四妙丸提取物乙醇提取部位對肝臟脂質(zhì)蓄積的作用

馬晶杰，陳伊夢，姜琪欣，楊 杰，聞曉東

（中國藥科大學中藥學院，天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，南京211198）

近年來，隨著人們生活水平的提高，肥胖［1］、糖尿?。?］、非酒精性脂肪肝［3］等代謝綜合征的發(fā)病率逐年上升，已對人類健康構(gòu)成重大威脅。脂質(zhì)代謝紊亂與諸癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是各癥發(fā)生的重要病理因素［4］。肝臟是脂質(zhì)合成的主要場所，肝臟脂質(zhì)蓄積可誘導脂肪肝、肝纖維化和肝硬化等后續(xù)性肝損傷［4］，也是促進胰島素抵抗的因素之一［5］。中醫(yī)雖無脂代謝紊亂的概念，但對“消癉”、“膏脂”等均有記載，且有“肥人多痰”、“肥人多濕”之說?，F(xiàn)代中醫(yī)學認為，其病因為飲食不節(jié)，恣食肥甘，痰濁內(nèi)生；或肝失疏泄，濕濁內(nèi)停；或脾虛痰盛證；或臟氣衰減，陽虛痰滯，終致痰積血瘀，滯留體內(nèi)為病?？梢?，肝脾腎失調(diào)，痰濕郁結(jié)是代謝綜合征的核心病機［6］。因此，健脾助運，清熱燥濕是干預(yù)脂代謝紊亂的重要治則［7］。

四妙丸由黃柏、蒼術(shù)、牛膝、薏苡仁組成，具有健脾助運，清熱燥濕的功效，臨床用于關(guān)節(jié)炎［8］和痛風［9］等疾病治療。因此，拓展四妙丸干預(yù)代謝綜合征的應(yīng)用具有較好的基礎(chǔ)和發(fā)展前景。

腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）作為細胞內(nèi)重要的能量感受器參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，有研究表明小檗堿既可以通過調(diào)節(jié)AMP/ATP 比值激活A(yù)MPK［10］，也可以通過激活LKB1 激活A(yù)MPK［11］。四妙丸提取物的60% 乙醇洗脫部位（ESMW）小檗堿的含量達20.47%，因此ESMW 可能調(diào)節(jié)AMPK改善脂代謝。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，四妙丸提取物的ESMW是四妙丸調(diào)節(jié)脂代謝的活性部位，本研究以游離脂肪酸誘導肝細胞脂質(zhì)堆積細胞模型，探索ESMW改善肝臟脂質(zhì)蓄積的能力及作用機制，并在高脂飼喂的小鼠中驗證ESMW 對肝臟脂代謝的調(diào)節(jié)作用。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

ESMW（本課題組制備，提取率0.92%）；脫脂牛血清白蛋白（北京索萊寶科技有限公司）；棕櫚酸鈉、油酸鈉、油紅O、BODIPY 熒光染料、Hoechst 熒光染料（美國Sigma 公司）；AMPK 激動劑A-769662（美國MCE公司）；二甲雙胍［阿拉丁試劑（上海）有限公司］；高脂飼料D12492、對照飼料D12450B（美國Research Diets公司）；Trizol總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR 檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；RAPI 裂解液；BCA 蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA測試試劑盒（南京建成生物工程研究所）；INS、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；AMPK、p-AMPK、LKB1、p-LKB1、elF4EBP1、p-4EBP1、FASN 抗體（英國Abcam 公司）；ACC、p-ACC 抗體（美國CST 公司）；SREBP-1 抗體、Reagent、Medium（美國Santa Cruz Biotechnology 公司）；β-actin、羊抗小鼠、羊抗兔抗體（美國Bioworld Technology 公司）；AMPKα、Control siRNA（上海吉滿生物科技有限公司）；實驗中所用引物均合成于上海生工生物工程有限公司，種屬均為小鼠，其序列見表1。

Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.2 儀 器

血糖儀、血糖試紙（三諾生物傳感股份有限公司）；酶標儀、自動純水機、Real-Time qPCR（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；低溫高速離心機、梯度PCR 儀（德國Eppendorf 公司）；Olympus IX53 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；Nano Zoomer2.0RS切片掃描儀（日本Hamamatsu 公司）；Tanon 5200化學發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司）；Nano-100微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.3 細胞株與動物

人肝癌HepG2 細胞株（中科院上海細胞庫）；小鼠肝原代細胞由C57BL/6J 雄鼠肝臟灌流提取。SPF 級C57BL/6J 雄鼠，體重18 ～22 g，購于浙江維通利華公司，動物許可證號SCXK（浙）2019-0001。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2 方 法

2.1 藥品的制備

蒼術(shù)和薏苡仁藥材飲片按照質(zhì)量比1∶2混合，10 倍量乙醇加熱回流提取2 h，趁熱過濾，藥渣與牛膝和黃柏藥材飲片（1∶2）用30 倍水加熱回流提取2 h 后，pH 調(diào)至8，12000 r/min 離心10 min 得上清液，用0.22 μm 微濾系統(tǒng)，將制得的上清液過300 kD超濾膜，超濾至截留體積為原溶液的60%；將透過液過10 kD 超濾膜，超濾至截留體積為原溶液的50%。將10 kD 透過部分過AB-8 型大孔樹脂，經(jīng)過吸附和乙醇梯度洗脫，收集60% 乙醇洗脫液，濃縮得ESMW（主要復方中的小分子類化合物，包括：黃柏中9個生物堿類成分phellodendrine，magnofliorine，tembetarine，lotusine，menisperine，columbamine，jatrorrhizine，berberrubine and berberine，蒼術(shù)中的atractylenolide III 和atractylone，薏苡仁和黃柏中的caffeoyl-CH2-O-quinic acid，牛膝中的dibutyl phthalate）。

2.2 藥品的配制

精密稱取棕櫚酸鈉粉末0.02784 g、0.03044 g油酸鈉粉末，加入滅菌雙蒸水0.5 mL 于75 ℃金屬浴上加熱至溶液澄清，制得200 mmol/L 的母液。將母液趁熱轉(zhuǎn)移至10%BSA 溶液4.5 mL 中得20 mmol/L PA、OA，吹勻，分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

精密吸取20 mg/mL ESMW 母液50 μL，加入到滅菌PBS 緩沖液2 mL 中，吹勻，即得500 μg/mL 細胞用ESMW 母液，分裝并保存于-20 ℃冰箱，按照逐級稀釋的配制方法，將500 μg/mL 細胞用ESMW 母液稀釋為低中高3 個濃度：ESMW-L（0.5 μg/mL），ESMW-M（1 μg/mL），ESMW-H（2 μg/mL）。

油紅O 母液：稱取油紅O 粉末0.2 g 加入異丙醇40 mL，避光超聲使其溶解，置4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

精密稱取ESMW，用3% 泊洛沙姆溶液分別配制成7.124 mg/mL 混懸液；二甲雙胍用3% 泊洛沙姆溶液分別配制成20 mg/mL 溶液；4 ℃保存，用前混勻。

2.3 脂質(zhì)蓄積細胞模型的建立與給藥

2.3.1 小鼠肝原代脂質(zhì)蓄積細胞模型的建立與給藥 兩步灌流法提取小鼠肝原代細胞，DMEM高糖培養(yǎng)基孵育24 h 后，細胞密度為70% ～80%時，加入棕櫚酸（palmitate，PA，150 μmol/L）+油酸（oleinic acid，OA，150 μmol/L）（1∶1）或PA+OA+不同劑量的ESMW 或A-769662（2 μmol/L）繼續(xù)共孵育24 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

2.3.2 AMPKα 敲減HepG2 細胞脂質(zhì)蓄積模型的建立與給藥 當HepG2 細胞密度達40% ～50%時，將細胞培養(yǎng)基換成無血清無雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基0.8 mL，細胞培養(yǎng)箱孵育40 min，配制轉(zhuǎn)染液。A液：AMPKα siRNA3 μL加培養(yǎng)基97 μL混勻，避光放置備用。（對照組加Control siRNA）；B液：轉(zhuǎn)染試劑3 μL 加培養(yǎng)基97 μL 混勻，避光放置備用。將A 加入B 中，吹勻，避光靜置20 min；將混合液0.2 mL 均勻加入一個孔中，輕輕搖勻。12 h后，向轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入含血清含雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再進行驗證或者給藥。給藥：加入棕櫚酸（palmitate，PA，150 μmol/L）+油酸（oleinic acid，OA，150 μmol/L）（1∶1），或PA+OA+ESMW（1 μg/mL）共孵育24 h。收集細胞進行Western blot實驗或油紅O染色實驗。

2.4 動物分組造模與給藥

將40 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按體重隨機分為：對照組（Control）、模型組（Model）、ESMW 給藥組（ESMW，71.24 mg/kg，相當于7743.16 mg/kg四妙丸生藥量）、陽性藥組（二甲雙胍，200 mg/kg），每組10 只。對照組小鼠給予對照飼料飼養(yǎng)，其余小鼠均給予高脂飼料飼養(yǎng)。實驗開始時，每天灌胃給藥，給藥體積為0.01 mL/g 小鼠，對照組、模型組給予等體積3%泊洛沙姆溶液。

2.5 實驗指標及測定

2.5.1 BODIPY 熒光染色 原代細胞接于共聚焦小皿中，舒展24 h 至密度為60% ～80% 時，造模并給藥；給藥24 h 后，吸去上清液，用PBS 溶液潤洗后，每孔加入BODIPY熒光染料溶液（BODIPY母液稀釋1000 倍）100 μL 孵育15 min。棄去BODIPY，每孔加入Hoechst熒光染料溶液（Hoechst母液稀釋100 倍）100 μL 孵育10 min。棄去Hoechst，用滅菌PBS 洗3 次后，每孔加入PBS 100 μL，避光在激光共聚焦顯微鏡63 × 油鏡下觀察并拍照。

2.5.2 油紅O 染色 細胞給藥24 h 后，棄上清液，加入37 ℃預(yù)熱的PBS 溶液1 mL 潤洗，吸盡棄去PBS 溶液，每孔加4% 多聚甲醛溶液1 mL，室溫固定30 min。吸盡棄去多聚甲醛溶液，每孔加入60% 異丙醇溶液（9 mL 異丙醇∶6 mL PBS）1 mL，室溫孵育1 min。吸盡棄去異丙醇溶液，每孔加入油紅O 工作液（15 mL 油紅O 母液∶10 mL PBS）1 mL，室溫避光染色30 min。吸盡棄去油紅O工作液，用PBS 溶 液洗4 次，每次5 min。每 孔 加PBS 溶 液1 mL，在倒置顯微鏡下拍照。

2.5.3 生理狀況及體重 記錄每周記錄兩次動物體重，并每天觀察記錄動物的攝食量、活動及精神狀態(tài)。

2.5.4 口服葡萄糖耐量 實驗第9 周，動物禁食不禁水16 h，酒精棉片擦拭尾尖，消毒剪刀剪尾尖，取1 滴尾尖血于試紙上測量并記錄血糖值，為0 min 血糖值。灌胃0.2 g/mL 葡萄糖溶液（2 g/kg，0.1 mL/10 g 動物），分別測定并記錄30、60、90、120 min時間點處血糖值，計算曲線下面積。

2.5.5 樣品采集和保存 實驗第12周，動物禁食不禁水12 h，取血離心得血清，脫頸處死動物，解剖分離肝臟，稱重并拍照。肝臟分3份：（1）用膠水包埋做冰凍切片，用于肝臟油紅O 染色切片的制作；（2）4% 多聚甲醛固定，用于肝臟HE 染色切片的制作；（3）剩余肝臟樣品與血清放置于-80 ℃冰箱凍存。

2.5.6 血清生化指標 按TG、TC、NEFA、TNF-α ELISA 測試試劑盒說明書的方法，對血清樣品進行檢測。

2.5.7 Western blot 法檢測細胞和肝臟的蛋白表達 精密稱取肝組織30 mg，加入RAPI 裂解液500 μL，勻漿10 min 后冰上裂解30 min（細胞樣品加入RAPI 裂解液30 ～50 μL 后，吹勻冰上裂解30 min）。4 ℃，12000 r/min 離心20 min，避開最上層脂質(zhì)，取上清液。 BCA 定量后，調(diào)至統(tǒng)一濃度，加入5 × 上樣緩沖鹽，100 ℃金屬浴加熱變性5 min，將樣品插入冰盒降溫后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ靠准尤氲鞍讟悠?5 μg，經(jīng)SDS-PAGE 電泳、半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，對應(yīng)一抗在4 ℃冰箱中孵育過夜，TBST 洗30 min，對應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST 洗30 min，ECL顯影。每個指標重復3次，Image J計算灰度。

2.5.8 實時熒光定量PCR 實驗檢測細胞和肝臟的mRNA 表達 精密稱取肝組織25 mg，加入Trizol 1 mL，勻漿10 min 后冰上靜置5 min（細胞樣品加入Trizol 1 mL 吹勻，冰上靜置5 min）。提取總RNA 后，Nano-100 定量，按照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）說明書的方法進行cDNA 的合成；按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書的方法定量，每個指標重復3次。

2.6 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism Version 6 軟件進行統(tǒng)計學分析。所得數(shù)據(jù)以均值± 標準誤（±s）表示。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗多組數(shù)據(jù)間的顯著性差異，采用t檢驗分析兩組數(shù)據(jù)間的顯著性差異。以P＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 ESMW對游離脂肪酸誘導的肝原代細胞脂質(zhì)堆積的影響

TG 試劑盒檢測結(jié)果顯示（圖1-A），游離脂肪酸刺激后，TG含量顯著增加，且中劑量的ESMW可以顯著降低細胞內(nèi)的TG 含量；與該結(jié)果一致，BODIPY 熒光染色（圖1-B）顯示ESMW 有效降低了游離脂肪酸誘導的肝原代細胞中脂質(zhì)堆積。

Figure 1 Effects of 60% ethanol extract of Si Miao Wan (ESMW) on lipid accumulation in primary mouse hepatocytes induced by free fatty acids (±s, n = 3)A: TG levels determined by TG kits (±s, n = 3); B: BODIPY fluorescence staining##P ＜0.01 vs untreated group; *P ＜0.05 group vs treated with PA + OA only

3.2 ESMW 對Srebp-1、Acc、Fasn mRNA 及蛋白表達的影響

QPCR 的結(jié)果顯示（圖2-A ～2-C），棕櫚酸和油酸刺激下，肝細胞中Srebp-1、Acc、FasnmRNA 水平顯著上調(diào)，而給予ESMW 后，游離脂肪酸誘導的Srebp-1、Acc、FasnmRNA 水平升高得到了抑制。與QPCR 結(jié)果一致，Western blot 結(jié)果顯示（圖2-D ～2-G），棕櫚酸和油酸作用下，肝細胞中SREBP-1、ACC、FASN 蛋白水平顯著上調(diào)，ESMW 中、高劑量顯著抑制了ACC 及FASN 蛋白表達，中劑量ESMW抑制了SREBP-1 的成熟。以上結(jié)果表明，ESMW可以抑制游離脂肪酸誘導的脂質(zhì)合成。

Figure 2 Effects of ESMW on Srebp-1、Acc and Fasn mRNA and protein expression (±s, n = 3)A-C: Effects of ESMW on the mRNA expression of Srebp-1, Acc and Fasn in cells; D-G: Effects of ESMW on the proteins expression of SREBP-1, ACC and FASN in cells##P ＜0.01, #P ＜0.05 vs untreated group; **P ＜0.01, *P ＜0.05 vs group treated with PA + OA only; ns means no significant difference

3.3 ESMW 對AMPK 的激活作用及對LKB1-AMPK-mTOR信號的影響

圖3-A結(jié)果表明，在正常生理狀態(tài)的原代肝細胞中，ESMW 對AMPK 具有顯著的激活作用，且呈劑量依賴。

實驗結(jié)果表明，游離脂肪酸作用下，LKB1 的磷酸化水平受到抑制（圖3-C），AMPK 的激活降低（圖3-B），而ESMW 給藥后，促進了LKB1的磷酸化（圖3-C），并顯著增加了AMPK 的磷酸化（圖3-B）。AMPK 的 激 活 將 抑 制mTOR 信 號。 4EBP1 作 為mTOR 的底物，游離脂肪酸顯著增加了4EBP1 的磷酸化（圖3-D），表明mTOR 信號激活。ESMW（1 μg/mL）作用后，4EBP1的磷酸化顯著降低（圖3-D），表明ESMW抑制了mTOR信號。

3.4 ESMW 通過AMPK 抑制HepG2 細胞中的脂質(zhì)蓄積

AMPKα 敲減后，HepG2 細胞中AMPK 蛋白表達顯著降低，表明敲降成功（圖4-A，P＜0.01）。隨后，用游離脂肪酸對上述敲降細胞進行誘導，考察ESMW 能否抑制飽和脂肪酸誘導的脂質(zhì)蓄積。實驗結(jié)果表明，AMPK被敲降后，ESMW對SREBP1的抑制作用及對TG 的抑制作用均被顯著減弱（圖4-B ～4-D，P＜0.05），證明ESMW 是通過調(diào)控AMPK抑制肝細胞中的脂質(zhì)蓄積。

Figure 3 Effects of ESMW on LKB1-AMPK-mTOR signaling pathway (±s, n = 3)A: Primary mouse hepatocytes were co-incubated with ESMW and the effects of ESMW on AMPK activation were detected by Wester blot; B-D: Primary mouse hepatocytes were co-incubated with palmitate (PA, 150 μmol/L) + Oleinic acid (OA, 150 μmol/L) (1∶1) or PA + OA + ESMW.The effects of ESMW on the phosphorylation of AMPK, LKB1 and 4EBP1 were detected by Western blot##P ＜0.01, #P ＜0.05 vs untreated group;**P ＜0.01, *P ＜0.05 vs group treated with PA + OA only

3.5 ESMW 對高脂喂養(yǎng)小鼠體重、口服葡萄糖耐量的影響

圖5-A 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組體重增長速度較快，給予ESMW 和二甲雙胍灌胃后，小鼠體重增加明顯受到抑制。如圖5-B 和5-C 所示，模型組血糖曲線下面積與對照組相比明顯升高。ESMW 組的血糖曲線下面積顯著降低，說明ESMW有效改善了高脂誘導的口服糖耐量異常。

3.6 ESMW 對高脂飼喂小鼠血清中生化指標的影響

血漿生化指標結(jié)果如表2 所示，與空白組相比，模型組小鼠血清中TG、TC、NEFA 水平顯著增加（P＜0.01），表明高脂飼料誘導了小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常。ESMW 顯著抑制了高脂誘導的血脂相關(guān)參數(shù)的改變（P＜0.01），改善了脂質(zhì)代謝。高脂誘導造成小鼠體內(nèi)高血糖和高血脂，糖毒性和脂毒性共同加劇炎癥、氧化應(yīng)激等發(fā)展，最終導致糖尿病、脂肪肝、動脈粥樣硬化等糖脂代謝紊亂性疾病的發(fā)生發(fā)展。本課題組用ELISA 試劑盒檢測小鼠血清中炎癥因子TNF-α 水平，考察ESMW 對炎癥的改善作用。與普通飲食組小鼠相比，高脂飲食明顯上調(diào)TNF-α 水平，表明高脂誘導了小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。與模型組相比，ESMW 組TNF-α水平下降了21.2%，表明ESMW 能有效改善高脂誘導的小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

3.7 ESMW 對高脂飼喂小鼠肝臟中脂質(zhì)蓄積的影響

Figure 4 ESMW inhibited lipid accumulation in HepG2 cells by AMPK activation (±s, n = 3)A: AMPK expression; B: p-SREBP1 expression; C-D: Levels of TG in cells were detected by oil red O and TG kits##P ＜0.01, #P ＜0.05 vs control siRNA group; **P ＜0.01, *P ＜0.05 vs group treated with PA + OA only

Figure 5 Effects of ESMW on body weight (A) and oral glucose tolerance (B, C) in mice fed with high fat diet (±s, n = 8)Control: Normalmice; Model: High fat diet-fed mice; ESMW: High fat diet-fed mice treated with ESMW; MET: High fat diet-fed mice treated with metformin##P ＜0.01 vs control group; **P ＜0.01 vs model group

Table 2 Effects of ESMW on blood biochemical characteristics (±s, n = 8)

Table 2 Effects of ESMW on blood biochemical characteristics (±s, n = 8)

##P ＜0.01 vs control group; **P ＜0.01, *P ＜0.05 vs model group

Group Control Model ESMW MET TG/(mmol/L)0.719 ± 0.0441.209 ± 0.068##0.755 ± 0.051**0.669 ± 0.032**TC/(mmol/L)2.499 ± 0.1133.865 ± 0.033##3.299 ± 0.113**3.374 ± 0.060**NEFA/(mmol/L)0.751 ± 0.0271.167 ± 0.034##0.696 ± 0.036**0.057 ± 0.066**TNF-α/(pg/mL)219.2 ± 13.86462.3 ± 26.91##364.4 ± 22.83*255.3 ± 27.55**

肝臟是脂質(zhì)代謝的重要器官，前面的實驗表明ESMW 能抑制游離脂肪酸誘導的肝臟脂質(zhì)蓄積。在高脂飼喂動物中，模型組小鼠的肝臟重量顯著增加（圖6-A），肝組織油紅O 染色及TG 試劑盒結(jié)果（圖6-B，6-E）顯示，模型組小鼠肝組織內(nèi)脂質(zhì)蓄積嚴重，ESMW 給藥后，動物肝組織的脂質(zhì)含量明顯下降。肝組織HE 染色結(jié)果（圖6-C）顯示，高脂喂養(yǎng)后脂滴空泡增加增大，給藥后空泡變少變小，這一結(jié)果進一步說明，ESMW 可以改善動物肝臟的脂代謝，減少肝臟脂質(zhì)蓄積。

Figure 6 Effects of ESMW on lipid accumulation in liver of mice fed high fat diet (±s, n = 8)A: Liver tissues; B: Liver tissues after oil red O staining (400 × ); C: Liver tissues after HE staining (400 × ); D: Weight of liver; E: TG of liver tissues##P ＜0.01 vs control group; **P ＜0.01, *P ＜0.05 vs model group

3.8 ESMW對高脂飼喂小鼠肝臟脂代謝相關(guān)基因mRNA表達的影響

脂質(zhì)代謝包括脂質(zhì)攝取、脂質(zhì)合成、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、脂質(zhì)的β氧化等多個環(huán)節(jié)。前面實驗中本課題組發(fā)現(xiàn)ESMW 能抑制游離脂肪酸誘導的脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達，因此，在高脂飼喂小鼠體內(nèi)，重點考察了ESMW 對脂質(zhì)合成相關(guān)基因（Srebp-1、Acc、FasnmRNA）及脂質(zhì)β 氧化相關(guān)基因（Pparα、Pgc-1α、Cpt-1α、Fabp-2mRNA）的影響。QPCR 結(jié)果顯示，模型組小鼠中脂質(zhì)合成相關(guān)基因（Srebp-1、Acc、FasnmRNA）的水平顯著上調(diào)（圖7-A ～7-C），而脂質(zhì)β 氧化相關(guān)基因（Ppar α、Pgc-1α、Cpt-1α、Fabp-2mRNA）水平顯著降低（圖7-D ～7-G），表明高脂誘導了小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，小鼠體內(nèi)脂質(zhì)合成及脂質(zhì)氧化異常。ESMW 顯著抑制了高脂誘導的脂質(zhì)合成相關(guān)基因的上升，且促進了脂質(zhì)氧化相關(guān)基因的表達，提示ESMW 能改善高脂誘導的小鼠脂質(zhì)代謝紊亂。

3.9 ESMW對高脂飼喂小鼠肝臟中脂合成相關(guān)蛋白及LKB1-AMPK-mTOR信號的影響

Western blot結(jié)果（圖8-A）顯示，高脂誘導了小鼠肝臟中SREBP-1 前體的大量表達，且成熟型的SREBP-1 水平也顯著增強。ESMW 不僅顯著抑制了SREBP-1 前體的表達，也抑制了它的成熟。高脂誘導了小鼠肝臟中ACC 的大量表達，并使其磷酸化降低（圖8-B），表明高脂誘導了ACC 活性的增加，肝臟中脂質(zhì)合成增加。ESMW 降低了ACC 的表達并促進了其磷酸化，表明ESMW 能抑制ACC活化，進而改善脂質(zhì)蓄積。

與體外實驗結(jié)果一致，高脂抑制了小鼠肝臟中LKB1 的磷酸化（圖8-C），也使AMPK 的磷酸化受到抑制（圖8-D），同時激活了mTOR 信號（圖8-E）。ESMW 顯著增強了LKB1 和AMPK 的磷酸化，并抑制了mTOR 信號，表明ESMW 具有調(diào)節(jié)LKB1-AMPK-mTOR信號的作用。

Figure 7 Effects of ESMW fraction on mRNA expression of lipid metabolism-related genes in liver of mice fed high fat diet (±s, n = 3)A:Srebp-1;B:Acc；C:Fasn;D:Ppar α;E:Pgc-1α;F:Cpt-1α;G:Fabp-2##P ＜0.01, #P ＜0.05 vs control group; **P ＜0.01, *P ＜0.05 vs model group; ns means no significant difference

Figure 8 Effects of ESMW fraction on proteins expression of lipid metabolism-related genes and LKB1-AMPK-mTOR signaling pathway in liver of mice fed high fat diet (±s, n = 3)A:SREBP-1;B:ACC;C: LKB1;D:AMPK;E:4EBP1#P ＜0.05, ##P ＜0.01 vs control group; *P ＜0.05, **P ＜0.01 vs model group

4 討論

本研究首先以游離脂肪酸誘導小鼠肝原代脂質(zhì)蓄積細胞模型，TG 試劑盒及BODIPY 熒光染色結(jié)果表明ESMW 可有效降低細胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積。QPCR 及Western blot 結(jié)果 表明，ESMW 通 過 調(diào) 節(jié)SREBP-1、ACC、FASN 抑制游離脂肪酸誘導的脂質(zhì)合成。在正常生理狀態(tài)的肝原代細胞中，ESMW劑量依賴性激活A(yù)MPK；且在脂質(zhì)蓄積細胞模型中檢測到ESMW 磷酸化LKB1 和AMPK，抑制mTOR 信號。

為了確認AMPK 信號通路在ESMW 調(diào)節(jié)脂代謝方面的作用，以AMPKα siRNA 敲減HepG2 細胞的AMPKα，TG 試劑盒、油紅O 染色實驗結(jié)果表明AMPKα敲減后，ESMW 改善脂質(zhì)蓄積的作用減弱；Western blot 實驗結(jié)果說明AMPKα 敲減后，ESMW對p-SREBP-1蛋白的抑制作用減弱，進一步驗證了ESMW 至少部分是通過AMPK 信號發(fā)揮脂代謝調(diào)節(jié)作用。

在高脂飲食誘導的糖脂代謝紊亂模型中，口服葡萄糖耐量和丙酮酸耐量實驗結(jié)果顯示，ESMW可以顯著改善高脂飲食動物的葡萄糖耐量和糖異生功能。血清生化指標結(jié)果顯示，糖脂代謝紊亂模型動物血清TG、TC、NEFA 含量顯著增加，而ESMW 給藥后可顯著改善這些生化指標的異常變化。另外，血清中的炎癥因子TNF-α 在ESMW 給藥后顯著降低，提示該部位還具有抗炎作用。

肝組織油紅O染色、HE染色及TG試劑盒結(jié)果證實了ESMW 能顯著降低肝臟的脂質(zhì)蓄積。同時，在ESMW 給藥后，小鼠肝臟中與脂質(zhì)合成相關(guān)的Srebp-1、Acc、FasnmRNA 的表達水平降低；且與脂肪酸氧化相關(guān)的Ppar α、Pgc-1α、Cpt-1α、Fabp-2mRNA的表達水平顯著增加，表明ESMW可以顯著的降低脂質(zhì)合成，增加脂質(zhì)氧化。Western blot 實驗結(jié)果顯示，ESMW顯著抑制了脂質(zhì)合成關(guān)鍵蛋白SREBP-1/ACC 的活化。同時與細胞實驗結(jié)果一致，ESMW可調(diào)節(jié)LKB1-AMPK-mTOR的活性。

綜上，四妙丸提取物ESMW 具有顯著改善糖脂代謝紊亂的作用，其可通過激活A(yù)MPK、抑制脂質(zhì)合成相關(guān)酶的表達，抑制脂質(zhì)合成，進而抑制肝臟中的脂質(zhì)蓄積。