膈下逐瘀湯“異病同治”子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征的作用機制探討

徐嘉碧，梁齊桁，郭雯雯，程蘭

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405；2廣東省中醫(yī)院婦科；3肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系

子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）和多囊卵巢綜合征（PCOS）是婦科常見病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對其發(fā)病機制均不甚清楚，治療手段十分有限，而中醫(yī)確有一定的優(yōu)勢。祖國醫(yī)學(xué)認為，EMs的主要病機是氣血失和，沖任損傷，致經(jīng)血不循常道而逆行，化為瘀血阻滯沖任和胞宮；而PCOS發(fā)病以腎虛為主，致肝失疏泄，肝氣郁結(jié)，氣滯血行受阻，形成瘀血阻滯沖任、胞宮；兩者的共同病機是“氣滯血瘀”。膈下逐瘀湯出自清代《醫(yī)林改錯》，是治療氣滯血瘀證的代表方，臨床上治療氣滯血瘀證EMs和PCOS療效顯著［1-5］。但膈下逐瘀湯成分多，作用靶基因復(fù)雜，如何“異病同治”EMs和PCOS的分子機制仍不清楚，依靠傳統(tǒng)藥理學(xué)的研究方法難以有效闡明其作用機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是新興的中藥復(fù)方研究方法，通過構(gòu)建“藥物—成分—靶基因”網(wǎng)絡(luò)，運用網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)方法發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)核心，能對中藥復(fù)方的復(fù)雜機制進行整體研究，有助于發(fā)現(xiàn)膈下逐瘀湯治療“氣滯血瘀證”的核心機制。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析膈下逐瘀湯對EMs和PCOS“異病同治”的分子作用機制。

1 資料與方法

1.1 膈下逐瘀湯活性成分及作用靶基因篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TC‐MSP，https：//www.tcmsp-e.com/）在線下載獲取膈下逐瘀湯中每一味中藥的活性成分，根據(jù)活性成分的藥物動力學(xué)吸收、分布、代謝、排泄（ADME）參數(shù)，篩選口服生物利用度（OB）≥30%，以及類藥物指數(shù)（DL）≥0.18的活性成分。每個活性成分的作用靶基因通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取，并篩選出屬于人類的靶基因，用于構(gòu)建“中藥—化合物—靶基因”網(wǎng)絡(luò)。

1.2 EMs、PCOS疾病相關(guān)靶基因篩選 及其與膈下逐瘀湯作用靶基因的共有靶基因獲取本研究通過MalaCards人類疾病數(shù)據(jù)庫（https：//www.malac‐ards.org/）和CTD數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org/）獲得與EMs、PCOS疾病相關(guān)的靶基因，CTD數(shù)據(jù)庫獲得的疾病相關(guān)靶基因按照“有直接證據(jù)”或推斷得分≥20進行篩選，篩選獲得的相關(guān)靶基因用于下游分析。將以上EMs、PCOS疾病相關(guān)靶基因與“1.1”中獲得的膈下逐瘀湯作用靶基因取交集，獲得“異病同治”的共有靶基因。交集韋恩圖使用在線韋恩圖工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制。將膈下逐瘀湯的藥物、活性成分及上述共有靶基因?qū)隒ytoscape3.8.2軟件構(gòu)建“藥物—化合物—靶基因”網(wǎng)絡(luò)，展示膈下逐瘀湯藥物、活性成分與共有靶基因蛋白的作用情況。

1.3 膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS共有靶基因的基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析 使用R4.1.0軟件和clusterPro‐filer包對共有靶基因進行GO和KEGG信號通路富集分析，以了解共有靶基因的功能和所涉及信號通路。將共有靶基因輸入enrichGO和enrichKEGG函數(shù)，校正P值方法選擇FDR。校正P值<0.05的GO條目或信號通路被認為是顯著富集，與研究疾病完全無關(guān)的信號通路會被剔除。

1.4 膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS共有靶基因的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶基因的篩選 將共有靶基因輸入STRING11.5在線數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），構(gòu)建共有靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，以了解靶基因間的相互作用。蛋白間相互作用的強度以聯(lián)合分數(shù)（combined score）衡量，以分數(shù)>0.9作為篩選標(biāo)準。PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)蛋白互作圖，并使用cytoHubba和MCODE插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，以篩選膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS的核心靶基因和核心子網(wǎng)絡(luò)。Cyto‐Hubba插件計算的最大派系中心度（MCC）用于衡量靶基因蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，MCODE插件用于聚類核心子網(wǎng)絡(luò)。

1.5 膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS核心成分與核心靶基因的分子對接驗證 使用SwissDock在線分子對接工具（http：//www.swissdock.ch/），選取“1.4”中篩選出的重要核心靶基因，與作用于這些靶基因的膈下逐瘀湯核心成分進行分子對接，以進一步驗證成分分子和靶基因的相互作用，并可具體了解其結(jié)合能力強弱。核心靶基因的三維結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）獲取，膈下逐瘀湯成分分子的結(jié)構(gòu)（mol2格式）從TCMSP網(wǎng)站下載。靶基因蛋白與分子的結(jié)合能力用結(jié)合自由能ΔG衡量，并設(shè)定ΔG<－5 kcal/mol為結(jié)合具有顯著性，以進一步驗證膈下逐瘀湯成分與EMs、PCOS核心靶基因的相互作用。

2 結(jié)果

2.1 膈下逐瘀湯活性成分及作用靶基因篩選結(jié)果 在TCMSP在線數(shù)據(jù)庫分別檢索膈下逐瘀湯成分，共獲得活性成分1 349個，其中甘草280個、川芎189個、紅花189個、烏藥128個、當(dāng)歸125個、赤芍119個、香附104個、延胡索77個、桃仁66個、丹皮55個、枳殼17個。按照OB≥30%和DL≥0.18篩選并去重后，共獲得活性成分261個。這些活性成分共檢索到306個人類蛋白藥物靶基因。

2.2 膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS的共有靶基因獲取結(jié)果 通過檢索MalaCards和CTD在線數(shù)據(jù)庫，并按照“有直接證據(jù)”或推斷得分≥20進行篩選，共獲得EMs相關(guān)靶基因485個，PCOS相關(guān)靶基因2494個。將上述EMs、PCOS相關(guān)靶基因與306個膈下逐瘀湯作用靶基因取交集，獲得共有靶基因69個：MMP2、MAOA、CYP1A1、PTGES、CYP19A1、GNRH1、LDLR、SPP1、PTGS2、CTNNB1、CCND1、ESR1、VEGFA、TGFB1、CCNA2、TIMP1、GSK3B、SLC2A1、MMP3、GSTM1、IL-10、EGFR、SOD1、AKR1B1、NCOA1、RB1、CDK2、RUNX2、PGR、CX‐CL10、TP53、AKR1C1、IL-1B、NFKBIA、ESR2、CYP1B1、PTGER3、PTEN、GJA1、FASN、CLDN4、RXRA、APOB、PPARG、CXCL8、SELE、NR3C1、HSD3B1、CHUK、BAD、CCL2、IL-6、KDR、SULT1E1、PPARA、MAOB、IGF2、FOS、IFNG、CAV1、BCL2L1、VCAM1、AKR1C3、PTGS1、F3、JUN、AR、MMP9、ADI‐POQ。膈下逐瘀湯藥物靶基因與EMs、PCOS兩種疾病相關(guān)靶基因的交集關(guān)系用韋恩圖可視化，見圖1。膈下逐瘀湯“異病同治”EMs、PCOS的“藥物—活性成分—作用靶基因”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。此網(wǎng)絡(luò)由279個節(jié)點、1 538條邊組成，其中矩形節(jié)點為藥物，三角形節(jié)點為活性化學(xué)成分，圍繞同一矩形節(jié)點的三角形表示該藥物的活性化學(xué)成分，橢圓形節(jié)點為共有靶基因?？梢?，同一化學(xué)成分可作用于多個靶基因，提示膈下逐瘀湯可通過多成分、多靶點作用于EMs、PCOS。

2.3 膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS共有靶基因的GO和KEGG通路富集分析結(jié)果 對69個共有靶基因進行GO信號通路富集分析，共得出生物過程（BP）1 548個、分子功能（MF）109個、細胞成分（CC）44個；KEGG信號通路富集分析共得到校正P值小于0.05的通路共15條。其中，BP包括對類固醇激素的反應(yīng)、對酮體的反應(yīng)、細胞對化學(xué)壓力的反應(yīng)、多細胞生物體過程、女性懷孕、對脂多糖的反應(yīng)、對細菌來源的分子的反應(yīng)、對雌二醇的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細胞對活性氧的反應(yīng)等；CC包括RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復(fù)合物、細胞器外膜、外膜、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合體等；MF包括胞核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、細胞因子活性、甾體激素受體活性、DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體配體活性、信號受體激活劑活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、類固醇結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合等。顯著富集的KEGG信號通路主要有與炎癥相關(guān)的IL-17信號傳導(dǎo)途徑、TNF信號傳導(dǎo)途徑、Toll樣受體信號傳導(dǎo)途徑、Th17細胞分化，與血管相關(guān)的脂質(zhì)和動脈硬化、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化，與激素相關(guān)的內(nèi)分泌抵抗、卵巢類固醇生成、類固醇激素的生物合成、甲狀腺激素信號傳導(dǎo)途徑、雌激素信號傳導(dǎo)途徑，其他的有PI3K-Akt信號通路、子宮內(nèi)膜癌、人乳頭瘤病毒感染、局部黏附等信號通路。

圖1 膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS共有靶基因韋恩圖

圖2 膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS“藥物—成分—共有靶基因”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS共有靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶基因篩選結(jié)果 將69個共有靶基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建靶基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件分析后獲得膈下逐瘀湯“異病同治”EMs、PCOS共有靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，以展示靶基因間的相互作用關(guān)系，如圖3A。圖中節(jié)點為共有靶基因蛋白，邊為蛋白間的相互關(guān)系。PPI網(wǎng)絡(luò)圖包括62個節(jié)點，192條邊，平均度值為0.97，提示這些共有靶基因間存在直接的相互關(guān)系。蛋白質(zhì)相互作用聯(lián)合分數(shù)排名靠前的分別為CTNNB1與JUN、ESR1與JUN、FOS與JUN等。為了確定PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶基因，使用CytoHubba插件計算出MCC分值，靶基因蛋白顏色按分值從低到高用“黃色—紅色”標(biāo)記。得分較高的核心靶基因包括IL-10、IL-6、JUN、IL-18、CCL2、CXCL8、MMP9等，表明這些靶基因在膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS中具更為重要作用。為了確定PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心子網(wǎng)絡(luò)，使用MCODE插件進行模塊分析，共有4個子網(wǎng)絡(luò)，見圖3B～3E。子網(wǎng)絡(luò)1包括IL-1B、CCL2、CXCL8、CXCL10，子 網(wǎng) 絡(luò)2包 括VEGFA、MMP2、MMP3、MMP9、TIMP1，子網(wǎng)絡(luò)3包 括IL-6、IL-10、IFNG、JUN、NR3C1、AR、NCOA1、ADIPOQ，子網(wǎng)絡(luò)4包括AKR1C1、AKR1C3、HSD3B1、CYP19A1、SULT1E1。同一模塊中的蛋白間存在著緊密聯(lián)系，各模塊均具有生物學(xué)意義，其中子網(wǎng)絡(luò)1和3與與炎癥因子、炎癥趨化因子以及對炎癥的反應(yīng)有關(guān)，子網(wǎng)絡(luò)2與血管生成有關(guān)，子網(wǎng)絡(luò)4與類固醇激素/卵巢激素合成信號通路有關(guān)，表明這4個子網(wǎng)絡(luò)中的靶基因和所涉及的功能或通路在膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS中起到關(guān)鍵作用。

圖3 膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS共有靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)與核心子網(wǎng)絡(luò)

2.5 膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS核心成分與核心靶基因的分子對接結(jié)果 MCC得分排名前3的核心靶基因為IL-10、IL-6、JUN，作用于上述核心靶基因的膈下逐瘀湯核心成分有8種，分別是木犀草苷、槲皮素、芍藥苷、β-谷甾醇、甲醛、山奈酚、β-胡蘿卜素和金釵素。將核心靶基因IL-10、IL-6、JUN與膈下逐瘀湯8種核心成分進行線上分子對接，結(jié)果顯示膈下逐瘀湯8種核心成分與核心靶基因IL-10、IL-6、JUN的結(jié)合自由能在-8.30～-6.43 kcal/mol，均小于-5 kcal/mol，提示膈下逐瘀湯成分能與核心靶基因形成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)。其中，IL-10與槲皮素結(jié)合性最強，IL-6與芍藥苷結(jié)合性最強，JUN與β-胡蘿卜素結(jié)合性最強。以上結(jié)果表明，這8個成分是膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS的核心成分，它們可能通過與IL-10、IL-6或JUN直接結(jié)合后激活下游通路發(fā)揮治療作用。

3 討論

EMs和PCOS均是婦科中常見且復(fù)雜、難治的疾病。EMs作為一種慢性、難治性疾病，臨床常見進行性加重的盆腔疼痛、盆腔包塊及不孕等癥狀，且該病具有雌激素依賴的特性，術(shù)后復(fù)發(fā)率可高達40%以上，嚴重影響患者的健康和生活質(zhì)量［6］。西醫(yī)在治療EMs臨床癥狀及預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)方面，首選激素治療，但其不良反應(yīng)及復(fù)發(fā)率高仍是臨床應(yīng)用的問題所在［7］。而中醫(yī)藥治療EMs在降低術(shù)后復(fù)發(fā)率、改善不良反應(yīng)、改善臨床癥狀等方面療效顯著［8］。PCOS是一種復(fù)雜的、病因不明的異質(zhì)性疾病，病程長，存在生殖功能障礙與糖代謝異常并存的特點，常導(dǎo)致女性排卵障礙性不孕、月經(jīng)失調(diào)和高雄激素等。西醫(yī)治療PCOS主要針對患者具體癥狀及生育要求對癥治療，首選生活方式干預(yù)、藥物治療等保守性治療。單純運用西藥治療PCOS可明顯提高患者排卵率，但流產(chǎn)率也會相應(yīng)升高，妊娠率降低，且不良反應(yīng)較大，而中醫(yī)治療能多方位全面顯著改善癥狀，且不良反應(yīng)較?。?］。因此，對中醫(yī)藥治療EMs和PCOS的機制進行研究，有助于為EMs和PCOS的治療找到新的治療靶基因和方法。

膈下逐瘀湯出自清代王清任所著的《醫(yī)林改錯》，方中桃仁、紅花活血化瘀，當(dāng)歸、川芎、赤芍活血養(yǎng)血，丹皮涼血活血；靈脂破血逐瘀消積，香附、烏藥、枳殼、元胡行氣止痛，甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏活血化瘀，行氣止痛的功效。臨床研究表明，膈下逐瘀湯對病機為氣滯血瘀的疾病具有“異病同治”的作用，如冠心病、慢性胃病、結(jié)腸炎、婦科系統(tǒng)疾病等［10］。在婦科系統(tǒng)疾病方面，該方用于治療EMs和PCOS有不錯的療效，如趙莉［1］運用膈下逐瘀湯治療EMs，中藥組總有效率96.25%，優(yōu)于長效達菲林組。運用膈下逐瘀湯聯(lián)合西藥治療EMs，療效顯著優(yōu)于純西藥組［2-3］。研究［4-5］表明，膈下逐瘀湯聯(lián)合西藥治療PCOS，總有效率為87.90%～95.53%，優(yōu)于純西藥治療?？梢婋跸轮痧鰷珜Ms和PCOS兩種難治的婦科疾病有“異病同治”的功效，對該經(jīng)典名方的作用機制進行深入的研究十分必要。

激素水平的異常是EMs和PCOS的重要發(fā)病機制。EMs的進展會受到雌激素作用的促進，因此影響雌激素合成的一些關(guān)鍵基因及雌激素受體的異常表達會影響EMs的進展［11-14］。并且不同亞型孕激素的抵抗也是EMs發(fā)病的重要機制［15］。而PCOS則存在明顯的高黃體生成素和高雄激素血癥［16-18］。調(diào)節(jié)這些激素的生成、分泌水平和機體對其反應(yīng)等，已成為治療EMs和PCOS的重要靶基因。本研究顯示，膈下逐瘀湯治療EMs、PCOS的共有靶基因共69個，GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示共有靶基因顯著富集于激素相關(guān)功能和信號通路，如類固醇激素的反應(yīng)、對酮體的反應(yīng)、對雌二醇的反應(yīng)、甾體激素受體活性、類固醇結(jié)合等GO條目，和激素相關(guān)的內(nèi)分泌抵抗、卵巢類固醇生成、類固醇激素的生物合成、雌激素信號傳導(dǎo)等信號通路，表明膈下逐瘀湯可廣泛調(diào)節(jié)相關(guān)激素的生成和機體對其的反應(yīng)。一些實驗研究證實了膈下逐瘀湯對相關(guān)激素的調(diào)控作用，如姜曉琳等的研究發(fā)現(xiàn)膈下逐瘀湯可調(diào)節(jié)PCOS患者黃體生成素、雌二醇、總睪酮水平［19］，王紅等［20］發(fā)現(xiàn)膈下逐瘀湯可調(diào)節(jié)EMs患者雌二醇、卵泡刺激素、黃體生成素、孕酮水平。本研究發(fā)現(xiàn)，膈下逐瘀湯調(diào)控這些激素的靶基因可能是MMPs、ESR1/2、CYP19A1、CYP1A1、CYP1B1、17β-HSD、LDLR等基因，為后續(xù)深入的機制研究指明了方向。炎癥也與EMs和PCOS的發(fā)病相關(guān)，多種炎癥因子及免疫調(diào)節(jié)因子參與的低度炎癥可能參與了HPO軸功能紊亂及卵泡發(fā)育障礙的過程［21-22］。EMs腹腔內(nèi)環(huán)境中免疫細胞、細胞因子等有著顯著的變化，可能是造成子宮內(nèi)膜細胞異常定植的原因［23］。PCOS也存在慢性炎癥情況，可能介導(dǎo)了胰島素抵抗的發(fā)生［24］。因此，膈下逐瘀湯對炎癥的調(diào)控可能也是治療EMs和PCOS的機制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，膈下逐瘀湯對IL-17、TNF、Toll樣受體信號傳導(dǎo)途徑、Th17細胞分化具有調(diào)控作用。對這些通路的調(diào)控作用在一些膈下逐瘀湯的動物研究中獲得了證實［25］，但在EMs和PCOS仍需要進一步的實驗驗證。此外，血管新生也是EMs和PCOS的重要機制之一。在EMs早期階段，異位子宮內(nèi)膜組織迅速建立自己的血液供應(yīng)，這是其成功植入和長期存活的先決條件［26］，而卵巢間質(zhì)的血管生成增加同樣是PCOS的特征之一［27］?；钛鲋兴帉ρ苄律淖饔靡驯粡V泛證實［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，膈下逐瘀湯作為活血化瘀的代表方，對促進血管生成的因子VEGF、MMP2、MMP9具有顯著調(diào)控作用，這些因子也是蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中核心子網(wǎng)絡(luò)2的主要成分。對69個共有靶基因進行蛋白相互作用分析并構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)，運用網(wǎng)絡(luò)拓撲算法進行網(wǎng)絡(luò)核心計算，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中最核心的3個靶基因為IL-6、IL-10和JUN，其中IL-6和IL-10屬于炎癥因子，JUN屬于對多種基因具有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。運用MCODE計算則發(fā)現(xiàn)4個核心子網(wǎng)絡(luò)，子網(wǎng)絡(luò)1和子網(wǎng)絡(luò)3中的基因均與炎癥因子、炎癥趨化因子以及對炎癥的反應(yīng)有關(guān)，子網(wǎng)絡(luò)2與血管生成密切相關(guān)，而子網(wǎng)絡(luò)4中的基因則均屬于類固醇激素/卵巢激素合成信號通路。這與富集分析中共有靶基因主要富集在激素、炎癥和血管生成的結(jié)果一致，并進一步縮小了范圍，明確了其中的核心靶基因。本研究分子對接結(jié)果顯示，膈下逐瘀湯成分能與核心靶基因形成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)，進一步明確了膈下逐瘀湯對核心靶基因的作用。

總之，中醫(yī)經(jīng)典名方膈下逐瘀湯對EMs和PCOS“異病同治”的分子作用機制是多靶基因、多通路的復(fù)雜過程，其核心成分為木犀草苷、槲皮素、芍藥苷、β-谷甾醇、甲醛、山奈酚、β-胡蘿卜素、金釵素等，調(diào)控的核心蛋白為IL-10、IL-6、JUN，主要生物功能和信號通路與調(diào)節(jié)激素水平和反應(yīng)、調(diào)控炎癥、調(diào)節(jié)血管生成等有關(guān)?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果，可進一步開展多靶基因、多通路的藥理學(xué)驗證，為深入闡明膈下逐瘀湯的分子作用機制提供新思路。