LC-MS/MS法測定人血漿中地高辛的濃度及其在兒童患者中的應(yīng)用

夏 穎，龍佳奕，代浩然，沈夢元，郭宏麗，胡雅慧，陳 峰*

（1南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院藥學(xué)部藥學(xué)研究中心，南京210008；2中國藥科大學(xué)礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，南京210009；3南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院，連云港222000）

地高辛（digoxin，DIG）是最早用于心血管治療的強(qiáng)心苷類藥物，其具有正性肌力作用和減慢心率的作用，在兒科中廣泛用于心力衰竭及快速型心律失常等［1-2］。然而，地高辛排泄緩慢，易蓄積中毒，藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)個(gè)體差異較大，治療濃度范圍窄，治療濃度和中毒濃度相近［3］，研究表明，地高辛治療質(zhì)量濃度范圍為0.5 ～0.9 ng/mL，而質(zhì)量濃度超過1.2 ng/mL，則易出現(xiàn)中毒［4］。而兒童的器官組織系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，在藥物的吸收、分布、代謝與排泄等方面與成人均有一定的差異，更容易受到藥物損害或發(fā)生中毒反應(yīng)，故亟需在兒科中對(duì)地高辛進(jìn)行治療藥物監(jiān)測（therapeutic drug monitoring，TDM）［5］。

目前，地高辛的TDM 手段多為免疫法，但存在交叉反應(yīng)、靈敏度低等缺點(diǎn)，限制其應(yīng)用［4］。而LCMS/MS法作為小分子化合物檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”［6］，具有選擇性好、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)勢，更適合用于地高辛的TDM。目前，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道采用LC-MS/MS 法測定地高辛濃度，但其存在前處理復(fù)雜、分析時(shí)間相對(duì)較長等缺點(diǎn)［7-13］，本研究建立了一種簡單、快速、靈敏的LC-MS/MS 法，血漿樣品用量少，運(yùn)行時(shí)間僅需2 min，能更好地滿足地高辛TDM 檢測要求，為地高辛的臨床個(gè)體化用藥提供了更加精準(zhǔn)的技術(shù)手段。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

地高辛對(duì)照品（批號(hào)：LRAC3018，純度：99.0%，美國Sigma-Aldrich 公司）；地高辛-d3 對(duì)照品（批號(hào)：8-ZCA-105-1，純度：92.15%，加拿大TLC PharmaChem 公司）；乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚（TBME）均為色譜純（德國Merck KGaA 公司）；甲酸和醋酸銨（美國Sigma-Aldrich 公司）；純化水（實(shí)驗(yàn)室制備）。

1.2 儀 器

JasperTM高效液相色譜-TripleQuadTM4500MD質(zhì)譜（新加坡AB Sciex 公司）；超純水系統(tǒng)（美國Millipore Milli-Q Gradient 公司）；MS205DU 電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；Fresco21低溫離心機(jī)（美國Thermo Fisher 公司）；AYAN-30L氮?dú)獍l(fā)生器（杭州安研儀器制造股份有限公司）。

2 方 法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：Kinetex C18（2.1 mm × 50 mm，2.6 μm；Phenomenex）；流動(dòng)相為含1 mmol/L醋酸銨和1 mmol/L甲酸的水溶液-含1 mmol/L醋酸銨和1 mmol/L 甲酸的乙腈溶液（55∶45）；采用等度洗脫；流速：0.35 mL/min；運(yùn)行時(shí)間：2 min；柱溫：35 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），以正離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）進(jìn)行離子檢測；碰撞氣壓力（CAD）：7 units；氣簾氣壓力（CUR）：25 psi（1 psi=6.895 kPa）；噴霧氣壓力（GS1）：60 psi；輔助加熱氣壓力（GS2）：40 psi；離子噴霧電壓（IS）：5500 V；離子源溫度（TEM）：300 ℃；地高辛和地高辛-d3 的監(jiān)測離子對(duì)分別為m/z798.5 →651.3 和m/z801.6 →654.4；碰撞能量（CE）分別為15 和16 V；去簇電壓（DP）分別為30 和7 V；碰撞池入口電壓（EP）分別為9 和5 V；碰撞池出口電壓（CXP）分別為15和16 V。

2.2 溶液的制備

2.2.1 地高辛儲(chǔ)備液和工作溶液的配制 精密稱取適量地高辛對(duì)照品，經(jīng)質(zhì)量校正系數(shù)校正后，用純甲醇將其溶解成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL 的儲(chǔ)備液。再用50% 甲醇水溶液稀釋為2.00，4.00，12.0，24.0，120，240，400 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液，用50% 甲醇水溶液稀釋為2.00，6.00，100，320 ng/mL的質(zhì)控工作液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)地高辛-d3 儲(chǔ)備液和工作溶液的配制 取一支地高辛-d3 對(duì)照品（規(guī)格：1 mg/支），經(jīng)質(zhì)量校正系數(shù)校正后，用純甲醇將其溶解成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL 的儲(chǔ)備液。再用純甲醇稀釋為400 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控樣品的配制 將地高辛的工作溶液以1∶19 的比例與空白人血漿混合，得質(zhì) 量 濃 度 為0.100，0.200，0.600，1.20，6.00，12.0，20.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)量濃度為0.100，0.300，5.00，16.0 ng/mL的質(zhì)控樣品。

2.3 血漿樣品處理

取血漿樣品100 μL，加入含地高辛-d3 的甲醇溶液（400 ng/mL）30.0 μL，渦旋3 min，加入TBME 400 μL，渦旋10 min，在4 ℃條件下以12000 r/min離心10 min，取上清液300 μL，氮?dú)獯蹈珊笥?0%甲醇水溶液80 μL復(fù)溶，進(jìn)LC-MS/MS定量分析。

2.4 血藥濃度測定

一名先天性心臟病患兒（11 歲，女，體重22.5 kg）長期口服地高辛片0.16 mg/d，分兩次口服，其血藥濃度已達(dá)穩(wěn)態(tài)。于次日清晨給藥前采集其靜脈血約3 mL，置于EDTA K2抗凝管中，全血離心后取上清血漿，保存于-20 ℃冰箱待測。

3 結(jié) 果

3.1 選擇性

制備6個(gè)不同來源的雙空白樣品，只含內(nèi)標(biāo)不含待測物的零點(diǎn)樣品，不含內(nèi)標(biāo)的定量上限樣品，按“2.3”項(xiàng)操作，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物的測定，內(nèi)標(biāo)和待測物間無相互干擾，見圖1。

3.2 線性范圍和定量下限

將地高辛標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品按“2.3”項(xiàng)操作，進(jìn)LC-MS/MS 分析。采用回歸模型y= ax+ b（x：待測物的質(zhì)量濃度；y：待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值），以1/x2的權(quán)重因子進(jìn)行線性回歸，得到典型標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y= 6.36x- 3.15e-5（r= 0.9988），結(jié)果表明，地高辛在0.100 ～20.0 ng/mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

3.3 精密度與準(zhǔn)確度

按“2.2.3”項(xiàng)下制備4 個(gè)不同質(zhì)量濃度水平（0.100，0.300，5.00，16.0 ng/mL）、每個(gè)質(zhì)量濃度水平6個(gè)重復(fù)的質(zhì)控樣品，考察批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度；通過3個(gè)連續(xù)的考察準(zhǔn)確度和精密度的分析批（于不同天處理）來考察批間準(zhǔn)確度和精密度。按“2.3”項(xiàng)操作，進(jìn)樣分析。結(jié)果見表1。表明該方法準(zhǔn)確度和精密度良好，符合生物樣品分析要求。

3.4 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率

按“2.2.3”項(xiàng)下制備3 個(gè)質(zhì)量濃度水平（0.300，5.00，16.0 ng/mL）的質(zhì)控樣品，按“2.3”項(xiàng)操作，進(jìn)樣分析，得地高辛及地高辛-d3 的峰面積分別為A1和A2；將空白基質(zhì)按“2.3”項(xiàng)操作后，加入相應(yīng)工作溶液，使最終進(jìn)樣濃度與上述質(zhì)控樣品濃度一致，進(jìn)樣分析，得地高辛及地高辛-d3 的峰面積分別為B1和B2；將相應(yīng)工作溶液直接進(jìn)樣，使其質(zhì)量濃度與上述質(zhì)控樣品濃度一致，得地高辛及地高辛-d3 的峰面積分別為C1和C2。地高辛及其內(nèi)標(biāo)的提取回收率分別為A1/B1× 100%、A2/B2×100%，基質(zhì)效應(yīng)分別為B1/C1× 100%、B2/C2× 100%，結(jié)果見表2，表明該方法提取回收率良好，無基質(zhì)效應(yīng)影響。

Table 1 Intra- and inter-batch precision and accuracy of digoxin in human plasma (±s)

RSD:Relative standard deviation; RE:Relative error

c/(ng/mL)0.1000.3005.0016.0 Intra-batch (n = 6)cMeasured/(ng/mL)0.102 ± 0.0080.319 ± 0.0145.30 ± 0.1116.8 ± 0.8 Precision/(RSD, %)7.84.42.14.8 Accuracy/(RE, %)2.06.36.05.0 Inter-batch (n = 18)cMeasured/(ng/mL)0.108 ± 0.0100.301 ± 0.0245.38 ± 0.1716.7 ± 1.5 Precision/(RSD, %)9.38.03.29.0 Accuracy/(RE, %)8.00.37.64.4

3.5 穩(wěn)定性考察

按“2.2.3”項(xiàng)下配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平（0.300，5.00，16.0 ng/mL）的質(zhì)控樣品，分別考察室溫放置12.6 h、-20 ℃凍融循環(huán)5 次、-20 ℃冷凍56 d 和處理后樣品在4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器放置4 d 2 h 的穩(wěn)定性（結(jié)果見表3），表明地高辛在各考察條件下穩(wěn)定性良好。

Table 2 Matrix effect and recovery of digoxin in human plasma (xˉ±s, n = 6)

Table 3 Stability of digoxin in human plasma (±s, n = 3)

Table 3 Stability of digoxin in human plasma (±s, n = 3)

Storage conditions Room temperature stability (25 °C, 12.6 h)Freeze-thaw stability (-20 °C, five cycles)Long term stability (-20 °C, 56 d)Autosampler stability (4 °C, 4 d 2 h)c/(ng/mL)0.30016.00.30016.00.30016.00.30016.0 cMeasured/(ng/mL)0.298 ± 0.01217.0 ± 0.40.288 ± 0.02116.8 ± 0.20.341 ± 0.01718.3 ± 0.70.330 ± 0.01716.8 ± 0.7 RE/%-0.76.3-4.05.013.714.410.05.0 RSD/%4.02.47.31.25.03.85.24.2

3.6 血藥濃度測定結(jié)果

該患兒血漿樣品按“2.3”項(xiàng)下處理后，用LCMS/MS 方法測定其體內(nèi)地高辛的濃度，測得其穩(wěn)態(tài)谷質(zhì)量濃度為1.73 ng/mL，色譜圖見圖2。

Figure 2 Chromatograms of a plasma sample from a Chinese pediatric subject before next administration of DIG (A: DIG;B: DIG-d3)

4 討論

4.1 監(jiān)測離子對(duì)的選擇

質(zhì)譜檢測時(shí)，由于地高辛等強(qiáng)心苷類化合物對(duì)銨離子和鈉離子等有很強(qiáng)的親和力，故以正離子模式掃描時(shí)很容易形成它們的加合離子［11］。文獻(xiàn)中采用的母離子多為［M + NH4］+，另外也有文獻(xiàn)采用［M + Na］+、［M + Li］+、［M + HCOO］-、［M - H］-等［8-11，14］，其母離子產(chǎn)生的不同加合離子的響應(yīng)與掃描離子時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件密切相關(guān)［9］。本研究中，母離子掃描時(shí)出現(xiàn)［M + NH4］+、［M + K］+和［M + Li］+，［M + K］+峰響應(yīng)太低，故不進(jìn)行后續(xù)分析。有文獻(xiàn)選用［M + Li］+峰，定量下限可達(dá)0.160 ng/mL［9］，本研究嘗試選用［M + Li］+峰，用簡單的蛋白沉淀法進(jìn)行樣品前處理，比較了流動(dòng)相中含0.05 mmol/L、0.5 mmol/L 和5 mmol/L 甲酸鋰時(shí)地高辛的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)無法達(dá)到定量下限要求，且檢測器出現(xiàn)了較嚴(yán)重的老化。后續(xù)方法開發(fā)中，發(fā)現(xiàn)［M + NH4］+和［M + Li］+峰響應(yīng)類似，由于若采用［M + Li］+峰，需在流動(dòng)相中添加甲酸鋰以形成穩(wěn)定的加合離子，而不揮發(fā)的鋰鹽會(huì)使檢測器老化，故最終選用［M + NH4］+峰。地高辛和地高辛-d3 的監(jiān)測離子對(duì)分別為m/z798.5 →651.3 和m/z801.6 →654.4。

此外，與之前的研究相比，本方法的選擇性好、靈敏度高。Kirby 等［8］方法的定量下限可達(dá)0.05 ng/mL，但其選用的是選擇離子監(jiān)測模式（SIM），選擇性不及本研究中的MRM 模式，且其前處理相對(duì)復(fù)雜。Hirabayashi 等［11］方法的線性范圍為0.100 ～10.0 ng/mL，雖其定量下限與本方法相同，但本方法線性范圍更寬，且前處理相對(duì)簡單。其他研究中的定量下限均較本方法高，前處理也較復(fù)雜［9-10，14］。

4.2 流動(dòng)相的選擇

本研究比較了有機(jī)相為甲醇和乙腈時(shí)的色譜峰形和響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其他實(shí)驗(yàn)條件相同時(shí)，以乙腈為有機(jī)相，地高辛響應(yīng)更高，基線更低，且保留時(shí)間較短，分析時(shí)間短，見圖3，故選擇乙腈為有機(jī)相。本研究比較了不同濃度甲酸（0.1、0.2、0.5、1、2 mmol/L）和不同濃度醋酸銨（0.1、0.2、0.5、1、2 mmol/L）對(duì)地高辛檢測的影響，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相含1 mmol/L 醋酸銨和1 mmol/L 甲酸時(shí)，地高辛響應(yīng)最高，且無其他干擾，故最終流動(dòng)相為含1 mmol/L醋酸銨和1 mmol/L甲酸的水溶液-含1 mmol/L醋酸銨和1 mmol/L甲酸的乙腈溶液。

Figure 3 Chromatograms of 10.0 ng/mL DIG working solution compared with different mobile phase B (A: ACN; B: MeOH)ACN：Acetonitrile

4.3 干擾問題的解決

本研究發(fā)現(xiàn)以有機(jī)相比例為30%、35%、50%進(jìn)行等度洗脫或梯度洗脫，內(nèi)標(biāo)通道存在干擾峰，而采用有機(jī)相比例為45% 的等度洗脫，干擾問題解決，故最終選用有機(jī)相比例為45%的等度洗脫。

本研究采用的是氘代內(nèi)標(biāo)，可有效避免由于儀器波動(dòng)等導(dǎo)致的檢測偏差，并可避免基質(zhì)效應(yīng)等影響。然而，方法開發(fā)中發(fā)現(xiàn)待測物對(duì)內(nèi)標(biāo)存在干擾，且無法通過更換離子通道來解決，最終采用提高內(nèi)標(biāo)工作溶液質(zhì)量濃度至400 ng/mL，使干擾峰響應(yīng)僅為內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的0.2%，即待測物對(duì)內(nèi)標(biāo)的干擾可忽略不計(jì)，不影響檢測。

4.4 樣品前處理的優(yōu)化

文獻(xiàn)中均采用液液萃取法（LLE）或固相萃取法（SPE）進(jìn)行血漿樣品處理［8-11，14］，但這些方法存在繁瑣、成本較高、毒性較大等缺點(diǎn)。本研究擬先采用蛋白沉淀法（PPT）進(jìn)行樣品處理，發(fā)現(xiàn)無法滿足定量下限檢測要求，故選用LLE。本研究比較了TBME、乙酸乙酯（ETOAc）、TBME-ETOAc（3∶1）、環(huán)己烷的提取效率，發(fā)現(xiàn)以TBME 為提取溶劑，地高辛響應(yīng)最高，提取回收率良好且無基質(zhì)效應(yīng)，故最終選用TBME為提取溶劑。

5 結(jié)論

本研究建立了一種前處理相對(duì)簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確度好的LC-MS/MS 法，用于測定人血漿中地高辛的濃度，該方法定量下限低至0.100 ng/mL，可滿足地高辛TDM 檢測要求，檢測時(shí)間短，可在2 min 內(nèi)完成單個(gè)樣本檢測。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法選擇性好，準(zhǔn)確度和精密度好，各濃度水平提取回收率平行，穩(wěn)定性良好，無基質(zhì)效應(yīng)和殘留影響，可用于生物樣本分析。并且，該方法已成功用于地高辛治療的先天性心臟病患兒的臨床樣本檢測，為臨床合理用藥提供了可靠依據(jù)。