云南煙草抗感PVY品種上Potyvirus屬病毒種類調(diào)查

于海芹，黃昌軍，袁 誠，曾建敏，劉 勇

(云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗室/國家煙草基因工程研究中心，云南 昆明 650021)

【研究意義】煙草病毒病是目前煙葉生產(chǎn)上危害重、分布廣的一大類病害，嚴(yán)重影響煙葉的質(zhì)量和產(chǎn)量，造成的經(jīng)濟(jì)損失已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過細(xì)菌類和真菌類病害[1-2]。據(jù)報道，世界煙草病毒種類達(dá)47種，目前中國已經(jīng)鑒定的煙草病毒病有近20種[1-4]，其中田間危害較為嚴(yán)重的病毒種類主要有煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)[2,5-13]，2001年和2002年從云南省11個縣采集的520個煙草樣本中，TMV、CMV和PVY總檢出率分別為71.74%、55.01%和6.35%[14]。而煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus,TEV)、煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV)和紅辣椒脈斑駁病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)在部分煙區(qū)也造成一定危害[9,13-15]。其中，Potyvirus屬病毒PVY、TEV、TVBMV、ChiVMV在云南省煙草作物上都有報道，Potyvirus屬病毒田間主要以蚜蟲非持久方式傳播，也可以通過摩擦傳播[3]，在煙草上引起花葉、脈帶、蝕紋和葉脈壞死等癥狀，這4種Potyvirus屬病毒癥狀的相似性較高，簡稱為Potyvirus典型癥狀?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】種植抗病品種是防治病害經(jīng)濟(jì)有效的措施。云南省烤煙主栽品種為云煙87、K326和紅花大金元等，均感PVY、TVBMV和ChiVMV[16-18]。中國目前無抗TVBMV和ChiVMV烤煙品種，國內(nèi)外抗PVY烤煙品種大多數(shù)攜帶va位點(diǎn)(簡稱va品種)。已被育種利用的va位點(diǎn)主要來源于X-射線誘變獲得的突變體，缺失eIF41-S基因所在的染色體片段。感病品種攜帶PVY侵染煙草所利用的eIF4E-S基因(簡稱Va品種)。從美國引進(jìn)的抗PVY烤煙品種NC102、NC55，由于生態(tài)適用性等原因，在云南省種植面積較小。直到2015年云南省才自育出抗PVY新品種(系)，有云煙301(抗PVY云煙87)、云煙121、YATAS-6等，其中云煙301是利用va位點(diǎn)定向改良主栽品種云煙87的PVY抗性選育而成，在改良抗性時保留云煙87優(yōu)良的栽培烘烤特性、原煙外觀性狀和感官性狀，示范推廣前景廣闊。這些自育抗PVY烤煙品種(系)2017年開始在PVY危害較重的田塊小面積種植?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2017—2019年在云南省主要煙區(qū)進(jìn)行調(diào)查、取樣和鑒定，分析抗/感PVY主栽品種(系)上Potyvirus屬病毒的種類?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確當(dāng)前Potyvirus屬病毒在云南省煙草作物上的分布情況、va品種示范推廣可能遇到的病原壓力，為云南省煙草va品種布局和病毒病防控等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017—2019年，煙草現(xiàn)蕾期至第2次采烤期間，在昆明市石林縣、宜良縣，曲靖市富源縣、羅平縣、麒麟?yún)^(qū)、師宗縣，玉溪市澄江縣、峨山縣、易門縣、元江縣，昭通市昭陽區(qū)，普洱市鎮(zhèn)沅縣、景東縣，5個市共13個植煙縣(區(qū))，共采集497個表現(xiàn)花葉、脈帶、蝕紋和葉脈壞死等Potyvirus屬病毒典型癥狀的煙草樣品，不包含煙草花葉病毒和番茄斑萎病毒典型癥狀樣本。新鮮樣本檢測或-80 ℃凍存后檢測。

1.2 ELISA檢測方法

樣品準(zhǔn)備：取6 個葉圓片于2 mL 離心管中，加鋼珠在磨樣儀上研磨，加入1 mL 磨樣緩沖液于離心管中搖勻，5000 r/min 離心10 min備用。結(jié)果判斷：(樣品OD405值/陰性對照OD值)>1.5判斷為陽性；(樣品OD405值/陰性對照OD值)<1.5判斷為陰性。

PotyvirusGroup 抗原直接包被法檢測試劑盒為Agdia公司產(chǎn)品(www.agdia.com)，該檢測試劑盒可同時檢測Potyvirus屬病毒。PVY和TEV雙抗體夾心法檢測試劑盒為Agdia公司產(chǎn)品(www.agdia.com)。TVBMV和ChiVMV的雙抗體夾心法檢測試劑盒為Nano Diagnostics LLC公司產(chǎn)品(www.nanodiagnostics.com)。試劑盒檢測方法參考試劑說明書。

抗原直接包被法步驟如下：CB緩沖液作為磨樣緩沖液，磨樣后每孔加120 μL，避光室溫(21～24 ℃)反應(yīng)1 h；用PBST洗板4次；PBST稀釋的5%脫脂奶粉每孔加120 μL，避光室溫反應(yīng)1 h；用PBST洗板4次；ECI緩沖液稀釋的一抗每孔加100 μL，避光室溫反應(yīng)2 h；用PBST洗板4次；ECI緩沖液稀釋的AP酶標(biāo)抗體每孔加100 μL，避光室溫反應(yīng)1 h；用PBST洗板4次；10 mL 1×PNP緩沖液中加入0.01 g PNPP-Na，每孔加入100 μL，避光室溫反應(yīng)，30和50 min分別測定OD405值。

雙抗體夾心法步驟如下：CB緩沖液稀釋包被抗體每孔加120 μL，避光4 ℃過夜或室溫(21～24 ℃)反應(yīng)4 h；用PBST洗板4次；樣品緩沖液磨樣的樣品每孔加100 μL，避光室溫反應(yīng)1 h；用PBST洗板4次；試劑盒推薦的緩沖液稀釋AP酶標(biāo)抗體每孔加100 μL，避光室溫反應(yīng)1 h；用PBST洗板4次；10 mL PNP緩沖液中加入0.01 g PNPP-Na，每孔加入100 μL，避光室溫反應(yīng)，第30和60分鐘分別測定OD405值。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南省煙草主要病毒種類及其發(fā)生頻率

為了解云南省煙草Potyvirus屬病毒種類分布，2017—2019年，在5個市的13個植煙縣(區(qū))，共采集表現(xiàn)花葉、脈帶、蝕紋和葉脈壞死等Potyvirus屬病毒典型癥狀的煙草樣品497個。從抗PVY品種采集的樣品數(shù)量為8～108個，從感PVY品種采集的樣品數(shù)量為3～89個。每個樣品首先采用ELISA檢測Poty，Poty陽性樣品再采用ELISA檢測PVY、TVBMV、ChiVMV和TEV。497個樣品中Potyviruses檢出率85.1%，PVY、TVBMV、ChiVMV和TEV的檢出率分別為14.9%、58.8%、23.3%和7.8%，其它未鑒定到種的Potyviruses樣品(Poty陽性而4種病毒ELISA檢測陰性的樣品)占3.4%(表1)。云南煙草Potyvirus屬病毒檢出率從高至低分別為TVBMV、ChiVMV、PVY和TEV。因為種植抗PVY品種會導(dǎo)致Potyvirus屬病毒檢出率變化，所以筆者根據(jù)感PVY品種的檢出率分析各市Potyvirus屬病毒的種類及其比例。各地感PVY品種檢出率從高至低排列順序，玉溪市為ChiVMV、TVBMV、TEV、PVY，曲靖市為TVBMV、PVY和TEV、ChiVMV，昭通市為PVY、TVBMV、TEV、ChiVMV，昆明市和普洱市的樣品數(shù)量較少，未進(jìn)行排序?？梢姴煌貐^(qū)Potyvirus屬病毒的檢出率存在較大差異。其中TVMBV的發(fā)生危害較為普遍，其檢出率在玉溪、曲靖和昭通樣品中均排在第1位或第2位。玉溪樣品ChiVMV檢出率最高，昭通樣品PVY檢出率最高，與昭通近年來煙草PVY的危害較為突出的現(xiàn)象相符。

2.2 抗/感PVY品種Potyvirus屬病毒檢出率分析

為了解云南省煙草抗/感PVY品種Potyvirus屬病毒種類差異分布，按照抗/感PVY品種分類統(tǒng)計(表2)，感PVY品種上PVY、TVBMV、ChiVMV、TEV的檢出率分別為22.5%、41.7%、25.8%、11.4%，Potyvirus屬其他病毒的檢出率為4.8%?？筆VY品種上PVY、TVBMV、ChiVMV、TEV的檢出率分別為5.8%、79.2%、20.4%、3.5%，Potyvirus屬其他病毒的檢出率為1.8%。對比抗/感PVY品種Potyvirus屬病毒檢出率差異，抗PVY品種比感PVY品種的PVY檢出率低16.7%，下降的PVY發(fā)病率相當(dāng)于抗PVY品種的防治效果。表明抗PVY品種能有效控制PVY的危害?？筆VY品種比感PVY品種的TVBMV檢出率高37.5%，抗PVY品種的ChiVMV檢出率無明顯上升(比感PVY品種的檢出率低5.4%)。值得注意的是，TVBMV檢出率升高，并不能說明抗PVY品種更感TVBMV，而是由于PVY發(fā)病率減少導(dǎo)致的。昭陽區(qū)相距20 km的北閘和守望2個鄉(xiāng)(鎮(zhèn))，同一天采集的樣品檢測結(jié)果支持該結(jié)論(表3)，在北閘抗PVY品種上采集的樣品中，PVY和TVBMV的檢出率分別為3.4%和95.4%；在守望感PVY品種上采集的樣品中，PVY和TVBMV的檢出率分別為50.0%和25.0%；在抗PVY品種Potyvirus屬病毒發(fā)病率低于感PVY品種的情況下，在抗/感病品種上分別采集相同數(shù)量的Potyvirus屬病毒的典型癥狀樣品，由于PVY樣品比例降低導(dǎo)致抗PVY品種的Potyvirus屬其他病毒檢出率升高。

表1 云南省煙草Potyvirus屬病毒種類及其檢出率

表2 抗/感PVY煙草品種Potyvirus屬病毒的種類及其檢出率

表3 PVY重病區(qū)抗/感PVY品種Potyvirus屬病毒種類及其檢出率(昭陽區(qū))

為驗證抗PVY品種不會導(dǎo)致TVBMV和ChiVMV的危害上升，而是采樣方法和PVY發(fā)病率差異導(dǎo)致的，選擇在PVY發(fā)病率低的玉溪澄江品種園采樣檢測。該品種園為了展示抗/感PVY品種的植物學(xué)和農(nóng)藝性狀，在一個0.67 hm2連片的地塊，相鄰種植了抗PVY品種(云煙301，云煙121)和感PVY品種(云煙87，K326)，而且該地塊打頂后PVY、TMV和TSWV等病毒病發(fā)生率不超過1%，不會干擾Potyvirus屬病毒的采樣和檢測。為了使采集樣品能代表真實(shí)的發(fā)病情況，減少采樣方法對檢出率的影響，每個品種均勻挑選8～10行(每行40～50株)，每行逐株調(diào)查，挑選典型Potyvirus屬病毒癥狀采樣。在2個抗PVY品種中采集的74個樣品中，Potyvirus屬病毒檢出率達(dá)到97.3%，在2個感PVY品種中采集的45個樣品中，Potyvirus屬病毒檢出率達(dá)到93.3%，PVY檢出率分別為0和2.2%(表4)。表明抗/感PVY品種上的Potyvirus屬病毒檢出率很高，且相互之間無明顯差異，可排除PVY、TMV、TSWV等病毒的干擾?？?感PVY品種上TVBMV的檢出率都是91.0%以上，抗/感PVY品種上ChiVMV的檢出率分別為58.1%和91.1%。表明澄江品種園抗PVY品種無TVBMV和ChiVMV的檢出率升高現(xiàn)象，即種植抗PVY品種不會導(dǎo)致同屬的TVBMV和ChiVMV危害上升。

表4 PVY輕病區(qū)抗/感PVY品種Potyvirus屬病毒種類和檢出率(澄江品種園)

3 討 論

3.1 云南煙草Potyvirus屬病毒種類及其比例

云南省5個市13個縣采集的497個樣品中Potyvirus檢出率81.58%，PVY、TVBMV、ChiVMV和TEV的檢出率分別為14.9%、58.8%、23.3%和7.8%，其他未鑒定到種的Potyviruses樣品占3.4%。煙草上Potyvirus屬病毒受地域、前作和耕作制度的影響較大，相鄰田塊病毒分布也不均勻，年度間存在較大波動。為準(zhǔn)確掌握不同病毒分布，需要多年多點(diǎn)隨機(jī)采樣檢測。

PVY發(fā)病率高的地區(qū)，多是馬鈴薯的種植年限長，與玉米套種，玉米/馬鈴薯與煙草輪作或者鄰近種植，地塊被雜草包圍(部分雜草是PVY的寄主)。因耕作制度造成的煙草PVY危害區(qū)域相對固定，危害較為嚴(yán)重，可通過種植抗PVY的va品種來降低損失，如云煙301(抗PVY云煙87)和云煙121等。

由于TVBMV和ChiVMV的田間癥狀不明顯，在打頂前后才達(dá)到發(fā)病高峰，此時間段的基層技術(shù)人員和煙農(nóng)忙于采烤和收購，因此，TVBMV和ChiVMV的發(fā)生和危害較少被關(guān)注，在云南烤煙上造成的危害被較大低估。目前我國烤煙主栽品種都感TVBMV和ChiVMV，且世界上少見開展TVBMV和ChiVMV抗病種質(zhì)資源鑒定和篩選，更加缺乏抗病烤煙品種，因此有必要開展抗TVBMV和ChiVMV的種質(zhì)資源鑒定、發(fā)掘和創(chuàng)制。

3.2 種植抗PVY品種對TVBMV和ChiVMV危害的影響

在不考慮發(fā)病率高低、采樣方法等的情況下，僅根據(jù)總樣品中病毒種類的檢出率，容易觀察到抗PVY品種上TVBMV和ChiVMV檢出率升高的現(xiàn)象，進(jìn)而得出一個模糊的結(jié)論“抗PVY品種易感其他病毒病”。本研究分析表明：種植抗PVY品種不會導(dǎo)致TVBMV和ChiVMV危害上升。在PVY發(fā)病率低于1%的澄江品種園，抗PVY品種與感PVY品種的TVBMV或ChiVMV的檢出率相當(dāng)或降低(表4)。在PVY重病地塊(昭陽區(qū))，抗PVY品種上TVBMV或ChiVMV的檢出率高(表3)，是由于在抗感PVY品種上采集相同數(shù)量的該屬病毒典型癥狀樣品檢測導(dǎo)致的。PVY重病地塊種植抗PVY品種，PVY發(fā)病率下降、Potyvirus屬病毒的總發(fā)病率下降，但會導(dǎo)致有癥狀樣品TVBMV或ChiVMV的檢出率升高。

3.3 品種布局的指導(dǎo)

烤煙感染PVY、TVBMV和ChiVMV后，田間癥狀難以區(qū)分。因此，在Potyvirus屬病毒危害較重田塊，有必要先通過室內(nèi)鑒定確定病原種類，將va品種種植在PVY為主的區(qū)域。在種植va品種的田塊，如果在煙株打頂前后發(fā)現(xiàn)Potyvirus屬病毒發(fā)病率較高，需要采樣進(jìn)行病原種類鑒定，明確是由TVBMV或ChiVMV引起，還是由PVY病毒變異克服了va抗性引起的。云南煙區(qū)剛剛開始推廣va品種，病毒變異克服va抗性的概率較小。田間抗PVY品種表現(xiàn)花葉、脈帶癥狀，大部分是感染TVBMV和ChiVMV，而不是基層人員所懷疑的PVY抗性被克服。本研究214個抗PVY品種樣品檢出PVY的比例僅占5.8%。法國和巴西長期種植va品種，雖然突破va抗性的PVY危害上升，大面積種植10年或30年仍然能有效降低PVY損失。

3.4 烤煙中后期病毒病危害

大田期烤煙病毒病種類存在此消彼長的現(xiàn)象。團(tuán)棵期和旺長期以TMV和TSWV為主，這2種病害的癥狀較為獨(dú)特，田間相對容易診斷。Potyvirus屬病毒主要出現(xiàn)在現(xiàn)蕾期至第1～2次采烤期(打頂前后1個月)，這個階段前期感染的TMV開始隱癥，TSWV病株大部分已經(jīng)死亡，PVY病葉主葉脈壞死，而TVBMV和ChiVMV的癥狀不如PVY明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，云南主要煙區(qū)TVBMV和ChiVMV的發(fā)病率高，造成的產(chǎn)量和品質(zhì)損失有待評估。

普查煙草上病害種類的分布和頻率時，應(yīng)記載品種的抗性，分析品種抗性對病害種類分布和頻率的影響。在分析某種病害的檢出率高低時，應(yīng)分析該種病害的發(fā)病率高低和采樣方法對檢出率的影響。采樣方法越能代表病害的發(fā)病率，得出的檢出率數(shù)據(jù)越準(zhǔn)確。首先，根據(jù)基層人員歷年和當(dāng)年掌握的情況，確定目標(biāo)病害發(fā)病率較高且其他非目標(biāo)病害較低的田塊；然后，隨機(jī)挑選能代表該田塊的幾行，每行逐株調(diào)查采樣。為了排除非目標(biāo)病害對目標(biāo)病害的干擾，在抗非目標(biāo)病害品種上調(diào)查目標(biāo)病害的發(fā)生和病原種類，是一種較好的選擇。比如，在抗TMV的NC102上調(diào)查Potyvirus屬病毒；在抗PVY品種上調(diào)查TVBMV和ChiVMV，前提條件是目標(biāo)病害與非目標(biāo)病害之間不存在拮抗或協(xié)同關(guān)系。

4 結(jié) 論

昭陽區(qū)和澄江品種園的樣品檢測結(jié)果均證明，抗PVY品種的TVBMV檢出率升高，是由PVY發(fā)病率降低導(dǎo)致的，抗PVY品種不會導(dǎo)致TVBMV和ChiVMV危害上升。PVY高發(fā)病區(qū)可通過種植抗PVY品種來降低損失，種植前宜進(jìn)行病原種類鑒定，以便將va品種布局在PVY為主的區(qū)域。云南主要煙區(qū)TVBMV和ChiVMV的發(fā)病率高，缺乏抗病品種，需開展抗TVBMV和ChiVMV的種質(zhì)資源鑒定、發(fā)掘和創(chuàng)制。