不同產(chǎn)地白肉靈芝的重金屬含量與毒性評價

潘 俊，田 浩，曲 媛，侯朝祥，金鵬程，吳昕怡，李 宏*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650223；2.昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，云南 昆明 650091)

【研究意義】靈芝具有滋補強壯、扶正培本的功效，有兩千多年的使用歷史[1-3]。靈芝作為藥材收載于2015年版《中國藥典》，其法定中藥材為赤芝(Ganodermalucidum) 與紫芝(Ganodermasinensis) 的干燥子實體，而其它品種的靈芝未被收錄。白肉靈芝(Ganodermaleucocontextum)為多孔菌科靈芝屬大型真菌，是中國西南地區(qū)的一個重要靈芝種類[4]。靈芝的安全性是食品開發(fā)中面臨的首要問題。赤芝和紫芝的安全性使毋庸置疑的，已被國家衛(wèi)計委列入保健食品名單，但白肉靈芝的安全性尚未見報道，缺乏相關(guān)領(lǐng)域的研究?！厩叭搜芯窟M展】白肉靈芝屬于靈芝屬中的罕見低溫型種類，經(jīng)多年選育，已獲得穩(wěn)定性強、代謝能力高、安全性高的白肉靈芝人工栽培品[5]。目前，針對白肉靈芝的研究主要集中于生物學鑒定[6]、化學成分[7]及藥理活性作用[8]等方面，但白肉靈芝安全性研究尚屬空白。而對重金屬的富集是真菌類食品最大的安全隱患，據(jù)報道，靈芝富集重金屬能力強，且富集于菌蓋、菌柄不同部位，易富集鎘、砷等[9-11]。靈芝中重金屬的污染及其含量與生長環(huán)境密切相關(guān)，鉛、鎘、汞、砷等重金屬元素的攝入對人體有毒害作用，甚至引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病[12-13]。目前《中國藥典》2020版已對重金屬元素進行限量要求，同時靈芝中重金屬的含量測定已有文獻報道[14-15]，靈芝中鎘超標率較高[11]。【本研究切入點】靈芝對于重金屬的富集存在很大的安全風險，因此，白肉靈芝中重金屬含量的測定與評估對其安全性評價十分重要?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文以白肉靈芝為研究對象，測定白肉靈芝中鉛(Pb)、鎘(Cd)、汞(Hg)、砷(As)4種重金屬含量，依據(jù)國際通用風險評估模式對健康風險進行評估，并對其進行毒理學安全性評價研究，為白肉靈芝的質(zhì)量安全提供判定依據(jù)，為白肉靈芝的進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級昆明種小鼠40只(18～22 g/只，雌雄各半)，由昆明醫(yī)科大學實驗動物學部提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(滇)K2015—0002。

1.2 試劑與耗材

云南白肉靈芝(Ganodermaleucocontextum)由云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所提供(表1)。汞單元素標準溶液(1000 μg/mL，批號：GBW08617 9041)、鉛單元素標準溶液(1000 μg/mL，批號：GBW08619 8061)、鎘單元素標準溶液(1000 μg/mL，批號：GBW08612 7063)均購于中國計量科學研究院；砷單元素標準溶液 [1000 μg/mL，GSB G 62028—90(3302)，批號：09051132]購于國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院。

表1 白肉靈芝樣品信息

1.3 儀器

PEAA800原子吸收光譜儀(珀金埃爾默股份有限公司)；AFS-9230原子熒光光度計(北京吉天儀器有限公司)；Mars6 微波消解儀(美國培安公司)；BS-280全自動血液生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；AUY220電子天平(日本島津公司)；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi 公司)；ALPHA 1-4 LSC冷凍干燥機(Christ 公司)。

1.4 方法

1.4.1 對照品制備 按食品安全國家標準的檢測方法分別用超純水將汞(Hg)標準液稀釋為0.20、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 ng/mL，鎘(Cd)標準液稀釋為0.50、1.00、1.50、2.00、3.00 ng/mL，鉛(Pb)標準液稀釋為5.00、10.00、20.00、30.00、40.00 ng/mL，砷(As)標準液稀釋為4.00、10.00、20.00、60.00、120.00 ng/mL系列標準溶液備用。

1.4.2 供試品制備 精密稱取0.2 g白肉靈芝樣品置于微波消解罐中，加入硝酸5.0 mL混勻，在微波消解儀中進行消解，然后在電熱板上于140 ℃趕酸至1 mL左右備用。

1.4.3 線性關(guān)系考察 將各重金屬元素的系列標準溶液進行測定，以吸光度C為橫坐標，濃度A為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果顯示各重金屬組分線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)都大于0.99，符合要求，見表2。

表2 重金屬檢測線性關(guān)系考察

1.4.4 精密度試驗 分別取鉛標準溶液(80 ng/mL)、砷標準溶液(40 ng/mL)、鎘標準溶液(8.0 ng/mL)、汞標準溶液(18 ng/mL)連續(xù)進樣6次，按其吸光度計算RSD。試驗結(jié)果顯示4種重金屬平均吸收度的RSD均不超過1.00%，精密度良好。

1.4.5 回收率試驗 制備已知含量的供試品溶液各6份，分別精密加入相應標準品，稀釋一定倍數(shù)后按相應方法測定，計算回收率。試驗結(jié)果顯示4種重金屬平均回收率在96%～103%，RSD值在2%～6%，回收率良好。

1.4.6 含量測定 參照食品安全國家標準進行，其中鉛(參照GB 5009.12—2017)、鎘(參照GB 5009.15—2014)采用石墨爐原子吸收光譜法進行檢測，總砷(參照GB 5009.11—2014)、總汞(參照GB 5009.17—2014)采用原子熒光光譜法進行檢測。

1.5 健康風險評估

采用美國環(huán)保署(USEPA)提出的人體暴露健康風險評價模型，靶標危害系數(shù)法 (Target hazard quotients，THQ)，評估人體每日白肉靈芝攝入的重金屬所帶來的健康風險[16]。

THQ=(EF×ED×M1×CM/RfD×BW×AT)×10-3

(1)

式中，EF為每年暴露于毒物(白肉靈芝)的天數(shù)(d/a)；ED為暴露于毒物(白肉靈芝)的年數(shù)(a)；M1為白肉靈芝中重金屬含量(mg/kg)；CM為白肉靈芝每日攝入量；RfD為口服參考劑量(mg/kg)；BW為人體平均體重(kg)；AT為平均暴露時間(d)。

采用危害指數(shù)HI綜合評估多種重金屬非致癌風險。

HI=THQPb+THQCd+THQHg+THQAs

(2)

式中，THQPb是Pb的靶標危害系數(shù)；THQCd是Cd的靶標危害系數(shù)；THQHg是Hg的靶標危害系數(shù)；THQAs是As的靶標危害系數(shù)。

1.6 小鼠急性經(jīng)口毒性實驗

白肉靈芝樣品粉碎后稱取100 g置燒瓶中，加入蒸餾水700 mL，回流1 h，提取2次，濃縮后凍干備用，即為白肉靈芝水提物(GLE)。按照GB 15193.3—2014食品安全國家標準急性經(jīng)口毒性試驗中最大耐受量法(MTD)進行實驗。分2組，陰性對照組、GLE組，每組20只(雌雄各半)，小鼠禁食6 h后，提取物按15.0 g/kg的劑量給藥，將樣品加水制成400 mg/mL的溶液灌胃2次(間隔4 h)，觀察14 d，記錄動物中毒表現(xiàn)和死亡情況。

1.7 小鼠亞急性毒性實驗

1.7.1 分組與給藥 將小鼠按體重隨機分為陰性對照組、GLE低、中、高劑量組(1.0、2.0、3.0 g/kg)，共4組，每組共12只，雌雄各半。陰性對照組灌胃給予相應體積的純凈水，GLE低、中、高劑量組灌胃給予相應濃度的GLE藥液，連續(xù)給藥30 d。

1.7.2 指標測定 給藥期間，每天觀察記錄動物出現(xiàn)的毒性反應，分別于給藥當天、給藥第7、14、21、28天稱取動物體重并記錄；末次給藥2 h后，眼眶采血分離血清，進行白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)指標測定。眼眶采血后迅速摘取心臟、肝臟、脾臟、腎臟稱重尿素(UREA)，并計算臟器系數(shù)。

臟器指數(shù)(%)=臟器質(zhì)量/小鼠體重×100

(3)

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地白肉靈芝的重金屬含量

云南3個不同產(chǎn)地(昆明、楚雄、怒江3個地區(qū))白肉靈芝中的砷、鎘、鉛的含量分別為0.16～0.22、0.15～0.50、0.07～0.18 mg/kg(表3)，均符合食品安全國家標準GB 2762—2017關(guān)于食用菌及其制品的規(guī)定以及國際食品法典委員會關(guān)于罐裝的蘑菇的規(guī)定(表4)。歐盟對食用菌(鮮品)中鎘含量的規(guī)定為≤0.2 mg/kg，對比檢測的9批次白肉靈芝中鎘含量超標的有60%，僅有楚雄地區(qū)的白肉靈芝符合歐盟標準。此外，汞在白肉靈芝中的含量均小于檢測最小值(0.01 mg/kg)，未檢出，與文獻報道的靈芝中汞的含量一致[14]。

2.2 不同產(chǎn)地白肉靈芝的健康風險評估

基于云南白肉靈芝中的鉛、鎘、汞、砷4種重金屬的含量，采用靶標危害系數(shù)法(Target hazard quotients，THQ)對經(jīng)白肉靈芝途徑攝入重金屬對人體健康產(chǎn)生的危害風險進行分析，依據(jù)參考文獻對各項參數(shù)進行取值，見表5。其中，白肉靈芝攝入率(CM)以最大攝入量(12 g/d)計算。以此為依據(jù)，計算通過食用菌途徑進入人體重金屬Pb、Cd、As和Hg的THQ和綜合危險指數(shù)(HI)值，見表6。4種重金屬的THQ大小為：As>Cd>Pb>Hg，各樣品值均<1。從HI平均值來看，不同地區(qū)白肉靈芝的HI值，昆明>楚雄>怒江，各樣品值均<1。以上數(shù)據(jù)表明，經(jīng)白肉靈芝途徑的重金屬攝入水平在安全限值之內(nèi)，通過云南白肉靈芝攝入的重金屬對人體沒有安全風險。

表3 云南不同產(chǎn)地白肉靈芝中重金屬含量

表4 不同國家或組織中草藥的重金屬限量規(guī)定

2.3 白肉靈芝的急性毒性

小鼠灌胃給予白肉靈芝提取物(GLE)后，觀察14 d，各組動物飲食活動正常，生長良好，未見任何中毒表現(xiàn)，無死亡，見表7。解剖檢查，肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺、胃、腸等主要器官，均未見明顯異常改變。急性毒性試驗中，白肉靈芝水提物對2種性別小鼠的經(jīng)口最大耐受劑量(MTD)均大于15.00 g/kg。根據(jù)急性毒性分級，白肉靈芝提取物屬無毒級。按體重60 kg，推薦服用劑量(6 g/d)計，相當于0.1 g/kg的服用量，而生藥量MTD遠遠高于推薦服用量的100倍。

2.4 白肉靈芝的亞急性毒性

2.4.1 體重 以1.00、2.00、3.00 g/kg劑量的白肉靈芝提取物(GLE)分別喂養(yǎng)小鼠，連續(xù)30 d，見表8。與陰性對照組相比，給藥各劑量組小鼠體重增長無明顯變化，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，說明白肉靈芝水提物對小鼠生長發(fā)育無影響。

2.4.2 臟器系數(shù) 臟器系數(shù)是毒理實驗中的常用指標，可反映毒物對機體的損傷程度。白肉靈芝提取物對小鼠臟器的影響，見表9。白肉靈芝提取物給藥組與陰性對照組相比，心、肝、脾、腎的臟器系數(shù)無明顯變化，與陰性對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，表明小鼠經(jīng)給藥后，臟器未受影響。

2.4.3 血液學指標 白肉靈芝提取物對小鼠血細胞的影響，見表10。白肉靈芝提取物GLE低劑量組對小鼠的紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)及血紅蛋白含量均未產(chǎn)生不良影響；GLE中、高劑量組小鼠的白細胞、紅細胞數(shù)量略有降低，血紅蛋白略有上升，但與陰性對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。

表5 白肉靈芝中重金屬對人體健康風險計算參數(shù)取值

表6 白肉靈芝重金屬攝入健康風險評估值

2.4.4 血液生化指標 血液生化指標能夠反映機體的健康狀況，為疾病診斷提供可靠依據(jù)[21]。經(jīng)連續(xù)給藥白肉靈芝提取物30 d后，給藥組與陰性對照組相比，各劑量組小鼠中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)等6項生化指標均無明顯差異(P>0.05)，見表11，表明白肉靈芝提取物對小鼠機體無明顯有害影響。

表7 白肉靈芝提取物對小鼠急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果

表8 白肉靈芝提取物對小鼠體重的影響

表9 白肉靈芝提取物對小鼠各臟器系數(shù)的影響

表10 白肉靈芝提取物對小鼠血細胞的影響

3 討 論

農(nóng)產(chǎn)品重金屬超標問題已引起全社會的廣泛關(guān)注。靈芝具有富集重金屬的能力，易富集Pb、Cd、Hg、As等元素[9-10]。謝寶貴等[22]發(fā)現(xiàn)隨著重金屬元素濃度增加，其在靈芝菌絲體內(nèi)的含量顯著增加，其富集性能力為Pb>Cd >Hg >As。靈芝[23]在菌絲體階段對Pb表現(xiàn)出明顯的富集作用，而在子實體階段對Pb的累積作用卻不明顯。這說明靈芝菌絲體和子實體對重金屬具有不同的富集特性。王懷豫等[24]檢測不同產(chǎn)地靈芝子實體重金屬含量，發(fā)現(xiàn)雖檢出一定量的有害重金屬，但含量較低，未超出國家限量標準，符合《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》的有關(guān)規(guī)定。胡曉等[25]發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地靈芝孢子粉之間的重金屬含量均無較大差異，且未破壁與破壁孢子粉之間的重金屬含量也無較大差異。云南白肉靈芝中重金屬含量研究未見報道。筆者根據(jù)食品安全國家標準GB 2762—2017關(guān)于食用菌及其制品的規(guī)定要求，本研究連續(xù)3年對云南省3個產(chǎn)地白肉靈芝中Pb、Cd、Hg、As含量進行監(jiān)測，均未超標。

靈芝在中國已有2000多年的食用歷史，素有“仙草”之譽，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中靈芝被列為上品(可久服、無毒)；明朝時李時珍在《本草綱目》中將靈芝移入菜部(可食用)[26]。2019年國衛(wèi)食品函(2019)311號文件將靈芝(赤芝和紫芝)列入食藥同源試點名單。中國有靈芝屬103個種靈芝資源，藥用的有23種，如赤芝、薄蓋靈芝、菌草靈芝等，但迄今為止未發(fā)現(xiàn)靈芝及其制品安全性的負面報道，在日本、韓國、臺灣、香港、東南亞等國家和地區(qū)靈芝也被廣泛用于食品行業(yè)[27-30]。目前白肉靈芝的毒理學安全性研究尚未有報道，本研究對小鼠急性、亞急性毒性試驗結(jié)果表明，白肉靈芝提取物對實驗小鼠的活動、體重、白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)、血紅蛋白含量、臟器系數(shù)及肝腎代謝產(chǎn)物均未產(chǎn)生不良影響?？梢姡兹忪`芝提取物的安全性高，本研究為白肉靈芝的后續(xù)開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

表11 白肉靈芝提取物對小鼠生化指標的影響

4 結(jié) 論

云南省3個產(chǎn)地(昆明、楚雄、怒江)的白肉靈芝中的砷、鎘、鉛的含量分別為0.16～0.22、0.15～0.50、0.07～0.18 mg/kg，均未超標。而汞在白肉靈芝中的含量低于檢測限(0.01 mg/kg)，未檢出。采用靶標危害系數(shù)法對重金屬研究結(jié)果進行評估表明，經(jīng)白肉靈芝途徑的重金屬攝入水平在安全限值之內(nèi)，對人體沒有安全風險。根據(jù)急性、亞急性毒性試驗結(jié)果，白肉靈芝提取物對雌雄小鼠經(jīng)口最大耐受劑量均>15 g/kg，屬無毒級物質(zhì)。