九香蟲防衛(wèi)素CcDef3基因的克隆與表達(dá)分析

齊小浪，杜 娟，李尚偉

(貴州大學(xué)昆蟲研究所貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

【研究意義】抗菌肽被認(rèn)為是一類有望成為抗生素替代品的新型抗生藥物，抗菌肽類抗生素的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用治療研究成為新型抗菌藥物開發(fā)研究的熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽擁有高度模塊化的合成抗菌系統(tǒng)，其小分子多肽對大量病原體的作用是快速和致命的，抗菌肽必須穿透靶細(xì)胞才能發(fā)揮殺死靶細(xì)胞的作用，這種作用模式能有效降低微生物的抗性[1-2]。因此，抗菌肽是一種非常有希望解決多重耐藥性的新型替代藥物。【前人研究進(jìn)展】多細(xì)胞生物常遇到病原生物的侵染，昆蟲作為地球上數(shù)量和種類最龐大的生物種群，其擁有強(qiáng)大的抗感染手段，如吞噬細(xì)菌和包裹寄生蟲的能力，這些反應(yīng)包括激活胞外蛋白酶級(jí)聯(lián)、黑化和凝固以及誘導(dǎo)抗菌肽基因表達(dá)[3-4]。昆蟲免疫反應(yīng)的一個(gè)主要方面是感染后快速產(chǎn)生昆蟲防衛(wèi)素等抗菌肽。昆蟲防衛(wèi)素是昆蟲在受到意外傷害和病原微生物入侵時(shí)在昆蟲脂肪體及血淋巴中產(chǎn)生的一種天然免疫多肽[5]，其在昆蟲綱中皆廣泛分布，也存在于其它節(jié)肢動(dòng)物如蝎子(Buthuseqeus)中，在昆蟲免疫防護(hù)的過程中扮演著重要的角色。分離于麻蠅(Sarcophagaperegina)幼蟲和麗蠅(Phormiaterranorae)的2個(gè)抗革蘭氏陽性菌(Gram-positive bacteria，G+)抗菌肽是最早分離出來的昆蟲防衛(wèi)素，因與哺乳動(dòng)物體內(nèi)由粒性白細(xì)胞產(chǎn)生的的一組堿性抗菌肽防衛(wèi)素序列相似而命名[6]。昆蟲防衛(wèi)素主要抗G+,偶爾也有抗革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria,G-)或真菌的報(bào)道，但G-通?？衫闷渫饽さ挚估ハx防衛(wèi)素而對其有抗性。麗蠅防衛(wèi)素能打破藤黃微球菌(Micrococcusluteus)質(zhì)膜滲透性屏障，引起胞質(zhì)內(nèi)K+和 ATP 下降，以及質(zhì)膜部分剝離和細(xì)胞呼吸受阻,這些現(xiàn)象與防衛(wèi)素引起質(zhì)膜脂質(zhì)體內(nèi)形成通道有關(guān)[7]。病原微生物的浸染誘導(dǎo)昆蟲防衛(wèi)素的表達(dá)，昆蟲防衛(wèi)素的構(gòu)效關(guān)系還不清楚，但通常認(rèn)為6個(gè)半胱氨酸殘基組成的3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵和富含精氨酸是其生物活性所必需的[8]。九香蟲Coridiuschinensis為半翅目兜蝽科昆蟲，以葫蘆科植物汁液為食在全國大部分地區(qū)均有分布，主要分布于我國的沿海、中部及西南地區(qū)[9]，為藥食兩用昆蟲，具有極大的開發(fā)利用價(jià)值[10-11]。九香蟲具有較強(qiáng)的免疫防護(hù)手段，其在野外被外源異物侵染死亡的情況較為罕見，具有較為完善的免疫系統(tǒng)。吳瑪莉[12]通過凝膠過濾法從九香蟲血淋巴里分離得到的低分子量蛋白對G+和G-都有抑制作用。李尚偉等[13]通過質(zhì)譜法從九香蟲血淋巴分離得10條小分子多肽，CcAMP1對G+及G-均具有明顯的抑菌作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于九香蟲中防衛(wèi)素基因在表達(dá)水平的研究較少，因此利用反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)克隆九香蟲防衛(wèi)素CcDef3基因的cDNA序列，并利用生物信息學(xué)軟件和方法對其進(jìn)行特征分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)分析其時(shí)空表達(dá)及細(xì)菌對誘導(dǎo)的作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】檢測克隆的九香蟲防衛(wèi)素CcDef3時(shí)空表達(dá)模式和九香蟲被細(xì)菌誘導(dǎo)后表達(dá)水平的變化，揭示九香蟲防衛(wèi)素基因CcDef3的調(diào)控規(guī)律，為深入探究九香蟲體內(nèi)防衛(wèi)素的互作關(guān)系提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

九香蟲成蟲采集于貴州省貴陽市花溪區(qū)，以人工種植的南瓜稈莖飼喂于人工氣候箱內(nèi)，飼養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，濕度(68±5)%，光周期14 L (Light)：10 D (Dark)。不同發(fā)育時(shí)期的樣品取自子1代的卵、1～5齡若蟲和雌雄成蟲；不同組織樣品取自子1代成蟲的頭部、肌肉、體壁、脂肪體、血淋巴、精巢和卵巢。樣本保存在RNAlater(Qiagen,Duesseldorf,Germany)中，貯存于-20 ℃冰箱。

1.2 細(xì)菌誘導(dǎo)

將金黃色葡萄球菌[Staphylocousaureus(ATCC 25923)]和大腸桿菌[Escherichiacoli(ATCC 25923)]等體積混合后，使用微量注射器將10 μL混合菌液注入子1代九香蟲成蟲體內(nèi)，分別在不同的時(shí)間(6、12、24、36和48 h)取浸染后未死亡的蟲體，用無菌剪刀取其腹部,樣本保存在RNAlater(Qiagen,Duesseldorf,Germany)中，貯存于-20 ℃冰箱。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

根據(jù)HP Total RNA Kit(Omega Bio-Tek,GA,USA)說明書提取總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，使用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher,MA,USA)檢測所提取總RNA的純度和濃度，檢測合格的RNA于-80 ℃保存?zhèn)溆?。第一鏈cDNA的制備根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher,MA,USA)說明書進(jìn)行，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 九香蟲CcDef3基因克隆

基于九香蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用相關(guān)的生物信息學(xué)方法并根據(jù)昆蟲防衛(wèi)素的結(jié)構(gòu)特征篩選到1條九香蟲防衛(wèi)素基因。使用NCBI的Primer-BLAST設(shè)計(jì)特異性引物，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成(表1)。在T100 PCR儀(Bio-Rad,CA,USA)上進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL:25 μL 2×TsingKe Master Mix(北京擎科生物公司)，2 μL cDNA模板，上、下游引物(10 μM)各1 μL，補(bǔ)加21 μL滅菌超純水。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，回收純化目的基因，連接到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取重組子進(jìn)行菌落PCR鑒定，送陽性克隆至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序，將克隆測出的序列和數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對驗(yàn)證。

表1 九香蟲防衛(wèi)素基因CcDef3克隆與表達(dá)分析的引物信息

1.5 CcDef3基因的生物信息學(xué)分析

CcDef3基因的編碼區(qū)用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/ )進(jìn)行預(yù)測，采用SignalP 4.1 Server (http:www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號(hào)肽及前肽，用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) 對編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分子量和等電點(diǎn)預(yù)測。用NetOGlyc 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)和NetNGlyc1.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測糖基化位，DiANNA 1.1 web server(http://clavius.bc.edu/～clotelab/DiANNA/)預(yù)測二硫鍵，用KinasePhos(http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/)預(yù)測磷酸化位點(diǎn)。PSORT II Prediction(https://psort.hgc.jp/form2.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，用DNAMAN 9.0(Lynnon Biosoft,CA,USA)將CcDef3氨基酸序列同20種防衛(wèi)素氨基酸序列進(jìn)行比對；并使用MEGA-X構(gòu)建CcDef3與20種其它昆蟲防衛(wèi)素的進(jìn)化樹。表2為氨基酸序列比對和構(gòu)建進(jìn)化樹的防衛(wèi)素來源物種和GenBank登錄號(hào)。使用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)的同源建模方法預(yù)測成熟CcDef3的三維結(jié)構(gòu)，用PyMOL 1.4繪制其分子結(jié)構(gòu)圖。

1.6 基因表達(dá)模式解析

用C1000 Thermal Cycler(Bio-Rad,CA,USA)進(jìn)行RT-qPCR檢測CcDef3基因的時(shí)空表達(dá)模式及誘導(dǎo)后的響應(yīng)模式。RT-qPCR反應(yīng)按照2×SYBR Select Master Mix(Thermo Fisher,MA,USA)說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為10 μL:1 μL第1鏈 cDNA，上、下游引物(表1)各0.5 μL，5 μL 2×SYBR Select Master Mix,3 μL無RNA酶的無菌去離子水。反應(yīng)程序：50 ℃ 120 s；95 ℃預(yù)變性120 s；95 ℃變性15 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸60 s,40 cycles。以九香蟲β-actin基因(注冊號(hào)：MK370101)作內(nèi)參對照，每個(gè)樣本重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用2-ΔΔCt法[14]計(jì)算CcDef3的相對表達(dá)量，用SPSS 22進(jìn)行方差分析(ANOVA)，用鄧肯氏新復(fù)極差法(Duncan’s test)進(jìn)行多重檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05，用Sigma Plot 12.5 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CcDef3的cDNA克隆

經(jīng)RT-PCR得CcDef3基因的cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：MN563605)長522 bp(圖1)，5′端非編碼區(qū)為53 個(gè)核苷酸(Nucleotident,nt)，編碼區(qū)為351 nt，3′端非編碼區(qū)為424 nt。

2.2 CcDef3的特征分析

九香蟲防衛(wèi)素CcDef3包含1個(gè)信號(hào)肽、2個(gè)前體肽和1個(gè)成熟肽段，N端信號(hào)肽具17個(gè)氨基酸(Amino acid,aa)，前體肽分別由1個(gè)30 aa及1個(gè)26 aa的肽段組成，因此CcDef3具2個(gè)切割位點(diǎn)(R47↓T48，R73↓A74)，其C端成熟肽包含43個(gè)氨基酸殘基(圖2)。

理化性質(zhì)分析表明，CcDef3的分子式為C198H320N61O57S6，分子量為4684.47 Da，理論等電點(diǎn)為9.13，含有1個(gè)酸性氨基酸(D)及6個(gè)堿性氨基酸(4個(gè)K、2個(gè)R)，成熟肽靜電荷數(shù)為+5。脂肪族氨基酸指數(shù)為63.72，親水性平均系數(shù)為-0.095，表明CcDef3親水性氨基酸殘基數(shù)大于疏水性殘基數(shù)，為親水性蛋白。修飾結(jié)構(gòu)分析顯示該肽既沒N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)，也沒磷酸化位點(diǎn)。保守結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域分析顯示，CcDef3屬于昆蟲防衛(wèi)素家族，具有蝎子毒素及無脊椎動(dòng)物防衛(wèi)素相同的功能結(jié)構(gòu)域，參與免疫防御反應(yīng)。

表2 用于多序列對齊和聚類分析的防衛(wèi)素物種

A:九香蟲總RNA；B:CcDef3基因擴(kuò)增。M:DL2000 DNA marker;1:CcDef3 基因A:Total RNA；B:CcDef3 gene amplification;M:DL2000 DNA marker;1：CcDef3 gene圖1 九香蟲防衛(wèi)素CcDef3基因的電泳圖Fig.1 Electropherogram of CcDef3 gene

通過同源建模方式構(gòu)建的CcDef3三維分子(圖3)顯示，1個(gè)α-螺旋，2個(gè)β-折疊片以及4個(gè)無規(guī)卷曲形成其高級(jí)結(jié)構(gòu)，并用3個(gè)二硫鍵(C76-C107,C93-C112和C97-C114)穩(wěn)定其構(gòu)象。

2.3 同源性和聚類分析

將CcDef3的氨基酸序列在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫里進(jìn)行在線比對結(jié)果顯示，該防衛(wèi)素與來自紅尾碧蝽(P.prasina)的防衛(wèi)素氨基酸序列相似性高達(dá)74.42%。將CcDef3同21個(gè)源于昆蟲的防衛(wèi)素氨基酸序列比對結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，其都具有保守的6個(gè)半胱氨酸(Cysteine，C)位點(diǎn)及連續(xù)的甘氨酸(Glycine，G)位點(diǎn)，此2種保守位點(diǎn)是維持昆蟲防衛(wèi)素活性所必需的結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)顯示，CcDef3與紅尾碧蝽及茶翅蝽防衛(wèi)素聚為一支，再與同屬半翅目的10種蝽類防衛(wèi)素聚為一支；3種螞蟻防衛(wèi)素與同屬膜翅目的蜜蜂防衛(wèi)素聚為一支；再與2種虱目防衛(wèi)素聚為一支。同源性與聚類分析表明，九香蟲防衛(wèi)素與紅尾碧蝽防衛(wèi)素的親緣關(guān)系最近。

2.4 CcDef3基因表達(dá)模式

RT-qPCR分析結(jié)果表明，CcDef3基因在各個(gè)發(fā)育時(shí)期皆有不同程度的表達(dá)，其中在5齡若蟲中的表達(dá)水平最高且顯著高于其他齡期，分別為卵及3齡若蟲的76.44和4.47倍(圖6)。CcDef3在各個(gè)檢測組織內(nèi)都有不同水平的表達(dá)，但表達(dá)水平最高的組織為脂肪體，血淋巴次之，其它組織內(nèi)的表達(dá)水平都相對較低，脂肪體內(nèi)的表達(dá)水平是血淋巴及肌肉中的8.89和219.90倍之多(圖7 )。用細(xì)菌注射誘導(dǎo)九香蟲成蟲，CcDef3的表達(dá)水平上調(diào)至12 h時(shí)達(dá)到最高水平，而后下調(diào)至48 h時(shí)趨向于誘導(dǎo)前的水平，在12 h時(shí)表達(dá)水平分別是感染前和6 h時(shí)的153.24和11.91倍(圖8)。

成熟肽序列用黑色下劃線表示，“*”表示終止密碼子，↓表示切割位點(diǎn)The mature peptide sequence is marked by a black underline,the asterisk shows stop codon,↓ indicates cleavage site圖2 九香蟲防衛(wèi)素基因CcDef3的核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of CcDef3 from C.chinensis

圖根據(jù)CcDef3.pdb數(shù)據(jù)用PyMOL 1.4產(chǎn)生，C76-C107,C93-C112和C97-C114表示二硫鍵This figure is generated with PyMOL 1.4 based on CcDef3.pdb data,C76-C107,C93-C112 and C97-C114 indicates disulfide bonds圖3 成熟CcDef3的三維分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Three-dimensional molecular structure of mature CcDef3

3 討 論

昆蟲防衛(wèi)素是昆蟲抗菌肽中數(shù)量較為龐大的一個(gè)家族，具有較好的抗G+活性，但而抗G-及真菌的活性較低，迄今為止大多數(shù)從昆蟲中分離和鑒定的防衛(wèi)素都是陽離子多肽。目前關(guān)于半翅目昆蟲防衛(wèi)素的研究較少。研究克隆了九香蟲防衛(wèi)素CcDef3的cDNA序列并測序驗(yàn)證，其成熟肽具有同昆蟲防衛(wèi)素的序列特征和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。防衛(wèi)素的分子結(jié)構(gòu)特征與其功能以及活性有著密切的聯(lián)系，如帶正電荷的防衛(wèi)素與帶負(fù)電荷的微生物膜成分通過正負(fù)電荷間的結(jié)合從而發(fā)揮其抗菌作用[15]；6個(gè)半胱氨酸保守位點(diǎn)形成的3個(gè)二硫鍵和防衛(wèi)素典型的半胱氨酸穩(wěn)定的αβ-基序(cysteine-stabilized α β motif,CS α β motif)是其重要的空間結(jié)構(gòu)，對發(fā)揮防衛(wèi)素抗菌活性具有極其重要的作用[16-17]。從九香蟲中克隆得到的防衛(wèi)素CcDef3具有同樣的序列特征及分子結(jié)構(gòu)，成熟的CcDef3為陽離子多肽，含5個(gè)凈正電荷，具有6個(gè)半胱氨酸殘基形成的3個(gè)二硫鍵，CcDef3包含了一個(gè)基序：C-X16-C-X3-C-X9-C-X4-C-X1-C，與昆蟲防衛(wèi)素的基序(C-X5-16-C-X3-C-X9-11-C-X4-7-C-X1-C)一致[18]。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測及同源建模結(jié)果顯示其具有1個(gè)α螺旋及2個(gè)β折疊及4個(gè)無規(guī)則卷曲，2個(gè)β-sheets，α螺旋與C端loop之間由3個(gè)二硫鍵連接并維持其立體上的穩(wěn)定性，一般認(rèn)為α螺旋及β折疊是防衛(wèi)素發(fā)揮其抗菌活性的功能結(jié)構(gòu)[19]。這些序列及結(jié)構(gòu)特征上的相似性揭示了九香蟲防衛(wèi)素CcDef3具有同其它昆蟲防衛(wèi)素一樣的生物功能。昆蟲防衛(wèi)素的半胱氨酸穩(wěn)定CSαβ基序由基因復(fù)制進(jìn)化而來，隨后由于選擇性進(jìn)化壓力而發(fā)散，從而產(chǎn)生一系列不同的副類似物[20]。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CcDef3與其它半翅目防衛(wèi)素形成一個(gè)獨(dú)特的進(jìn)化支，膜翅目防衛(wèi)素與虱目防衛(wèi)素形成一個(gè)分支。

共有的殘基用星號(hào)和黑框表示，強(qiáng)相似的殘基用“：”表示，弱相似殘基用“.”表示Identical residues are indicated by asterisks and black boxes,strongly similar residues are indicated by ‘:’,and weakly similar residues are indicated by ‘.’圖4 CcDef3與其它20種昆蟲防衛(wèi)素氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of amino acid sequences of CcDef3 and 20 other insect defensins

用MEGA-X構(gòu)建昆蟲防衛(wèi)素的鄰接樹，重復(fù)運(yùn)行1 000次，節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值表示自舉檢驗(yàn)值。九香蟲防衛(wèi)素用黑三角形標(biāo)記MEGA-X was used to construct the phylogenetic tree based on amino acid sequences of known insect defensins with Neighbor-Joining method (NJ).One thousand replications were performed and bootstrap confidence values are shown at the nodes.Defensin from C.chinensis is marked with a back triangle圖5 根據(jù)已知的昆蟲防衛(wèi)素構(gòu)建的聚類進(jìn)化樹Fig.5 The phylogenetic tree based on known insect defensins

E為卵，N1～N5為1～5齡若蟲，F(xiàn)為雌成蟲，M為雄成蟲；不同小寫字母表示差異顯著(P < 0.05)，下同E:Egg;N1-N5:1st-5th-instar nymphs;F:female;M:male.Different letters above the bars indicate significant differences (P < 0.05).The same as below圖6 九香蟲不同發(fā)育時(shí)期CcDef3的相對表達(dá)量Fig.6 Relative expression level of CcDef3 at various developmental stages of C.chinensis

FB、Ha、Ov、BW、Te、He與Mu分別表示脂肪體、血淋巴、卵巢、體壁、精巢、頭部及肌肉FB,Ha,Ov,BW,Te,He and Mu represent fat body,hemolymph,ovary,body wall,testis,head and muscle,respectively圖7 九香蟲CcDef3在不同組織部位的相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of CcDef3 in different tissues of C.chinensis

圖8 九香蟲成蟲在不同誘導(dǎo)時(shí)間下CcDef3的相對表達(dá)量Fig.8 Relative expression level of CcDef3 in adult at various time post-induction

前人研究表明，抗菌肽基因的表達(dá)模式受發(fā)育調(diào)控，如來源于遲眼蕈蚊(Bradysiahygida)的抗菌肽BhSGAMP-1具有廣譜抗菌活性，由幼蟲在準(zhǔn)備蛻皮時(shí)由唾液腺特定表達(dá)以幫助預(yù)防微生物侵染[21]。岡比亞按蚊3種防衛(wèi)素(AgDef2,AgDef3及AgDef4)在卵、蛹及成蟲中的表達(dá)水平極低，而在幼蟲中表達(dá)量卻遠(yuǎn)高于其他發(fā)育時(shí)期[22]。Mittapalli[23]等通過研究發(fā)現(xiàn)，麥廮蠅(Hessianfly)防衛(wèi)素MdesDEF-1在3齡幼蟲的表達(dá)水平最高。從CcDef3基因在九香蟲不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況看，CcDef3基因在5齡若蟲的表達(dá)水平最高，而5齡若蟲是九香蟲發(fā)育為成蟲的最后一個(gè)若蟲階段，蛻皮時(shí)期的蟲體比較脆弱，易受到外源異物的感染。推測CcDef3基因有可能受發(fā)育調(diào)節(jié)高水平表達(dá)以抵抗病原菌的感染。

免疫攻擊觸發(fā)了模式識(shí)別受體與病原體相關(guān)分子結(jié)合，激活免疫信號(hào)通路，從而使得昆蟲體內(nèi)免疫細(xì)胞表達(dá)抗菌物質(zhì)作用于病原菌，這個(gè)過程是昆蟲先天性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵[24-25]。在受到感染或濃毒性損傷后，昆蟲抗菌肽在脂肪體中表達(dá)，并分泌到血淋巴中，保護(hù)昆蟲免受微生物的侵害[26-27]。與之前的研究相似，CcDef3基因在九香蟲不同組織中皆有表達(dá)，但在脂肪體中表達(dá)水平卻遠(yuǎn)高于其它組織，這表明CcDef3基因主要在九香蟲的脂肪體中表達(dá)，脂肪體是九香蟲抗感染過程中非常重要的免疫組織。

九香蟲成蟲被細(xì)菌誘導(dǎo)之后，CcDef3基因的表達(dá)水平上調(diào)至12 h時(shí)達(dá)到峰值，在48 h時(shí)趨向于未誘導(dǎo)前的表達(dá)水平。這種受外源病菌誘導(dǎo)后隨時(shí)間先上調(diào)至峰值然后下調(diào)的表達(dá)模式也出現(xiàn)在其它昆蟲防衛(wèi)素基因中，如棉貪夜蛾(Spodopteralittoralis)防衛(wèi)素基因SpliDef在被細(xì)菌誘導(dǎo)后的48 h上調(diào)到峰值后開始下調(diào)[28]，而家蠶(Bombyxmori)防衛(wèi)素基因BmDefensinB僅在被大腸桿菌誘導(dǎo)后8 h就已經(jīng)上調(diào)到峰值[29]。推測在九香蟲成蟲受到細(xì)菌誘導(dǎo)后，蟲體內(nèi)快速合成了防衛(wèi)素CcDef3來抵御細(xì)菌，隨后由于CcDef3等抗菌物質(zhì)發(fā)揮了抗菌作用，清除了體內(nèi)的大量細(xì)菌，在免疫反饋機(jī)制的作用下抑制了CcDef3基因的表達(dá)。但防衛(wèi)素在機(jī)體內(nèi)的互作關(guān)系是復(fù)雜的，九香蟲防衛(wèi)素CcDef3在免疫和發(fā)育調(diào)控中的影響因素及其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

研究克隆了九香蟲防衛(wèi)素基因CcDef3，并分析其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特征，CcDef3具有同其它昆蟲防衛(wèi)素一樣保守的功能結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CcDef3同其它半翅目昆蟲防衛(wèi)素具有高度的同源性；革蘭氏菌液感染成蟲后CcDef3基因在表達(dá)水平上的明顯上調(diào)，表明其參與九香蟲的體液免疫反應(yīng)；CcDef3基因不僅受到自身發(fā)育的調(diào)控，同時(shí)還能被誘導(dǎo)表達(dá)而參與免疫應(yīng)答，表明CcDef3在九香蟲抵御病原菌的侵染過程中扮演著重要角色。