細(xì)胞骨架中微絲觀察實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化探索

王敏君，劉清桂，陳 費(fèi)

(海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室， 上海 200433； △通訊作者)

醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)是通過(guò)研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和生命活動(dòng)，將細(xì)胞生物學(xué)的理論知識(shí)和研究技術(shù)引入各種醫(yī)學(xué)問(wèn)題探討一門學(xué)科，是醫(yī)學(xué)、生物學(xué)課程中重要的基礎(chǔ)課程[1]。其實(shí)驗(yàn)課程與理論課程相輔相成，實(shí)驗(yàn)課程的主要目的不僅是輔助學(xué)生對(duì)理論知識(shí)的深入理解，更是希望能夠培養(yǎng)學(xué)生分析、解決問(wèn)題的能力、科研創(chuàng)新能力以及對(duì)科學(xué)研究的興趣和熱情，在醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)的整個(gè)教學(xué)環(huán)節(jié)起著舉足輕重的作用[2,3]。細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，與細(xì)胞的形態(tài)功能、生命活動(dòng)密切相關(guān)，是醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)理論課程的重點(diǎn)內(nèi)容。通過(guò)對(duì)細(xì)胞骨架的觀察，學(xué)生能夠加深對(duì)細(xì)胞骨架理論概念的理解，也有助于認(rèn)識(shí)細(xì)胞生命活動(dòng)的現(xiàn)象。

微絲是普遍存在于真核細(xì)胞中由肌動(dòng)蛋白組成的骨架纖維，可成束、網(wǎng)狀或散在分布于細(xì)胞質(zhì)中，對(duì)構(gòu)成細(xì)胞支架和維持細(xì)胞形態(tài)的功能有著重要的作用。由微絲形成的微絲束又稱為應(yīng)力纖維，是一種較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，多與細(xì)胞的長(zhǎng)軸平行，貫穿細(xì)胞的全長(zhǎng)。微絲伴隨著細(xì)胞形態(tài)的變化和生命活動(dòng)不斷地發(fā)生組裝和去組裝的過(guò)程，而此過(guò)程中常受到一些藥物的影響從而影響細(xì)胞功能的正常執(zhí)行，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。細(xì)胞松弛素B(Cytochalasin B)主要破壞微絲的組裝，并破壞細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞移動(dòng)、分裂等生命活動(dòng)。而去除細(xì)胞松弛素B后，微絲的結(jié)構(gòu)和功能又可恢復(fù)。

細(xì)胞內(nèi)微絲束的觀察是生物醫(yī)學(xué)本科層次開設(shè)的實(shí)驗(yàn)必修項(xiàng)目之一。現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程只關(guān)注于微絲染色的實(shí)驗(yàn)本身，并未將其與實(shí)驗(yàn)教學(xué)的理論目的結(jié)合，教學(xué)效果不明顯。而傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)多選用單一的考馬斯亮藍(lán)染色標(biāo)記微絲束，該染色方法為非特異蛋白染色，不能特異性區(qū)別細(xì)胞骨架組成。為此，近年來(lái)隨著熒光顯微鏡在本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)室的普及，我們從微絲功能角度、藥物作用對(duì)細(xì)胞影響原理等角度出發(fā)對(duì)該實(shí)驗(yàn)課程進(jìn)行了以下改進(jìn)和優(yōu)化，取得了較為滿意的實(shí)驗(yàn)效果。

1 實(shí)驗(yàn)課程設(shè)計(jì)內(nèi)容優(yōu)化

1.1 課程設(shè)計(jì)目標(biāo)要求

我們以理解微絲功能-構(gòu)成細(xì)胞的支架并維持細(xì)胞的形態(tài)為課程目標(biāo)。學(xué)生體外培養(yǎng)細(xì)胞用細(xì)胞松弛素B處理不同時(shí)間后再逐步恢復(fù)，結(jié)合不同染色方法觀察各個(gè)狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)微絲分布掌握微絲作為細(xì)胞骨架成分的重要功能。

1.2 課程設(shè)計(jì)內(nèi)容

成纖維細(xì)胞是微絲束觀察較好的細(xì)胞材料，細(xì)胞內(nèi)微絲是由肌動(dòng)蛋白組成，通過(guò)肌動(dòng)蛋白的顯色而觀察細(xì)胞內(nèi)微絲的分布?？捡R斯亮藍(lán)染色原理是其能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，檢測(cè)出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，光學(xué)顯微鏡下即可觀察到細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分布情況，是檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)微絲束較為常用的方法。而鬼筆環(huán)肽只與聚合的微絲有強(qiáng)親和作用，而不與肌動(dòng)蛋白單體分子結(jié)合，更加明確了細(xì)胞內(nèi)微絲束的分布狀態(tài)。我們?cè)诮虒W(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用特異性熒光染料Alexa Fluor?88鬼筆環(huán)肽來(lái)直接標(biāo)記染色，并在熒光顯微鏡下觀察微絲束。兩種染色方法結(jié)合光學(xué)和熒光顯微鏡觀察可幫助學(xué)生更好地分辨細(xì)胞內(nèi)微絲分布。

為更加突顯微絲在細(xì)胞支撐骨架和形態(tài)維持中的重要作用，體外培養(yǎng)細(xì)胞分別進(jìn)行不同時(shí)間的細(xì)胞松弛素B處理以及撤去細(xì)胞松弛素B后再培養(yǎng)，以觀察各組成纖維細(xì)胞的形態(tài)和微絲束的分布，分析比較微絲在細(xì)胞中的形態(tài)特征以及其與細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的相關(guān)性。

2 實(shí)驗(yàn)課程實(shí)施方案優(yōu)化

2.1 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

兩位學(xué)生為一組。實(shí)驗(yàn)教師為每一組準(zhǔn)備3個(gè)6孔板的細(xì)胞。第一板6孔板接種6孔成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)教師待細(xì)胞生長(zhǎng)密度為60%后進(jìn)行處理。其中兩個(gè)孔為不做任何處理的成纖維細(xì)胞，兩個(gè)孔為細(xì)胞松弛素B處理半小時(shí)的成纖維細(xì)胞(即在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為10 μM細(xì)胞松弛素B)，兩個(gè)孔為細(xì)胞松弛素B處理半小時(shí)后PBS清洗3遍添加新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h的成纖維細(xì)胞。第二板6孔板接種3孔成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)人員待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)60%后，更換帶有細(xì)胞松弛素B的培養(yǎng)基。其中第一孔為原培養(yǎng)基，第2和3孔為含有細(xì)胞松弛素B的培養(yǎng)基，第2孔培養(yǎng)10 min，第3孔培養(yǎng)30 min。第三板6孔板接種4孔成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)教師待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)60%后，全部更換帶有細(xì)胞松弛素B的培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min。隨后，實(shí)驗(yàn)教師再更換為無(wú)細(xì)胞松弛素B的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0，0.5，1和2 h。所有處理組細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)教師計(jì)算好時(shí)間并在學(xué)生實(shí)驗(yàn)開始前準(zhǔn)備好，到處理時(shí)間后將細(xì)胞板從培養(yǎng)箱取出，封閉容器以最大限度降低細(xì)胞生命活動(dòng)。除第一個(gè)6孔板外，對(duì)于其余兩個(gè)6孔板，實(shí)驗(yàn)教師處理好后細(xì)胞棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，滴加1%多聚甲醛預(yù)固定。

為節(jié)約上課時(shí)間，實(shí)驗(yàn)用所有試劑由實(shí)驗(yàn)教師提前準(zhǔn)備好。主要試劑為：PBS緩沖液、1%TritonX-100、M-緩沖液、3%戊二醛溶液、4%多聚甲醛、0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染液、2 μg/ml Alexa Fluor?488鬼筆環(huán)肽、2 μg/ml DAPI。細(xì)胞松弛素B粉末溶解于DMSO試劑，儲(chǔ)存濃度為10 mM。

2.2 實(shí)驗(yàn)實(shí)施過(guò)程

2.2.1 細(xì)胞通透及固定 第一個(gè)6孔板由一位學(xué)生進(jìn)行。學(xué)生棄掉6孔板內(nèi)培養(yǎng)基，更換PBS洗滌3次；其中3個(gè)孔加入1%TritonX-100液，置于37 ℃恒溫箱中處理15-20 min，以去掉細(xì)胞骨架以外的部分蛋白質(zhì)。立即用M-緩沖液輕輕洗滌3次，每次3 min，使細(xì)胞骨架穩(wěn)定；然后再加入3%戊二醛溶液繼續(xù)固定10 min，固定后PBS清洗3次，后續(xù)采用考馬斯亮藍(lán)染色；另3個(gè)孔細(xì)胞滴加4%多聚甲醛固定5 min，PBS清洗3遍，后續(xù)采用熒光染色。學(xué)生應(yīng)合理安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間，可等待TritonX-100處理結(jié)束后再進(jìn)行另三組成纖維細(xì)胞的多聚甲醛固定。

另兩個(gè)6孔板由第二位學(xué)生進(jìn)行。學(xué)生在固定之前先在倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照，記錄不同處理組細(xì)胞的形態(tài)；隨后，棄孔板中原有1%多聚甲醛溶液，滴加1 ml 4%多聚甲醛固定5 min，PBS清洗3遍，再進(jìn)行熒光染色。

2.2.2 染色與觀察 考馬斯亮藍(lán)染色組中，學(xué)生加入0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染液染色30 min，然后自然水清洗數(shù)次，再滴加少量PBS后置于普通倒置顯微鏡下觀察。熒光染色組中，學(xué)生加入2 μg/ml Alexa Fluor?488鬼筆環(huán)肽，室溫染色30-60 min，PBS清洗3次后，滴加2 μg/ml DAPI染液，然后置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

普通光學(xué)顯微鏡下，學(xué)生觀察到無(wú)細(xì)胞松弛素B處理和細(xì)胞松弛素B處理30 min后再撤去繼續(xù)培養(yǎng)2 h的小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)藍(lán)色的微絲貫穿細(xì)胞軸，細(xì)胞核染色為深藍(lán)色。而細(xì)胞松弛素B處理組細(xì)胞內(nèi)除深藍(lán)色細(xì)胞核外，無(wú)明顯的淺藍(lán)色絲狀結(jié)構(gòu)。鬼筆環(huán)肽熒光染料染色后，熒光顯微鏡觀察到對(duì)照組和恢復(fù)組的小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)明顯的綠色微絲束結(jié)構(gòu)，粗而密集的微絲組成的應(yīng)力纖維成束分布在細(xì)胞質(zhì)中，而細(xì)胞松弛素處理組細(xì)胞內(nèi)未見明顯的綠色熒光束。這兩種染色方法都清晰地觀察到細(xì)胞內(nèi)微絲束的分布。

其次，倒置顯微鏡下觀察到未進(jìn)行細(xì)胞松弛素處理的成纖維細(xì)胞鋪展好，細(xì)胞形態(tài)舒展，細(xì)胞胞體較大呈多邊形，細(xì)胞有突起。而隨著細(xì)胞松弛素B處理時(shí)間的延長(zhǎng)(分別處理0，10，30 min)，細(xì)胞鋪展逐漸縮小，突起變少。鬼筆環(huán)肽熒光染色下，學(xué)生也同樣觀察到細(xì)胞松弛素B處理10 min后，伴隨著細(xì)胞邊圓，細(xì)胞內(nèi)微絲束明顯收縮變短。在細(xì)胞松弛素處理30 min后，細(xì)胞內(nèi)微絲束消失，細(xì)胞進(jìn)一步變圓，細(xì)胞間間隙擴(kuò)大，細(xì)胞突起減少。結(jié)果說(shuō)明細(xì)胞松弛素B可有效抑制微絲的組裝聚集，而微絲的去組裝則極大地影響了細(xì)胞形態(tài)維持。

而培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞去除細(xì)胞松弛素B后，結(jié)果顯示，伴隨著正常培養(yǎng)基下成纖維細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)(分別恢復(fù)0.5，1和2 h)，細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)，細(xì)胞重新鋪展，突起變多。同樣，撤去細(xì)胞松弛素B 2 h后，鬼筆環(huán)肽熒光染色顯示細(xì)胞內(nèi)微絲束呈平行排列，沿著細(xì)胞軸分布。

3.2 微絲束分布現(xiàn)象分析

考馬斯亮藍(lán)和鬼筆環(huán)肽熒光染料都可以清晰地觀察到細(xì)胞內(nèi)微絲束的分布，但是鬼筆環(huán)肽熒光染色實(shí)驗(yàn)過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，培養(yǎng)板底部貼壁細(xì)胞也不會(huì)因Triton X-100的作用而脫落，增加了實(shí)驗(yàn)的成功率和可操作性。細(xì)胞松弛素B可有效地抑制細(xì)胞內(nèi)微絲的組裝聚集，在細(xì)胞松弛素B處理的細(xì)胞中，由于微絲逐漸被破壞而不能夠支撐細(xì)胞以及維持細(xì)胞形態(tài)，使得細(xì)胞失去突起、不能鋪展而形狀變圓。而去除細(xì)胞松弛素B后，肌動(dòng)蛋白重新聚合形成微絲，細(xì)胞內(nèi)微絲組成的應(yīng)力纖維結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，從而導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)再次恢復(fù)正常，微絲應(yīng)力纖維也沿著細(xì)胞軸分布。

4 課程優(yōu)化的教學(xué)效果

微絲功能-構(gòu)成細(xì)胞的支架并維持細(xì)胞的形態(tài)實(shí)驗(yàn)課程設(shè)計(jì)的結(jié)果：100%的學(xué)生充分理解了微絲作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)支架的功能體現(xiàn)，理解實(shí)驗(yàn)原理，掌握了染色技術(shù)；90%以上的學(xué)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，兩種染色方法都觀察到微絲的分布與定位。傳統(tǒng)的考馬斯亮藍(lán)染色原理是針對(duì)蛋白質(zhì)的染色，并不能特異地顯示微絲的分布，而且Triton X-100處理也有可能不是完全將非細(xì)胞骨架蛋白破壞掉，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示。我們?cè)黾又苯訜晒夤砉P環(huán)肽染色能夠特異性地顯示微絲在細(xì)胞內(nèi)的分布，有助于學(xué)生對(duì)微絲結(jié)構(gòu)的理解和掌握。其次，我們通過(guò)設(shè)計(jì)細(xì)胞松弛素B藥物處理的不同時(shí)間以及去細(xì)胞松弛素B藥物繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間，結(jié)合倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和熒光纖維化下對(duì)微絲的分布，更好地幫助學(xué)生理解微絲在細(xì)胞形態(tài)維持中的重要作用。

細(xì)胞骨架的觀察是醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中一個(gè)經(jīng)典且重要的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)課程的優(yōu)化，不僅加深學(xué)生對(duì)細(xì)胞骨架中微絲的認(rèn)識(shí)，也提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣以及其對(duì)科研探索的積極性[4]。