液液萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量測定污水中10種毒品

于麗麗，儲婷婷，侯臣之，王優(yōu)美，狄 斌**

（1中國藥科大學(xué)藥物分析系，南京210009；2國家禁毒委員會辦公室-中國藥科大學(xué)禁毒關(guān)鍵技術(shù)聯(lián)合實驗室，南京210009；3公安部禁毒情報技術(shù)中心，北京100741）

隨著經(jīng)濟(jì)全球化和社會信息化加快發(fā)展，世界范圍毒品問題泛濫蔓延，嚴(yán)重危害人類身心健康和家庭和睦，威脅社會治安，影響國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展?！?019 世界毒品報告》顯示，全球吸毒人數(shù)約2.7 億，成癮人數(shù)約3500 萬，有約60 萬人死于毒品濫用［1］。根據(jù)2019年中國毒品形勢報告，截至2019年底，我國現(xiàn)有約214.8 萬名吸毒人員，約占總?cè)丝诘?.16%［2］。毒品濫用規(guī)模雖然整體呈現(xiàn)下降趨勢，但目前依然較大，且越來越隱蔽的吸毒方式與吸毒活動私密性的加強(qiáng)使得排查難度加大。因此，掌握毒品濫用情況，全方位監(jiān)控毒情態(tài)勢，打擊毒品犯罪，依舊是我國禁毒工作的重要內(nèi)容。

在對不同來源的污水分析中發(fā)現(xiàn)，采用固相萃取進(jìn)行前處理時，部分污水樣本基質(zhì)會嚴(yán)重影響待測物如嗎啡、6-單乙酰嗎啡（6-MAM）等在固相萃取小柱上的富集導(dǎo)致假陰性結(jié)果，或者有些成分在質(zhì)譜檢測時基質(zhì)效應(yīng)影響嚴(yán)重。因此，本研究建立了一種液液萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LLE-UPLC-MS/MS）同時檢測污水中10 種毒品的定量分析方法。

根據(jù)我國毒品濫用情況，選擇嗎啡（MOR）、甲卡西酮（MC）、苯丙胺（AM）、甲基苯丙胺（MAM）、6-MAM、氯胺酮（KET）、3，4-亞甲基二氧基苯丙胺（MDA）、去甲氯胺酮（NK）、3，4-亞甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）、可待因（COD）作為毒品或其代謝物的毒情評估待測物。該方法操作簡便、定量限低、重復(fù)性好，對于復(fù)雜基質(zhì)樣品同樣適用，已較好地應(yīng)用于國內(nèi)10個城市的部分受基質(zhì)影響的實際污水樣品檢測，期望成為常用的SPE-UPLC-MS/MS方法［3-12］的有力補充。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

10 種待測物及其氘代內(nèi)標(biāo)（包括MOR、MC、AM、MAM、6-MAM、MDMA、KET、NK、MDA、COD及MOR-D3、MC-D3、AM-D5、MAM-D5、6-MAM-D3、MDMA-D5、KET-D4、NK-D4、MDA-D5、COD-D6）儲 備液均購于美國Cerilliant 公司。甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；二氯甲烷（色譜純，上海通用試劑公司）；乙酸乙酯、氫氧化鈉、甲酸銨、甲酸均為市售分析純；超純水由實驗室超純水系統(tǒng)制備。

1.2 儀 器

LC-30AD UPLC 超高效液相色譜串聯(lián)LCMS-8050 質(zhì)譜儀（日本Shimadzu 公司）；Auto Science MTN-2800D 氮吹儀（天津Auto Science 儀器有限公司）；THZ-312臺式恒溫振蕩器（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；D3415R 低溫冷凍離心機(jī)（瑞士BioTool公司）；TGL-16M 臺式高速冷凍離心機(jī)（上海湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；實驗室超純水系統(tǒng)（南京妙之儀電子科技有限公司）。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱 為Shimadzu Shim-pack C18（2.1 mm ×100 mm，1.9 μm）；流動相：A為0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0 ～5 min，5% ～25% B，5 ～5.1 min，25% ～100% B，5.1 ～7 min，100% B，7 ～7.1 min，100% ～5%B，7.1 ～9.5 min，5% B；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣室溫度：4 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI 源）正離子模式檢測；霧化氣（N2）流量3 L/min，加熱氣（N2）流量10 L/min，干燥氣（N2）流量10 L/min，接口溫度300 ℃，DL 溫度250 ℃，加熱塊溫度400 ℃；MRM 方式掃描；各待測物的MRM 離子對監(jiān)測通道具體見表1。10種毒品及其內(nèi)標(biāo)的UPLC-MS/MS色譜圖見圖1所示。

2.3 樣品液液萃取

取污水30 mL 至50 mL 離心管中，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)水樣pH 至9.5 ～10.5，加入25 ng/mL 的工作內(nèi)標(biāo)溶液60 μL，充分振搖混合均勻。加入二氯甲烷-乙酸乙酯（1∶1）萃取劑10 mL，在恒溫振蕩器中以280 r/min，40 ℃振蕩15 min，分取有機(jī)層，于50 ℃條件下氮吹至干，殘留物用0.1% 甲酸水-乙腈（95∶5）溶液120 μL 渦旋復(fù)溶，經(jīng)15000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液100 μL UPLC-MS/MS分析。

Table 1 MRM parameters of 10 illicit drugs and their internal standards

Figure 1 MRM chromatogram of 10 illicit drugs

2.4 方法驗證

2.4.1 線性范圍與定量下限 在混合空白污水中準(zhǔn)確加入一定量的10 種待測物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制 成 質(zhì)量 濃度 為1 ～500 ng/L（AM 為2.5 ～1250 ng/L）的系列樣品，每個質(zhì)量濃度雙樣本分析。按“2.3”項下操作后進(jìn)樣分析，以待測物的峰面積（Y）對待測物質(zhì)量濃度（X，ng/L）進(jìn)行線性回歸運算（權(quán)重系數(shù)：1/X2），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明，10 種待測物在1 ～500 ng/L（AM 為2.5 ～1250 ng/L）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)均≥0.9957。同時采用不含10 種待測物的混合空白污水樣品配制定量下限（LLOQ）模擬樣本，結(jié)果表明，當(dāng)信噪比S/N 大于10 時，10種待測物的定量下限均為1 ng/L。

2.4.2 準(zhǔn)確度與精密度 為了驗證方法的準(zhǔn)確度及精密度，向混合空白污水中加入一定量的10 種待測物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為2.5、200、400 ng/L（AM 為6.25、500、1000 ng/L）的低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品，每一質(zhì)量濃度進(jìn)行6 次重復(fù)實驗，連續(xù)3 d 重復(fù)操作［12］。結(jié)果見表2，表明方法具有較好的準(zhǔn)確度與精密度。

2.4.3 相對回收率 用混合空白污水基質(zhì)配制2.5、200、400 ng/L（AM 為6.25、500、1000 ng/L）3 種質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品，每一濃度進(jìn)行6 次重復(fù)實驗，測得峰面積為A1；向復(fù)溶溶劑中加入相同量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和工作內(nèi)標(biāo)溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液對照組，每一濃度進(jìn)行3 次重復(fù)實驗，計算峰面積平均值為C。以峰面積A1 與C 之比計算各待測物的絕對回收率，同法計算各內(nèi)標(biāo)的絕對回收率，以待測物的絕對回收率除以內(nèi)標(biāo)的絕對回收率得到相對回收率，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，各待測物經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正的相對回收率范圍為96.36% ～106.43%，符合方法學(xué)驗證要求。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng) 對混合空白污水基質(zhì)30 mL進(jìn)行液液萃取操作后，向復(fù)溶溶劑中加入同質(zhì)控樣品的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和工作內(nèi)標(biāo)溶液，每一濃度進(jìn)行6 次重復(fù)實驗，測得峰面積為A2。向復(fù)溶溶劑中加入相同量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和工作內(nèi)標(biāo)溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液對照組，每一濃度進(jìn)行3 次重復(fù)實驗，計算峰面積平均值為C。以每一濃度峰面積A2 與C 之比計算基質(zhì)效應(yīng)，同法計算各內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，各待測物基質(zhì)效應(yīng)符合方法學(xué)驗證要求。

Table 2 Average precisions, accuracies at three concentrations of 10 illicit drugs (n=6)

Table 3 Relative recoveries of 10 illicit drugs (n=6)

Table 4 Matrix effects at three concentrations of 10 illicit drugs and their internal standards (n=6)

2.4.5 進(jìn)樣穩(wěn)定性 用混合空白污水基質(zhì)配制低、中、高3 個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按“2.3”項下操作，分別在4 ℃進(jìn)樣盤放置24 h，每一質(zhì)量濃度平行測定6個樣本。結(jié)果表明，10種待測物樣品在4 ℃條件下放置24 h穩(wěn)定。

2.4.6 殘留考察 取標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點樣品，將其與空白流動相樣品交叉進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，各待測物的殘留響應(yīng)值低于其定量下限的20%，并且不超過內(nèi)標(biāo)的5%，殘留效應(yīng)的影響可以忽略不計［12］。

2.5 方法應(yīng)用

將本研究建立的LLE-UPLC-MS/MS 法應(yīng)用于實際樣品的檢測，將采集自南京、江陰等10個城市不同污水處理廠的部分受基質(zhì)影響的污水樣品按“2.3”項操作后分析測定。這些樣品應(yīng)用SPEUPLC-MS/MS法［12］處理在萃取小柱上無法富集，待測物及內(nèi)標(biāo)都無響應(yīng)，應(yīng)用本研究建立的LLEUPLC-MS/MS 法進(jìn)行測定，所有樣品內(nèi)標(biāo)均可正常出峰，測得含量結(jié)果見表5。

Table 5 Concentrations of 10 illicit drugs in wastewater samples (S1-S10)

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 流動相的選擇 采用0.1% 甲酸-5 mmol/L甲酸銨水溶液和0.1% 甲酸水溶液兩種水相進(jìn)行考察。實驗結(jié)果表明，采用0.1% 甲酸-5 mmol/L甲酸銨水溶液作為水相時質(zhì)譜響應(yīng)提高，故選擇0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨水溶液作為水相。

3.1.2 流速的選擇 對0.2，0.3，0.4 和0.5 mL/min 4種不同流速進(jìn)行考察。實驗結(jié)果表明，當(dāng)流速為0.2 和0.3 mL/min 時，各待測物的峰形較寬且分析時間長；當(dāng)流速為0.4 mL/min 時，峰形良好，且能在較短時間內(nèi)滿足分離要求；當(dāng)流速為0.5 mL/min 時，部分待測物死時間出峰，故流速選用0.4 mL/min。

3.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

3.2.1 萃取劑的選擇 根據(jù)各待測物的性質(zhì)及極性，分別對乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、氯仿4 種不同極性有機(jī)溶劑單獨及相互混合作為萃取劑進(jìn)行考察，結(jié)果表明，二氯甲烷與乙酸乙酯混合萃取劑的萃取效率最高。接著考察二者不同混合比例，實驗結(jié)果表明，二氯甲烷-乙酸乙酯（1∶1）為方法萃取劑時，各待測物總體萃取效果最好。

3.2.2 pH 條件的選擇 根據(jù)各待測物的性質(zhì)及pKa，分別對pH 8.5，9，10，11 這4 種不同污水pH條件進(jìn)行考察，實驗結(jié)果表明，在堿性條件下pH 10 時，各化合物總體響應(yīng)最佳，故選擇pH 10 為樣品最佳萃取pH條件。

3.2.3 萃取劑體積的選擇 采用這4種不同體積（5，10，15，20 mL）的萃取劑體積進(jìn)行考察。實驗結(jié)果表明，5 mL 萃取劑無法將待測物完全萃取出來；15 mL 萃取劑由于離心管中液體過滿，振蕩不充分，萃取效率不如10 mL 高；20 mL 萃取劑分成兩等份，每次用10 mL 萃取劑萃取，合并兩次萃取劑，所得峰面積與10 mL 萃取劑所得峰面積相近，考慮到減少有機(jī)溶劑污染，故選用10 mL為方法用萃取劑體積。

3.2.4 氮吹溫度的選擇 采用30，40，50，60 ℃這4 種不同氮吹溫度進(jìn)行考察。實驗結(jié)果表明，30，40，50 ℃下氮吹后峰面積相近，60 ℃下氮吹后峰面積降低，考慮到節(jié)約時間，選擇50 ℃為方法用氮吹溫度。

4 總結(jié)

本研究建立了一種同時測定污水中10種毒品的液液萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析方法。與常用的SPE-UPLC-MS/MS法［12］相比，該方法操作簡單、定量限低、專屬性好、重復(fù)性好，幾乎不受污水基質(zhì)效應(yīng)影響，并已成功應(yīng)用于10 個城市不同污水處理廠的部分受基質(zhì)影響的污水樣品檢測，具有較高的準(zhǔn)確度和可靠性。解決了實際測樣中部分污水樣品基質(zhì)影響待測物在固相萃取小柱上富集的問題和質(zhì)譜的基質(zhì)效應(yīng)問題。該方法可以成為SPE-UPLC-MS/MS 法的有力補充。這將為公安部門進(jìn)行毒情監(jiān)測提供重要的技術(shù)支持。