NLRP3炎癥小體與相關(guān)炎癥信號通路在腎缺血-再灌注損傷中的作用

袁強 申開文 張瑞波 沈俊

現(xiàn)階段，全世界有10%的人口患有慢性腎病。隨著人口老齡化的加劇以及糖尿病、高血壓發(fā)病率的增加，慢性腎病的患病率在未來十年很可能會大幅度增長。全球需要腎臟替代治療的患者在保守模型中約為490.2萬，在高估計模型中約為9 701萬，終末期腎病的形勢仍十分嚴(yán)峻[1]。腎移植是治療終末期腎病的最佳方法，腎移植受者的長期生存率、生活質(zhì)量明顯高于透析患者。然而腎移植術(shù)中常伴隨腎缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI），嚴(yán)重影響受者預(yù)后。

IRI是指器官在暫時缺血時，其血液供給暫時減少，再恢復(fù)血流灌注后，可引起器官功能障礙甚至結(jié)構(gòu)損傷的一種病理狀態(tài)[2]。腎臟是IRI過程中易受影響的主要器官之一，其機制可能與炎癥反應(yīng)、氧自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞凋亡等多種因素有關(guān)[3]。腎缺血后可使腎小管上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，從而導(dǎo)致組織內(nèi)白細(xì)胞被激活，最終可加重血管滲漏和間質(zhì)水腫[4]。機體再受刺激后，可通過激活相關(guān)的受體結(jié)構(gòu)如Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）、NOD樣受體（NOD-like receptor，NLR），發(fā)揮相關(guān)炎癥調(diào)節(jié)作用。NLR是一個細(xì)胞內(nèi)天然感受器家族，是調(diào)節(jié)炎癥和凋亡反應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)蛋白，其中NLR蛋白（NLR protein，NLRP）3炎癥小體得到了研究者的格外關(guān)注，NLRP3炎癥小體可通過增強免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)以及免疫細(xì)胞與腎臟非免疫細(xì)胞之間的相互作用參與調(diào)節(jié)腎IRI的進展。探明NLRP3炎癥小體在腎IRI中的相關(guān)炎癥信號通路可能對腎IRI的防治具有重要意義。

1 NLRP3炎癥小體及其結(jié)構(gòu)

人體免疫系統(tǒng)可通過相關(guān)的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別各種刺激，從而激活下游信號通路，啟動人體的免疫應(yīng)答。目前已發(fā)現(xiàn)4類PRR，包括TLR、NLR、視黃酸誘導(dǎo)基因1樣受體和C型凝集素樣受體[5]。參與IRI過程的主要是TLR和NLR這兩種PRR。炎癥小體是由PRR參與組裝的多蛋白復(fù)合體，能夠活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-1并促進白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β等前體分子的成熟與釋放[6]。NLR廣泛存在于炎癥小體中，但依據(jù)其中NLR蛋白的不同可分為NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRP7、 NLRP12等炎癥小體。

在諸多炎癥小體中，關(guān)于NLRP3炎癥小體的研究最多，其特點也最為突出。NLRP3炎癥小體在整個進化過程中高度保守，在宿主的免疫防御中發(fā)揮著不可或缺的作用。與其他需要特殊刺激的炎癥小體不同，它能被多種外源性和內(nèi)源性化合物同時激活，也使得其成為炎癥小體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵點[7]。NLRP3炎癥小體在自身免疫性疾病及相關(guān)疾病中的重要性已被充分證明，其被廣泛的刺激物激活后發(fā)揮作用，參與了多種人體自身炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病。因此，NLRP3炎癥小體可能是抗炎治療的新靶點[8]。

NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD，ASC）和前體蛋白pro-Caspase-1參與了NLRP3炎癥小體的組成。當(dāng)NLRP3炎癥小體被激活后，其結(jié)構(gòu)會發(fā)生一系列變化，從而發(fā)揮相關(guān)作用[9]?；罨蟮腘LRP3炎癥小體主要通過調(diào)節(jié)多種促炎因子的功能，參與相關(guān)免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)。IRI可發(fā)生于人體的多種器官及組織，包括腦、心、肝、肺、腎、胃腸道和骨骼肌等[2]，在這些器官及組織中NLRP3炎癥小體主要通過氧化應(yīng)激及誘發(fā)、加重炎癥反應(yīng)參與IRI過程[10-13]。 在腎IRI后，NLRP3炎癥小體對于炎癥反應(yīng)的觸發(fā)和調(diào)節(jié)起著無法替代的作用。

2 NLRP3炎癥小體通過相關(guān)炎癥信號通路參與腎IRI

2.1 腎IRI中NLRP3炎癥小體不同炎癥信號通路的激活機制

當(dāng)腎IRI時，NLRP3炎癥小體可通過依賴于Caspase-1發(fā)揮促炎作用的經(jīng)典途徑和主要依賴于Caspase-4、Caspase-5或Caspase-11發(fā)揮作用的非經(jīng)典途徑參與相關(guān)炎癥反應(yīng)。其中，經(jīng)典途徑研究較為廣泛，經(jīng)典途徑又包括啟動和激活兩個步驟。啟動主要是促進炎癥小體成分的表達，其信號主要包括三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、細(xì)菌毒素、病毒、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、尿酸鹽結(jié)晶、膽固醇結(jié)晶等微?；蚓w以及β淀粉樣蛋白等[14]，這些物質(zhì)通過激活TLR/IL-1受體，觸發(fā)依賴核因子（nuclear factor，NF）-κB的pro-IL-1β和pro-IL-18發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄。在經(jīng)過Caspase-1裂解后，這些促炎因子以pro-IL-1β和pro-IL-18的形式釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而參與炎癥反應(yīng)[15]。

2.1.1 經(jīng)典炎癥信號通路中NLRP3炎癥小體的激活和組裝 激活信號主要參與炎癥小體復(fù)合物的組裝，NLRP3去泛素化后其N端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與ASC同型結(jié)構(gòu)域相互作用，ASC隨后與pro-Caspase-1結(jié)合，形成一個大的多聚蛋白復(fù)合物，無活性的pro-Caspase-1經(jīng)過近端誘導(dǎo)的多聚化蛋白裂解后轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨腃aspase-1[16]?；罨腃aspase-1是一種特定作用于天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶， 可在細(xì)胞質(zhì)中分割促炎因子IL-1β、IL-18的前體，使其轉(zhuǎn)化為成熟的IL-1β、IL-18并釋放到胞外，而IL-1β可激活I(lǐng)L-1受體復(fù)合體，進一步活化如IL-18、腫瘤壞死因子-α、IL-17等多種炎癥因子，IL-1β、IL-18通過其強大的促炎作用在人體感染和損傷等病理過程中調(diào)節(jié)機體相關(guān)免疫反應(yīng)[17]。

2.1.2 經(jīng)典炎癥信號通路中NLRP3炎癥小體的激活機制 NLRP3炎癥小體可被多種刺激物激活，但是眾多激活劑的下游是如何整合成某種保守統(tǒng)一的信號來激活NLRP3炎癥小體尚不清楚。目前已經(jīng)提出了幾種NLRP3炎癥小體的激活機制，主要包括離子通道開放、溶酶體損傷、線粒體損傷及功能障礙[18]。

在NLRP3炎癥小體激活中發(fā)揮作用的離子通道開放形式主要包括K+外流、Ca2+內(nèi)流以及Cl-外流。除了少數(shù)個例，絕大多數(shù)的NLRP3炎癥小體激活過程都有K+外流參與。P2X7通道在被ATP激活后，其介導(dǎo)的離子通道被打開，引起K+外流，導(dǎo)致Pannexin-1通道蛋白在細(xì)胞膜上形成小孔，從而使細(xì)胞外微生物分子進入細(xì)胞質(zhì)激活NLRP3炎癥小體[19]。Ca2+內(nèi)流也是激活NLRP3炎癥小體的主要機制之一，通過開放質(zhì)膜通道或釋放與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連接的儲存庫中的Ca2+，可使Ca2+流向細(xì)胞漿。Ca2+內(nèi)流和K+外流往往都是相互伴隨的，當(dāng)血漿Ca2+通道開放或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連接的儲存庫中的Ca2+被釋放時，K+外流通常也會一起發(fā)生。并且，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)Ca2+內(nèi)流和K+外流在NLRP3炎癥小體的激活中可互相協(xié)調(diào)，例如ATP激活P2X7受體能減少Ca2+內(nèi)流和協(xié)調(diào)K+外流[20]。此外，有證據(jù)表明，Cl-外流在NLRP3炎癥小體的激活中也發(fā)揮了重要作用，細(xì)胞外低Cl-會促進由ATP介導(dǎo)的IL-1的分泌，而細(xì)胞外高Cl-的情況會抑制NLRP3炎癥小體的激活[21]。

溶酶體的損傷是NLRP3炎癥小體激活的關(guān)鍵因素，這與細(xì)胞對微粒的吞噬作用密切相關(guān)。無論是自身產(chǎn)生的微粒如尿酸和膽固醇結(jié)晶等，還是外來微粒如明礬、二氧化硅和石棉等，都會在被細(xì)胞吞噬后導(dǎo)致溶酶體腫脹和損傷并釋放組織蛋白酶B，而組織蛋白酶B可通過直接或間接途徑來激活NLRP3炎癥小體[22]。

線粒體的損傷和功能障礙時，釋放的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）和線粒體來源ROS（mitochondria-derived ROS，mtROS）均參與了NLRP3炎癥小體的激活。NLRP3炎癥小體激活劑可誘導(dǎo)線粒體損傷并釋放ROS，mtROS的產(chǎn)生可以不依賴K+外流和溶酶體破壞兩條通路獨立誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活，它能促進細(xì)胞內(nèi)硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）與硫氧蛋白-1分離，并使TXNIP與NLRP3炎癥小體結(jié)合從而激活NLRP3炎癥小體。mtDNA在被各種NLRP3炎癥小體激活劑刺激后迅速釋放到細(xì)胞質(zhì)中并被氧化，氧化的mtDNA可與NLRP3炎癥小體發(fā)生免疫共沉淀，特異性激活NLRP3炎癥小體[23]。

2.1.3 非經(jīng)典炎癥信號通路中NLRP3炎癥小體的激活機制 當(dāng)NLRP3炎癥小體受到某些革蘭陰性菌刺激時，可通過Caspase-4、Caspase-5或Caspase-11介導(dǎo)的非經(jīng)典炎癥信號通路被激活。在這個途徑中，Caspase -11能獨立地刺激焦亡和IL-1α產(chǎn)生，同時激活Caspase-1，將pro-IL-1β和pro-IL-18裂解成它們的活性形式[22]。Caspase-11最初是作為Caspase-1的相互作用因子被發(fā)現(xiàn)的，它能促進Caspase-1的激活。當(dāng)細(xì)胞外脂多糖激活TLR4時，可通過Ⅰ型干擾素與C3-C3aR補體軸一起上調(diào)Caspase-11的表達。Caspase-11通過直接識別細(xì)胞漿內(nèi)毒素，觸發(fā)寡聚，并裂解自身蛋白被激活[19]。隨后，Gasdermin D（GSDMD）蛋白被激活的Caspase-4、Caspase-5或Caspase-11切割成GSDMD-N，誘導(dǎo)焦亡的發(fā)生，焦亡引起的K+外流激活了Caspase-1介導(dǎo)的IL-1β、IL-18的分泌[24]。此過程雖然與Caspase-1有一定的關(guān)聯(lián)，但卻并不依賴于ASC和Caspase-1。

2.2 NLRP3炎癥小體通過不同炎癥信號通路參與腎IRI

腎臟的血流量極其豐富，在維持體內(nèi)電解質(zhì)平衡及排泄代謝廢物的過程中發(fā)揮了重要作用。為了支持相關(guān)功能，腎臟特別是腎小管上皮細(xì)胞中線粒體密度較高，因而對缺氧及能量的減少十分敏感。腎移植術(shù)中常無法避免腎IRI的發(fā)生，在腎IRI過程中，腎臟產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，其形態(tài)、血流動力學(xué)、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等均會受到不同程度的影響。在短時間缺血情況下，內(nèi)皮細(xì)胞、血小板可通過引起凝血功能障礙，促進白細(xì)胞活化等細(xì)胞生理學(xué)過程發(fā)揮適當(dāng)?shù)谋Ｗo作用，但長期或嚴(yán)重缺血可導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和死亡[7]。NLR家族與腎臟相關(guān)的多種病理生理過程關(guān)系密切，在機體受到刺激后，在NLR等受體分子啟動的主要先天性免疫信號通路（如NF-κB和炎癥小體相關(guān)信號通路）中發(fā)現(xiàn)腎臟細(xì)胞代謝模式以及相關(guān)免疫細(xì)胞和實質(zhì)細(xì)胞的表型均可發(fā)生改變，并且能觸發(fā)分泌多種炎癥因子，導(dǎo)致腎臟發(fā)生不可逆的組織損傷和功能障礙[25]。

2.2.1 NLRP3炎癥小體通過經(jīng)典炎癥信號通路參與腎IRI NLRP3炎癥小體的形成在IRI中發(fā)揮重要作用，它參與了包括組織損傷、炎癥反應(yīng)和纖維化等在內(nèi)的多種病理生理過程[26]。在探討壞死損傷在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為炎癥的機制中，許多研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體主要通過經(jīng)典炎癥信號通路在腎IRI的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。有研究者利用NLRP3炎癥小體缺陷型小鼠構(gòu)建IRI模型，在再灌注后觀察到腎小管上皮細(xì)胞增殖，腎小管壞死和凋亡減少，隨后腎小管上皮細(xì)胞重新聚集，表明NLRP3炎癥小體不利于IRI后的修復(fù)反應(yīng)[27]。

大量研究表明，NLRP3炎癥小體可通過依賴于Caspase-1參與的經(jīng)典炎癥信號通路介導(dǎo)腎IRI的發(fā)生。Wen等[28]研究發(fā)現(xiàn)在腎IRI中，NLRP3炎癥小體激活水平升高，在模擬IRI的野生型小鼠中NLRP3和ASC表達上調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)IRI促進了Caspase-1、IL-1β和IL-18的成熟和分泌。而與野生型IRI小鼠相比，NLRP3炎癥小體缺陷型IRI小鼠腎臟病理損傷相對較輕，其血清肌酐、血尿素氮和尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白、炎癥小體激活水平均受到抑制。此外，研究還發(fā)現(xiàn)激活腎IRI中NLRP3炎癥小體的ROS是由受損的線粒體產(chǎn)生的，并且發(fā)現(xiàn)ROS是通過TXNIP的直接相互作用來誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活。Iyer等[29]研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體的缺乏可保護動物免受致命性腎缺血損傷，在缺血性急性腎小管壞死過程中，NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)了過度的急性炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致了IRI誘導(dǎo)的腎功能障礙和腎小管致死性損傷。通過比較NLRP3炎癥小體缺陷型小鼠和野生型小鼠的存活率、血尿素氮和血清肌酐以及中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量等發(fā)現(xiàn)，以上指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，Kim等[30]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠比較，NLRP3炎癥小體缺陷型小鼠的血尿素氮、血清肌酐、急性腎小管壞死評分和細(xì)胞凋亡評分均降低，從而證明了NLRP3炎癥小體缺乏對小鼠缺血性急性腎損傷也有保護作用。

2.2.2 NLRP3炎癥小體通過非經(jīng)典炎癥信號通路參與腎IRI 有研究表明，NLRP3缺乏能夠減輕小鼠腎IRI，而ASC缺乏卻對小鼠致命性腎缺血損傷的保護作用不那么明顯[31]。這表明在腎臟中，NLRP3炎癥小體中可能存在其他成分在損傷信號傳導(dǎo)中發(fā)揮獨立作用。

最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體可以在不依賴于Caspase-1和GSDMD蛋白的情況下誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[32]。此外，脂多糖和氧化磷脂可直接結(jié)合轉(zhuǎn)化為Caspase-11、Caspase-4和Caspase-5，在沒有相關(guān)適配蛋白的巨噬細(xì)胞中活化炎癥小體[33]。Iyer等[29]發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體缺陷型小鼠在缺血后急性腎小管壞死減少，而NLRP3缺陷型小鼠和ASC缺陷型小鼠在腎缺血損傷后，二者的存活情況和早期腎功能障礙發(fā)生情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，從而表明NLRP3在炎癥反應(yīng)中可能不依賴于ASC和Caspase-1獨立發(fā)揮作用。Shigeoka等[34]發(fā)現(xiàn)NLRP3的缺乏阻礙了IL-1β及IL-18的產(chǎn)生，但阻斷IL-1β和IL-18對于細(xì)胞損傷均無明顯作用，從而表明在腎小管上皮細(xì)胞中，NLRP3可以發(fā)出不依賴于炎癥小體、促炎因子和趨化因子的損傷反應(yīng)信號。Kim等[35]的研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，ASC與NLRP3沒有明顯的共定位，且NLRP3可在ASC或Caspase-1缺失的情況下重新定位到腎小管上皮細(xì)胞中的線粒體，通過線粒體抗病毒信號蛋白控制缺血缺氧下的線粒體損傷和凋亡，使得NLRP3炎癥小體不依賴于ASC或Caspase-1調(diào)節(jié)腎IRI。

3 小 結(jié)

腎IRI和多種炎癥疾病的發(fā)生與NLRP3炎癥小體的過度激活密切相關(guān)，這提示NLRP3炎癥小體可能是治療這些疾病的潛在靶點。然而，目前臨床仍缺乏針對NLRP3炎癥小體的藥物。最近有研究揭示了一些能下調(diào)NLRP3表達或抑制NLRP3炎癥小體組裝的途徑，如紫花前胡苷、別嘌呤醇、環(huán)氧二十碳三烯酸、激動蛋白C類物質(zhì)，可直接抑制NLRP3炎癥小體的激活[36-39]。抑制Pannexin-1和P2X4等通道或受體的活性也可減少NLRP3炎癥小體的激活[40-41]。此外，有研究表示，微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）可通過直接靶向抑制NLRP3基因來下調(diào)NLRP3表達，如miR-223、miR-9和miR-155[42-44]。最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，通過利什曼原蟲感染巨噬細(xì)胞組蛋白H3誘導(dǎo)的微調(diào)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)也能夠抑制NF-κB和NLRP3炎癥小體的激活[45]，這提示可通過多種途徑抑制NLRP3炎癥小體來治療腎IRI，抑制NLRP3炎癥小體的過度激活可能是防治腎IRI的一種策略。未來應(yīng)進一步明確NLRP3炎癥小體在人體中導(dǎo)致腎IRI的依賴性信號事件及其具體機制，為臨床腎IRI的防治提供更多的思路。