柴胡皂苷d對兔離體十二指腸平滑肌收縮活動的影響

張建武，羅林，羅濤，楊春艷，陳建華，鄧艾佳，陳衛(wèi)

川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充637100

柴胡皂苷d（Saikosaponin d，SSd，C42H68O13）是從傘形科植物柴胡（北柴胡）和狹葉柴胡（南柴胡）干燥根中提取的一類皂苷類單體成分，為柴胡主要的化學(xué)指標和生物活性成分之一［1］。近年來國內(nèi)外學(xué)者研究表明，SSd的藥理作用較為廣泛，包括抗癌作用［2］，抗過氧化損傷作用［3］，免疫調(diào)節(jié)作用［4］及雌激素樣作用［5］等。據(jù)陳靜等［6］報道，SSd可使離體蟾蜍心臟的心肌收縮力先增強后減弱，其機制可能與促進鈣離子內(nèi)流使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度增加有關(guān)。由于腸道平滑肌的收縮與Ca2+密切相關(guān)，且SSd對腸道平滑肌收縮活動的影響尚未被報道，故此進行了SSd對家兔離體十二指腸平滑肌收縮活動作用的研究，以期為臨床開發(fā)具有促胃腸動力的新藥提供思路，同時為進一步完善SSd的藥理作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物健康中國白兔40只，雌雄兼半，體質(zhì)量（2.3±0.5）kg，由川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（川）2018-076。

1.2 儀器兔類通用實驗器械；BL-420F型生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；HH-601型超級恒溫水浴箱（金壇市科析儀器有限公司）；HW-400E型恒溫平滑肌槽（成都泰盟科技有限公司）；JH-2型張力換能器（中國北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所產(chǎn)品）；FA114型電子天平（上海海康電子儀器廠）；F416196H型加樣槍（艾本德國際貿(mào)易公司）；UPH-III-5T型優(yōu)普純水/超純水制造系統(tǒng)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.3 藥品和試劑SSd（中國科學(xué)院成都生物研究所李甫博士提供，純度99.05%）；鹽酸維拉帕米注射液（Verapamil，V，上海禾豐制藥有限公司，批號：43161001，規(guī)格：5 mg/2 mL）1 g；肝素（heparin，HP，成都市科華化工試劑廠，批號：CAS 9041-08-1）1 g；釕紅（ruthenium red，RR，源葉生物科技有限公司，批號：CAS 11103-72-3）1 g；Tyrode’s液（臺式液，g/L）：氯化鈉（NaCl）8.0 g/L；氯化鈣0.2 g/L；氯化鉀（KCl）0.2 g/L；七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.26 g/L；二水磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）0.065 g/L；碳酸氫鈉（NaHCO3）1.0 g/L；葡萄糖1.0 g/L。

1.4 方法

1.4.1 SSd的制備將60 kg柴胡原料粉碎后置于提取桶中，用純工業(yè)甲醇提取，加熱至約60℃，共提取3次；將提取液合并，減壓濃縮至干燥后懸浮于水中，依次用二氯甲烷和正丁醇萃取；將約2.1 kg正丁醇萃取物上硅膠柱進行層析（拌樣硅膠4 kg，柱層析硅膠12 kg），用12∶1的二氯甲烷、甲醇水飽和溶劑作為初始溶劑進行梯度洗脫，以出樣量的增減作為是否在洗脫劑中添加甲醇的標準，每5000 mL洗脫液蒸餾1次。利用薄層（TLC）對各餾分進行合并，得9個組分，分別為組分1（114 g）、2（100 g）、3（460 g）、4（170 g）、5（145 g）、6（110 g）、7（222 g）、8（50 g）和9（60 g）。用80%甲醇對組分4進行反相制備（10 cm柱，流速280 mL/min，檢測波長203 nm），得CH-4-1（28 g）、CH-4-2（76 g）和CH-4-3（21 g）3個組分；再用40%乙腈對組分CH-4-2進行反相制備、純化（10 cm柱，流速280 mL/min，檢測波長203 nm），得柴胡皂苷a（48.80 g）；用42%乙腈對組分CH-4-3進行反相制備、純化（10 cm柱，流速280 mL/min，檢測波長203 nm），得SSd（18.11 g）。

1.4.2 SSd溶液的制備稱取SSd，用臺氏液溶解分別配制成9、18、36 μmol/L的SSd溶液，用時充分搖勻。

1.4.3 兔離體十二指腸平滑肌標本的制備健康中國白兔，禁食24 h后，用木槌猛擊兔頭枕部致死。迅速沿腹中線打開腹腔，以胃幽門與十二指腸交界處為起點剪取腸管，每只兔取十二指腸同一腸段置于盛有37℃飽和臺氏液的燒杯中，洗凈腸內(nèi)容物，剪成1.5～2.0 cm的腸段作為實驗標本。

1.4.4 腸管收縮活動記錄打開BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)，調(diào)零，定標，在一通道輸入接口處安裝張力換能器。調(diào)節(jié)恒溫平滑肌槽，使水溫保持在（37±0.5）℃，將臺式液加入預(yù)管內(nèi)，藥物管加入20 mL臺式液。將標本一端固定于L型通氣鉤上，另一端連接張力換能器，持續(xù)通入混合氣體（96%O2，4%CO2），每秒1～2個氣泡，溫度37℃，標準負荷1 g，平衡1 h，待腸管穩(wěn)定后進行實驗。

1.4.5 SSd對兔離體十二指腸平滑肌的影響待腸管收縮穩(wěn)定后，實驗組分別加入9、18、36 μmol/L濃度的SSd溶液對腸管進行處理，對照組加入等量臺式液對腸管進行處理，觀察SSd溶液對家兔離體十二指腸平滑肌收縮活動的影響，用區(qū)間測量法記錄十二指腸平滑肌在SSd溶液給藥前1 min和給藥后第5 min的平均收縮力與收縮頻率。

1.4.6 工具藥預(yù)處理后SSd對兔離體十二指腸平滑肌收縮作用的影響待腸管收縮曲線穩(wěn)定達到實驗要求后，實驗組分別加入RR 10 μmol/L，HP 50 mg/L，V 0.1 μmol/L對腸管進行預(yù)處理，孵育15 min后，再加入18 μmol/L的SSd溶液，用區(qū)間測量法記錄十二指腸平滑肌在SSd溶液給藥前1 min和給藥后第5 min的平均收縮力。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計量資料用±s表示，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，組間比較采用LSD方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度SSd對兔離體十二指腸平滑肌的影響分別加入9、18、36 μmol/L的SSd溶液后，兔離體十二指腸平滑肌的平均收縮力均不同程度增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），呈一定的濃度依賴性。而十二指腸平滑肌的收縮頻率變化不大，未表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。對照組無論平均收縮力亦或收縮頻率均未表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組加藥前后兔離體十二指腸平滑肌平均收縮力與收縮頻率（±s）

表1 各組加藥前后兔離體十二指腸平滑肌平均收縮力與收縮頻率（±s）

注：與加藥前比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

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2.2 不同工具藥預(yù)處理后SSd對家兔離體十二指腸平滑肌平均收縮力的影響與相同濃度（18 μmol/L）不加工具藥預(yù)孵的SSd組進行比較，肌漿網(wǎng)ryanodine受體阻斷劑RR（10 μmol/L）預(yù)孵后對SSd增強離體十二指腸平滑肌的收縮作用產(chǎn)生了一定的抑制效果，但并未表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；L型鈣離子通道拮抗劑V（0.1 μmol/L）預(yù)孵后對SSd增強離體十二指腸平滑肌的收縮作用產(chǎn)生了顯著影響，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）受體阻斷劑HP（50 mg/L）預(yù)孵后對SSd增強離體十二指腸平滑肌的收縮作用未產(chǎn)生明顯影響（P＞0.05）。見表2。

表2 不同工具藥預(yù)處理后SSd對家兔離體十二指腸平滑肌平均收縮力的影響（±s）

表2 不同工具藥預(yù)處理后SSd對家兔離體十二指腸平滑肌平均收縮力的影響（±s）

注：與8 μmol/L SSd組比較，#表示P＜0.01，△表示P＞0.05

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3 討論

柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，其味苦、辛，性微寒，歸肝膽經(jīng)，具有解表退熱，疏肝解郁，升舉清氣之功效，以柴胡組成的歷代名方有數(shù)百首之多［7-8］。柴胡皂苷是柴胡的主要化學(xué)和生物活性成分，主要分為柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d等，其中尤以SSd的活性最為明顯，藥理作用也逐漸被現(xiàn)代化學(xué)和藥理實驗研究所闡明，但作用機制尚缺乏系統(tǒng)、完整研究［9］。本實驗觀察到SSd對家兔離體十二指腸平滑肌的收縮活動具有明顯的促進作用（P＜0.05），主要是通過增強十二指腸平滑肌的平均收縮力來完成，對收縮頻率的影響不大，同時表現(xiàn)出一定的濃度依賴性。

研究表明，Ca2+是肌細胞收縮的觸發(fā)因子，而腸平滑肌收縮所需的鈣離子主要來源于細胞外通過電壓依賴性鈣離子通道進入的外鈣離子和細胞內(nèi)肌漿網(wǎng)釋放的內(nèi)鈣離子，當胞內(nèi)Ca2+濃度達到一定水平（1～50 μmol/L）時，與鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合物，后者活化胞質(zhì)中的肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK），活化的MLCK進一步使橫橋中一對20kD的MLC磷酸化，從而觸發(fā)平滑肌細胞收縮［10-12］。而細胞外鈣離子的內(nèi)流主要依賴于L型鈣離子通道，因此本課題組選用L型鈣離子通道拮抗劑V對兔的離體十二指腸進行預(yù)處理，以探究SSd增強十二指腸平滑肌平均收縮力的作用機制。結(jié)果表明，運用維拉帕米預(yù)孵后SSd對十二指腸平均收縮力的促進作用相較于相同濃度下未運用工具藥組明顯降低（P＜0.01），表明SSd很可能是通過影響L型鈣離子通道的活性促進外鈣內(nèi)流從而引起十二指腸平滑肌的收縮活動增強。

據(jù)相關(guān)文獻報道，細胞內(nèi)釋放的鈣離子主要來自于肌漿網(wǎng)，肌漿網(wǎng)內(nèi)釋放的鈣離子主要通過IP3受體和ryanodine受體來完成。當這些受體被激活后，可引起肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放，從而引起細胞內(nèi)鈣離子濃度增加，誘導(dǎo)平滑肌收縮［13-14］。SSd亦有可能通過作用于三磷酸肌醇受體或ryanodine受體誘導(dǎo)內(nèi)鈣釋放增加從而引起十二指腸平滑肌的收縮活動增強，因此本實驗運用肌漿網(wǎng)IP3受體阻斷劑HP和ryanodine受體阻斷劑RR進行了相關(guān)機制探究。結(jié)果顯示，預(yù)先運用肌漿網(wǎng)IP3受體阻斷劑HP對SSd促進十二指腸平滑肌的收縮活動無影響（P＞0.05）；而預(yù)先運用ryanodine受體阻斷劑RR處理對十二指腸平滑肌的收縮活動有一定抑制，但是并未表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差 異（P＞0.05）。據(jù)此推斷，IP3受體途徑和ryanodine受體途徑可能并未介導(dǎo)SSd對十二指腸平滑肌收縮活動的促進作用。

綜上所述，SSd可以促進兔離體十二指腸平滑肌的收縮活動，增強其平均收縮力，其作用機制可能是通過增強L型鈣離子通道的活性促進外鈣內(nèi)流而實現(xiàn)，與IP3受體途徑和ryanodine受體途徑可能并無關(guān)聯(lián)，具體機制仍需進一步探究。