測方法的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 NETs概述

1996年，TAKEI等［5］使用佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）刺激中性粒細(xì)胞時(shí)觀察到，中性粒細(xì)胞的分葉核退縮、擴(kuò)散，繼而核膜破裂，核內(nèi)成分釋放到細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜破裂。此過程不同于發(fā)生核固縮和細(xì)胞質(zhì)空泡化的細(xì)胞凋亡，也不同于保持核膜完整性的細(xì)胞壞死。2004年，BRINKMANN等［6］將該過程中釋放到胞外的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)正式命名為NETs。隨著后續(xù)研究的不斷深入，NETs被認(rèn)為是以DNA為骨架，其間鑲嵌有組蛋白（H1、H2A、H2B、H3、H4）、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、乳鐵蛋白、鈣衛(wèi)蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）、組織蛋白酶G、穿透素3（pentraxin 3，PTX3）、明膠酶、LL37、肽聚糖結(jié)合蛋白等顆粒蛋白、蛋白水解酶和抗菌肽等［7］。目前已發(fā)現(xiàn)，除細(xì)菌、真菌、原生動物、病毒等病原體外，一些化學(xué)或生物因素：如PMA、IL-8、TNF-α、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、活化的血小板、ROS、補(bǔ)體因子5a（complementary 5a，C5a）、Toll樣受體、補(bǔ)體因子C3、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、碳酸酐酶抑制劑（carbonic anhydrase inhibitor，CaI）、葡聚糖（β-glucan，BG）、葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GO）、過氧化氫（H2O2）等也可誘導(dǎo)NETs的形成［5，8-11］。

中性粒細(xì)胞形成NETs的過程稱為NETosis，研究證實(shí)，不同的刺激物作用于中性粒細(xì)胞后NETs的形成方式有所不同［12］：①自殺式NETosis：作為最早發(fā)現(xiàn)的NETosis類型，該過程主要依賴于ROS的產(chǎn)生及PAD4介導(dǎo)的核染色體解聚，不需要半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine-containing aspartatespecific proteases，Caspase）的參與［13］。JORCH等［7］描述了其具體過程：中性粒細(xì)胞受PMA等刺激后通過蛋白激酶C（PKC）激活Raf/MERK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）氧化酶，進(jìn)而刺激ROS產(chǎn)生，從而組蛋白在肽?；彼崦搧啺访?（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）的作用下向瓜氨酸化組蛋白轉(zhuǎn)變，形成瓜氨酸化的組蛋白，其中瓜氨酸化的組蛋白H3（cit-H3）發(fā)揮重要作用，并導(dǎo)致核染色體的解聚（圖1A）。②細(xì)胞核DNA釋放式NETosis：與自殺式NETosis不同，該過程不依賴于ROS的產(chǎn)生和Raf/MERK/ERK信號通路的激活。Toll樣受體和補(bǔ)體C3蛋白等可觸發(fā)此種類型的NETosis，釋放NETs后的中性粒細(xì)胞壽命不受影響，且細(xì)胞核膜和細(xì)胞膜的完整性不被破壞，仍具有運(yùn)動、趨化、吞噬病原體的能力，此過程約持續(xù)5～60 min［7］。但該模式具體的發(fā)生機(jī)制尚不清楚（圖1B）。③線粒體DNA釋放式NETosis：主要由于中性粒細(xì)胞受到GM-CSF、C5a或LPS刺激形成，該過程同樣依賴于ROS的產(chǎn)生，持續(xù)約15 min［7，12］。

圖1 自殺式NETosis（A）與細(xì)胞核DNA釋放式NETosis（B）Fig.1 Suicidal NETosis（A）and vital NETosis（B）

2 體外檢測方法

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）是一種基于抗原與抗體特異性結(jié)合以及酶催化反應(yīng)建立的方法，通過酶與抗體或抗原偶聯(lián)形成酶偶聯(lián)物，當(dāng)抗原與抗體特異結(jié)合時(shí)，酶偶聯(lián)物催化無色底物分子轉(zhuǎn)化為易于檢測的產(chǎn)物。通過底物信號的變化可以判斷免疫反應(yīng)是否發(fā)生，進(jìn)而分析目標(biāo)物（抗原/抗體）的濃度。為了定量測定中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清液及小鼠和人血漿中的NETs，研究者通過ELISA檢測NETs的重要組分——NE、MPO及cit-H3等，從而間接地證明了NETs的存在，同時(shí)進(jìn)行定量分析［14-15］。此外，作為一種新的檢測方法，基于ELISA的檢測原理，MPO-DNA復(fù)合物、NE-DNA復(fù)合物、組蛋白-DNA復(fù)合物同樣能夠在細(xì)胞培養(yǎng)液及小鼠和人血漿中檢測到［16-17］。該方法靈敏、快速且成本低，可實(shí)現(xiàn)自動化，但重復(fù)性差，對自身免疫性疾病早期階段的診斷具有一定價(jià)值。

2.2 細(xì)胞免疫熒光染色 免疫熒光技術(shù)利用了抗原與抗體高度特異性結(jié)合的原理，將某種可測定的物質(zhì)偶聯(lián)到抗體或抗原上，通過檢測標(biāo)記物的有無和含量，對樣品中待檢抗原或抗體進(jìn)行定性、定位和定量檢測。由于NETs的主要骨架是DNA，因此廣泛使用嵌入性DNA染料（如DAPI、Hoechst 33342、PI、SYTOX Orange或SYTOX Green）等檢測NETs。DAPI是一種常用的標(biāo)記細(xì)胞核的熒光染料，其可與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合，常用于標(biāo)記固定細(xì)胞的細(xì)胞核。Hoechst 33342也是一種常用的標(biāo)記細(xì)胞核的熒光染料，其可選擇性地與細(xì)胞核中的雙鏈DNA相結(jié)合，常用于活細(xì)胞的細(xì)胞核標(biāo)記。與之相反，SYTOX Green和SYTOX Orange不能透過細(xì)胞膜，可標(biāo)記細(xì)胞外DNA，其中SYTOX Orange固有熒光可忽略不計(jì)，但與雙鏈DNA結(jié)合后熒光增強(qiáng)較大（約450倍）［18］。PERDOMO等［14］分別用Hoechst 33342和SYTOX Green標(biāo)記總DNA及細(xì)胞外DNA，后用激光共聚焦顯微鏡觀察，以此對NETs進(jìn)行定位及相對定量檢測。隨著對NETs的深入研究，基于針對NET組分的抗體結(jié)合嵌入性DNA染料的技術(shù)逐漸成為定性和半定量檢測NET的首選方法，如CAUDRILLIER等［19］利用PMA刺激從健康志愿者外周血分離的中性粒細(xì)胞以產(chǎn)生NETs，繼而固定、破膜，與MPO、組蛋白、CD41抗體共同孵育，Hoechst 33342對DNA進(jìn)行復(fù)染，最后熒光共聚焦顯微鏡觀察到以上成分共定位，從而實(shí)現(xiàn)了在體外對NETs進(jìn)行定性、定位及相對定量檢測。然而，為了解決該過程極易洗掉NETs，從而影響檢測的準(zhǔn)確性這一問題，PROUST等［20］提出了一種僅需1步，無須任何清洗，通過熒光顯微鏡觀察的方法檢測NETs，該方法以GreenGloTMDNA為染料，可通過不同的激發(fā)波長來區(qū)分核DNA和細(xì)胞外DNA（即NETs）。同時(shí)，這種染色適用于貼壁和非貼壁細(xì)胞，有望實(shí)現(xiàn)對其他細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和單核細(xì)胞）細(xì)胞外誘捕網(wǎng)的檢測。此外，對于結(jié)果的解讀，不同觀察者間存在較大的差異，易受到主觀臆測的干擾。KRAAIJ等［21］借助3D共聚焦顯微鏡觀察NETs，并用自動圖像分析技術(shù)對NETs進(jìn)行定量分析來解決這一問題。

2.3 熒光光譜法SYOX染料除了可用于免疫熒光染色，同樣也可通過熒光光譜法對細(xì)胞DNA進(jìn)行檢測，該方法同樣基于NETs以DNA為骨架，與熒光顯微鏡相比，其主要的優(yōu)勢在于可以實(shí)現(xiàn)高通量、快速檢測［22］。PicoGreen是一種超敏的核酸熒光染料，可利用細(xì)胞總DNA為100%計(jì)算釋放的NETDNA的百分比，從而定量檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的游離DNA（cf-DNA）。LI等［3］研究發(fā)現(xiàn)，與健康志愿者相比，UC和CD患者血漿中以cf-DNA為代表的NETs水 平 升 高。同 樣，VAN AVONDT等［23］借 助PicoGreen試劑盒檢測中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的cf-DNA，在熒光板讀數(shù)器進(jìn)行讀數(shù)，激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為520 nm。盡管這種方法具有高度的客觀性和定量性，但并非所有的cf-DNA均來自NETs，因此，有研究指出，在人或?qū)嶒?yàn)動物外周血及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中采用PicoGreen檢測NETs需排除死細(xì)胞，從而增加其測定的特異性［22，24］。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）FCM是一種能夠?qū)蝹€細(xì)胞或生物微顆粒的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行定量分析和分選的檢測手段，具有高效、快速、精準(zhǔn)、多參數(shù)和高通量等優(yōu)點(diǎn)，是目前先進(jìn)的細(xì)胞定性和定量分析技術(shù)之一。目前，主要有兩種基于FCM的方法來檢測NETs，首先，針對NETs關(guān)鍵成分的抗體，特別是cit-H3和MPO，以及DNA染料，在缺陷性自殺式NETosis的小鼠模型中（PAD4-/-小鼠）通過與免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡觀察進(jìn)行比較，驗(yàn)證了該方法的有效性［25］?？偠灾?，該方法可以快速、可靠地分析每個樣品數(shù)千個細(xì)胞，并且可排除不同觀察者造成的偏倚。由于該方法基于對cit-H3抗體的特異性染色，研究證明細(xì)菌及病原體刺激cit-H3缺陷型小鼠后，可以檢測到NETs的存在，因此該種方法可能會忽略對cit-H3陰性NETs的檢測［26］。第二種則是ZHAO等［27］將流式細(xì)胞術(shù)與熒光顯微鏡相結(jié)合定量檢測NETs的形成，即所謂的高速多光譜成像流式細(xì)胞術(shù)。利用透射光（明場），側(cè)向散射光（SSC）和細(xì)胞組分的多個熒光圖像（DNA和MPO）來對核的形態(tài)進(jìn)行顯像（大小、質(zhì)地和相對亞細(xì)胞位置）。借助這種方法可以區(qū)分細(xì)胞核釋放式和自殺式NETosis。ZHARKOVA等［18］基于流式細(xì)胞術(shù)在混合細(xì)胞群對NETs進(jìn)行高通量及定量檢測，此方法主要通過標(biāo)記SYTOX Orange、DAPI和中性粒細(xì)胞（CD66或Ly6G）來檢測混合細(xì)胞群中的NETs，此方法最主要的優(yōu)勢在于無需對中性粒細(xì)胞進(jìn)行純化。以上技術(shù)的局限性在于將檢測的重點(diǎn)集中在當(dāng)前正在進(jìn)行中的NETosis，可能會忽略已經(jīng)溶解或處于NETosis晚期的細(xì)胞。以上兩種基于FCM的方法均可對中性粒細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行自動、定量和快速分析，并使NETosis作為臨床前及臨床研究中的潛在生物標(biāo)志物成為可能。

2.5 電子顯微鏡技術(shù) 電子顯微鏡技術(shù)是利用電鏡的高分辨率、高放大倍率等特點(diǎn)來分析研究物體的組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征的一種方法。NETs可通過透射電鏡（TEM）和掃描電鏡（SEM）進(jìn)行定性檢測。BRINKMANN等［6］通過以上兩種技術(shù)，而IMLAU等［28］利用TEM來區(qū)分細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡和NETosis之間的差異。TEM能夠顯示釋放NETs細(xì)胞的形態(tài)，例如核膜的裂解，而SEM則能顯示NETs的細(xì)微結(jié)構(gòu)。當(dāng)對IL-8刺激中性粒細(xì)胞進(jìn)行超薄冷凍切片取樣時(shí)，通過基于SEM的免疫法可以檢測到與NETs相關(guān)的組蛋白和NE，同時(shí)證明了NETs并不與細(xì)胞膜結(jié)合，具有捕獲病原體的能力［6］。在此后的許多研究中，由于其可視化的特性，SEM和TEM逐漸成為檢測NETs的重要手段，如YIN等［29］借助SEM及共聚焦顯微鏡觀察到PMA刺激硫化氫預(yù)先處理的中性粒細(xì)胞時(shí)，NETs的生成明顯減少。然而，必須要提到的是，REMIJSEN等［30］在滲出液中利用SEM檢測NETs時(shí)發(fā)現(xiàn)，NETs和血液中纖維蛋白之間的形態(tài)差異并不明顯，需要再次通過免疫熒光顯微鏡對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

3 原位及體內(nèi)檢測方法

3.1 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot，WB）WB技術(shù)是通過免疫學(xué)手段，即把聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳中分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，利用抗原抗體特異性結(jié)合來檢測固定在支撐膜上的蛋白質(zhì)，從而對靶蛋白進(jìn)行定性和半定量分析的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。DINALLO等［2］通過構(gòu)建DSS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，利用WB法檢測到小鼠結(jié)腸組織中MPO、NE、cit-H3的表達(dá)量明顯高于對照組。肽?；彼崦搧啺访?（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）能夠作用于組蛋白，使其向瓜氨酸化轉(zhuǎn)變，形成瓜氨酸化的組蛋白，并導(dǎo)致核染色體的解聚，WB法同樣可以檢測到結(jié)腸組織中的PAD4表達(dá)量升高，而使用選擇性PAD4的抑制劑——鏈黑菌素（streptonigrin）能夠降低PAD4的表達(dá)量，從而緩解DSS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。此外，PERDOMO等［14］在肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥（HIT）小鼠模型（FcγRⅡA+/hPF4+）中檢測到cit-H3的存在，由此證明NETosis是肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥中血栓形成的主要驅(qū)動力。WB法的優(yōu)點(diǎn)是可以從蛋白表達(dá)方面對NETs相關(guān)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析，但其缺點(diǎn)則在于費(fèi)時(shí)，變量多，蛋白樣品的制備過程易受各種因素的影響。

3.2 組織免疫熒光染色BRINKMANN［6］等首次在自發(fā)性闌尾炎組織標(biāo)本中通過對NE、cit-H3、DNA共染色確定了NETs的成分。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的體內(nèi)研究通過免疫熒光技術(shù)對實(shí)驗(yàn)動物和人體組織中的NETs進(jìn)行測定，如DINALLO等［2］在UC、CD患者和DSS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎組織中通過組織免疫熒光染色檢測NETs。同樣，鼻內(nèi)滴注LPS能夠誘導(dǎo)肺內(nèi)NETs的產(chǎn)生，以上結(jié)果在組織免疫熒光染色后，MPO、cit-H3和DNA在肺組織內(nèi)熒光共定位得以驗(yàn)證［31］。有趣的是，MUNOZ等［32］通過免疫熒光染色檢測到膽結(jié)石患者的膽結(jié)石及膽泥中存在NETs。然而，由于其操作步驟煩瑣，洗滌過程易洗掉NETs，結(jié)果解讀過程中易受觀察者影響等原因，其在體內(nèi)檢測NETs的應(yīng)用受到了一定的限制。

3.3 活體成像技術(shù) 為了觀察正在進(jìn)行NETosis中的NETs及該過程中的影響因素，活細(xì)胞成像技術(shù)目前成為在體內(nèi)檢測NETs的一種重要手段。早在2006年，BUCHANAN等［33］已經(jīng)通過DNA嵌入染料將組織病理學(xué)顯微鏡和活細(xì)胞成像進(jìn)行比較，從而證明了細(xì)菌產(chǎn)生的DNase，NETs降解和致病性之間的相關(guān)性。后來，F(xiàn)UCHS等［34］利用相差、Calcein Blue（活體染料），Annexin V（死亡標(biāo)記物）和組蛋白標(biāo)記物，通過隨時(shí)間變化的活細(xì)胞成像技術(shù)對PMA活化的中性粒細(xì)胞進(jìn)行檢測，由此得出的結(jié)論是，中性粒細(xì)胞釋放NETs時(shí)會死于活動性細(xì)胞死亡。LU等［35］將抗磷脂綜合征（APS）患者體內(nèi)的中性粒細(xì)胞分離后，予以不同物質(zhì)刺激2 h后，Hoechst 33342和SYTOX Green對DNA進(jìn)行標(biāo)記，可觀察到APS患者體內(nèi)NETs的生成明顯增加。NETs原位檢測的一種特殊情況是將實(shí)驗(yàn)動物處死后立即進(jìn)行活細(xì)胞成像，無須固定特定的器官。37℃PBS包埋煙曲霉菌感染的肺組織，并用SYTOX染料染色后利用雙光子顯微鏡進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，從而實(shí)現(xiàn)了原位實(shí)時(shí)監(jiān)測NETs的形成過程［36］。

3.4 活體顯微鏡技術(shù) 近年來，通過活體顯微鏡對形成NETs的活細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)記錄已成為體內(nèi)檢測NETs形成研究中不可或缺的一種選擇。CLARK等［37］通過活體顯微鏡在肝竇中檢測血小板活化后產(chǎn)生的NETs。基于活體檢測技術(shù)，YIPP等［38］假設(shè)，有活性的中性粒細(xì)胞通過囊泡的形式釋放NETs。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，他們將體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與旋轉(zhuǎn)盤共聚焦活體顯微鏡相結(jié)合，即使用金黃色葡萄球菌感染小鼠外化的皮膚，并在2 h內(nèi)使用SYTOX染料監(jiān)測NETs的形成過程，從而得出的結(jié)論是，形成NETs的中性粒細(xì)胞并未立即死亡，由此作者提出存在兩種不同的NETs形成機(jī)制，即自殺式和細(xì)胞核釋放式NETosis［7］。隨著活體研究的不斷深入，多光子顯微鏡、旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、雙光子和落射熒光顯微鏡分別用于檢測肺臟、肝葉、靜脈中形成的NETs［39-41］。此外，最近的一項(xiàng)研究報(bào)道了一種全自動的圖像處理方法，該法采用了最新提出的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）模型，即MaskR-CNN，基于實(shí)時(shí)成像技術(shù)并使用DNA染料對NETs進(jìn)行定性及定量檢測。此法的優(yōu)點(diǎn)在于實(shí)現(xiàn)了高通量、客觀、簡單，無須特殊儀器檢測，但需要大量數(shù)據(jù)對模型進(jìn)行訓(xùn)練以滿足圖像處理過程［42］。

4 結(jié)語

研究表明，特定的中性粒細(xì)胞受到感染或炎癥刺激后產(chǎn)生NETs。通常，由于顯微鏡技術(shù)操作煩瑣、耗時(shí)，易受觀察者主觀影響等缺點(diǎn)，在一定程度上限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用，而FCM的優(yōu)勢在于可以對選定的細(xì)胞群進(jìn)行進(jìn)一步分選，例如，區(qū)分細(xì)胞核釋放式和自殺式NETosis的細(xì)胞。因此，將FCM與共聚焦顯微鏡成像技術(shù)結(jié)合已成為目前體外檢測NETs的首選方法。定量體內(nèi)NETs的研究尚處于初級階段，隨著活體顯微鏡技術(shù)的不斷發(fā)展和精密儀器的綜合使用，使得區(qū)分導(dǎo)致NETs形成不同表型的特定信號傳導(dǎo)過程成為可能。因此，不同的活細(xì)胞成像方法與體內(nèi)或原位實(shí)驗(yàn)相結(jié)合逐漸成為NETs在監(jiān)測感染、自身免疫/炎癥性疾病、腫瘤、血栓等疾病的極佳方法。然而，要完全了解NETs在生理和病理狀態(tài)下的作用，還需進(jìn)一步改進(jìn)其定性及定量檢測方法，從而實(shí)現(xiàn)簡單、快速、低成本、高準(zhǔn)確性、自動化檢測。