?；撬釋趋兰∪毖?再灌注損傷大鼠肌漿網(wǎng)功能的影響

李燕，王吉先，趙新衛(wèi)，劉軍

(青島西海岸新區(qū)中心醫(yī)院，山東青島266555)

骨骼肌缺血/再灌注(I/R)損傷是臨床常見的病理生理過程，常見于斷肢(指)再植、骨筋膜間室綜合征、四肢大血管損傷等血流重建后，輕者可引起骨骼肌局部損傷，重者可導(dǎo)致肢體壞死，甚至危及生命。骨骼肌I/R損傷的發(fā)生機(jī)制迄今尚未完全闡明。肌漿網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)Ca2+的貯庫，其功能是參與肌肉興奮收縮偶聯(lián)并維持肌細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+穩(wěn)態(tài)。目前認(rèn)為，骨骼肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載及肌漿網(wǎng)功能障礙是骨骼肌I/R損傷發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。?；撬崾巧窠?jīng)、肌肉、腺體等可興奮組織內(nèi)含量最豐富的自由氨基酸，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)、清除氧自由基、抑制膜脂質(zhì)過氧化等多種生物學(xué)功能[1]。以往研究證實，?；撬釋/R導(dǎo)致的大鼠心、腦組織以及骨骼肌損傷有確切防治作用[2～5]。2014年6月～2015年8月，我們觀察了?；撬釋Υ笫驣/R損傷時骨骼肌肌漿網(wǎng)功能的影響，并探討其防治骨骼肌I/R損傷的可能機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料

實驗動物：雄性Wistar大鼠18只，SPF級，10周齡，體質(zhì)量336～350 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，動物許可證號：SYXK(京)2011-0039。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，環(huán)境溫度20～25 ℃、濕度(50±5)%，光照12 h明暗交替。主要儀器：QuantulusTMGCT 6220液體閃爍計數(shù)儀，美國Perkin Elmer公司；Optima XPN低溫超速離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司，MultiskanTMFC酶標(biāo)儀、Evolution 600紫外-可見分光光度，美國Thermo Fisher Scientific公司。PMSF、Leupeptin、A23187、PEP、Caffeine、Ryanodine，美國Sigma公司；3H-Ryanodine，美國NEN DuPout公司；45CaCl2，英國Amersham公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.2 骨骼肌I/R損傷模型制備及?；撬岣深A(yù) 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對照組、模型組、牛堿酸組，每組6只。模型組、?；撬峤M參照Lamboley等[6]的方法建立骨骼肌I/R模型：術(shù)前禁食12 h，戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉，用止血帶扎緊雙后肢根部以阻斷血流2 h，松開止血帶恢復(fù)血流2 h。?；撬峤M制模前30 min經(jīng)左頸外靜脈注射0.6 mol/L的?；撬?.5 mL/kg，模型組經(jīng)左頸外靜脈注射生理鹽水1.5 mL/kg。對照組僅經(jīng)左頸外靜脈注射生理鹽水1.5 mL/kg，不制備骨骼肌I/R損傷模型。

2.3 ?；撬釋趋兰/R損傷大鼠組織水腫及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響 模型組與?；撬峤M再灌注2 h，對照組同時間，腹腔注射麻醉后，完整分離左側(cè)股內(nèi)側(cè)肌群，切取一半稱濕重，90 ℃徹底干燥后稱干重，計算濕重/干重，以此反映組織水腫情況。取另一半左側(cè)股內(nèi)側(cè)肌群，用預(yù)冷生理鹽水制成10%肌組織勻漿，分別采用硫代巴比妥酸法檢測脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量，化學(xué)比色法檢測髓過氧化物酶(MPO)活性，以此評估骨骼肌I/R后氧化應(yīng)激反應(yīng)情況。結(jié)果顯示，模型組與?；撬峤M骨骼肌濕重/干重及MDA含量、MPO活性均明顯高于對照組，但?；撬峤M上述指標(biāo)均明顯低于模型組(P均<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 各組骨骼肌濕重/干重及氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

2.4 ?；撬釋趋兰/R損傷大鼠肌漿網(wǎng)功能影響的觀察

2.4.1 骨骼肌肌漿網(wǎng)制備 參照McGrew等[7]的方法制備骨骼肌肌漿網(wǎng)。分離各組雙側(cè)腓腸肌和比目魚肌，0～4 ℃生理鹽水沖洗，加入7.5倍體積的Buffer A(含20 mmol/L焦磷酸鈉，20 mmol/L PBS，1 mmol/L MgCl2，0.303 mol/L蔗糖，0.5 mmol/L EDTA，76.8 nmo1/L aprotinin，1.1 μmol/L Leupeptin、0.23 mmol/L PMSF)，冰浴中剪碎肌肉組織，Polytron勻漿器中勻漿，1 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)紗布過濾，沉淀再復(fù)溶于5倍體積的Buffer A中，重復(fù)上述過程，合并2次濾液，16 000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀用5倍體積的Buffer C(含0.6 mol/L KCl，0.303 mol/L蔗糖，pH 7.0)重懸，冰上孵育30 min，45 000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀即為骨骼肌肌漿網(wǎng)。

2.4.2 牛磺酸對肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性的影響 參照Fauconnier等[8]的方法檢測Ca2+-ATPase活性。分別取三組上述制備的肌漿網(wǎng)50 μg，加入Ca2+-ATPase活性反應(yīng)液(A溶液：50.0 mmol/L Histidine，5 mmol/L MgCl2，111 mmol/L KCl，0.001 mmol/L CaCl2；B溶液：50.0 mmol/L Histidine，5 mmol/L MgCl2，111 mmol/L KCl，1.1 mmol/L EDTA，3.3 μg/mL A23187；使用前A溶液與B溶液1∶1混合，再加入新鮮配置的3.33 mmol/L PEP和15 U/mL PK)1 mL，37 ℃孵育10 min，加入ATP溶液0.1 mL(30 mmol/L Na2-ATP)啟動反應(yīng)，37 ℃孵育20 min終止反應(yīng)。采用定磷法檢測肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性。計算Ca2+-ATPase活性=樣品磷(Pi)含量/(反應(yīng)蛋白量×反應(yīng)時間×1 000)。結(jié)果顯示，對照組肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性為(2.24±0.13)μmol Pi/(mg protein·min)，模型組為(1.35±0.16)μmol Pi/(mg protein·min)，?；撬峤M為(1.79±0.23)μmol Pi/(mg protein·min)。模型組與?；撬峤M肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性均明顯低于對照組，但?；撬峤M肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase活性明顯高于模型組(P均<0.01)。

2.4.3 ?；撬釋{網(wǎng)3H-Ryanodine受體結(jié)合的影響 采用同位素標(biāo)記法。取三組上述制備的肌漿網(wǎng)150 μg，加入結(jié)合緩沖液(含1 mol/L KCl，25 μmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES，pH 7.4)，調(diào)整體積至180 μL，再加入10 nmol/L3H-Ryanodine 20 μL，總體積200 μL。非特異性配體結(jié)合管的孵育液含50 μmol/L未標(biāo)記的Ryanodine 20 μL，37 ℃孵育2 h，用預(yù)冷的緩沖液沖洗3次終止反應(yīng)，Millipore抽濾后，將濾膜干燥，置于2 mL閃爍液中。采用液體閃爍計數(shù)儀檢測3H-Ryandine的配體-受體最大結(jié)合量(Bmax)以及解離常數(shù)(Kd)。結(jié)果顯示，模型組與?；撬峤M肌漿網(wǎng)3H-Ryandine配體-受體的Bmax均明顯低于對照組，Kd均明顯高于對照組(P均<0.01)；但牛磺酸組肌漿網(wǎng)3H-Ryandine配體-受體的Bmax明顯高于模型組，Kd明顯低于模型組(P均<0.01)。見表2。

表2 各組肌漿網(wǎng)3H-Ryandine配體-受體Bmax、Kd比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

2.4.4 ?；撬釋{網(wǎng)45Ca2+攝取能力的影響 采用同位素標(biāo)記法。取三組上述制備的肌漿網(wǎng)120 μg，加入Ca2+攝取反應(yīng)液(含0.1 mmol/L KCl，5 mmol/L MgCl2，50 μmol/L CaCl2，20 mmol/L HEPES，pH 7.1)120 μL，再加入45CaCl23.7 kBq，總反應(yīng)體系200 μL，混勻后加入500 mmol/L Na2-ATP 2 μL，37 ℃孵育30 min，加入冷沖洗液(含0.1 mol/L KCl，0.6 mol/L Tris-HCl，pH 7.2)混勻，2 min后終止反應(yīng)。在Millipore上抽濾到0.45 μm濾膜上，取出濾膜干燥，置于閃爍液中。參照Fauconnier等[8]的方法，采用液體閃爍計數(shù)儀檢測45Ca2+的放射活性，并換算成肌漿網(wǎng)45Ca2+攝取量。結(jié)果顯示，對照組肌漿網(wǎng)45Ca2+攝入量為(0.74±0.10)nmol/mg protein，模型組為(0.53±0.05)nmol/mg protein，?；撬峤M為(0.60±0.04)nmol/mg protein。模型組與?；撬峤M肌漿網(wǎng)45Ca2+攝入量均明顯低于對照組(P均<0.01)；但牛磺酸組肌漿網(wǎng)45Ca2+攝入量明顯高于模型組(P<0.05)。

2.4.5 ?；撬釋{網(wǎng)45Ca2+釋放能力的影響 采用同位素標(biāo)記法。取三組上述制備的的肌漿網(wǎng)120 μg，按照2.4.4方法加入Ca2+攝取反應(yīng)液，37 ℃孵育30 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用PBS洗滌后，加入Ca2+釋放液(含80 mmol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L caffeine，pH 6.8)400 μL，分別于1、3、5 min各取100 μL，采用液體閃爍計數(shù)儀檢測45Ca2+的放射活性，并換算成骨骼肌肌漿網(wǎng)45Ca2+釋放量。結(jié)果顯示，三組加入反應(yīng)液1 min時45Ca2+釋放速度比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)；模型組與?；撬峤M加入反應(yīng)液3、5 min時45Ca2+釋放量均明顯低于對照組(P均<0.01)，但?；撬峤M45Ca2+釋放量明顯高于模型組(P均<0.01)。見表3。

表3 各組肌漿網(wǎng)45Ca2+釋放量比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

3 討論

細(xì)胞內(nèi)鈣超載是I/R損傷發(fā)生的重要機(jī)制。當(dāng)I/R發(fā)生時，細(xì)胞膜上Ca2+泵以及Na+/Ca2+交換體活性異常導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，引起細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)受損。肌漿網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)Ca2+的貯庫，其功能是參與肌肉興奮收縮偶聯(lián)并參與維持肌細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+穩(wěn)態(tài)，Ca2+穩(wěn)態(tài)主要通過調(diào)節(jié)Ca2+的攝取與釋放而實現(xiàn)[5，6]。Ca2+的攝取由Ca2+泵(Ca2+-ATPase)的活性決定，而Ca2+的釋放則與肌漿網(wǎng)上存在的一種特定Ca2+釋放通道Ryanodine受體有關(guān)。Ryanodine受體可介導(dǎo)肌肉興奮-收縮偶聯(lián)過程中Ca2+的釋放[7]。已有研究顯示，I/R損傷導(dǎo)致肌漿網(wǎng)Ca2+的攝取與釋放異常,改善肌漿網(wǎng)功能可起到緩解I/R損傷的作用[9,10]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肌漿網(wǎng)Ryanodine受體缺陷是心肌I/R過程中Ca2+超載的重要原因[8,11]。

?；撬崾且环Nβ-氨基酸，其性質(zhì)穩(wěn)定，在體內(nèi)由蛋氨酸代謝生成，在骨骼肌和心肌中含量比較豐富。研究證實，?；撬峋哂姓{(diào)節(jié)滲透壓、抗細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)膜穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、參與離子跨膜轉(zhuǎn)運以及參與線粒體蛋白合成等多種生物學(xué)功能[1,2,12]。?；撬岵粌H可拮抗I/R引起的心肌細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)過氧化，降低I/R引起的心律失常，還可穩(wěn)定線粒體膜電位、抑制線粒體損傷[13～15]。目前認(rèn)為，牛磺酸主要通過激活A(yù)kt或PKCε信號通路啟動對I/R損傷的拮抗作用，同時通過促進(jìn)eNOS表達(dá)及磷酸化促進(jìn)NO生成，拮抗I/R損傷[1]。

I/R所致組織損傷的一個典型變化是組織淤血水腫。骨骼肌濕重/干重可反映I/R后組織淤血水腫情況。本研究結(jié)果顯示，模型組骨骼肌出現(xiàn)明顯淤血水腫，而牛磺酸組淤血水腫減輕，證實外源性牛磺酸可減輕骨骼肌I/R損傷。引起組織I/R損傷的機(jī)制多與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，故本研究觀察了骨骼肌組織MDA含量和MPO活性。結(jié)果顯示，模型組與?；撬峤M骨骼肌MDA含量和MPO活性均明顯高于對照組，而?；撬峤MMDA含量和MPO活性明顯低于模型組，提示骨骼肌I/R后出現(xiàn)了明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而?；撬崮苊黠@抑制脂質(zhì)過氧化物引起的氧化應(yīng)激損傷，與其對心肌I/R損傷的保護(hù)效應(yīng)一致。為進(jìn)一步探索?；撬岬谋Ｗo(hù)機(jī)制，本研究觀察了大鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)對Ca2+攝取和釋放的影響。結(jié)果顯示，模型組肌漿網(wǎng)45Ca2+攝入量和45Ca2+釋放量均明顯低于對照組，而?；撬峤M明顯優(yōu)于模型組，說明牛磺酸可改善肌漿網(wǎng)Ca2+攝取和釋放的功能，從而減輕細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，減輕I/R損傷。進(jìn)一步研究顯示，模型組3H-Ryandine配體-受體的Bmax顯著減少，而配體-受體的Kd明顯增加，?；撬峤M上述指標(biāo)均有一定程度改善，提示骨骼肌I/R損傷后肌漿網(wǎng)RyR通道異常，導(dǎo)致肌漿網(wǎng)Ca2+攝取和釋放平衡被破壞，從而影響骨骼肌興奮收縮偶聯(lián)，導(dǎo)致骨骼肌功能障礙；而?；撬嵬ㄟ^促進(jìn)I/R損傷時肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase的活性，增加Ca2+攝取，同時也可增加Ryandine受體通道活性，提高Ca2+釋放速度而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡。已有文獻(xiàn)證實，?；撬岬拇x產(chǎn)物牛黃膽酸也可作用于Ca2+泵，促進(jìn)Ca2+回收，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平；?；撬峒捌浯x產(chǎn)物還可通過直接激活Ryanodine受體而保護(hù)骨骼肌興奮收縮偶聯(lián)的正常運轉(zhuǎn)，恢復(fù)骨骼肌的收縮功能[16]。

綜上所述，?；撬釋Υ笫蠊趋兰/R損傷具有一定防治作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)以及調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)Ca2+穩(wěn)態(tài)有關(guān)。