基于脊髓中樞敏化內(nèi)熱針干預(yù)慢性軟組織疼痛機(jī)制研究*

段軼軒 張照慶 尹 晶 駱小娟 武 歡 夏 楊 胡 飛

（武漢市第三醫(yī)院 武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院疼痛康復(fù)科，武漢 430060）

慢性軟組織疼痛是威脅健康最主要的原因之一，并且可導(dǎo)致勞動(dòng)能力的喪失。來(lái)自歐美國(guó)家的流行病學(xué)調(diào)查顯示，成年人慢性軟組織疼痛的發(fā)生率高達(dá)30%左右。慢性疼痛還可伴隨焦慮、抑郁以及飲食和睡眠障礙等，嚴(yán)重影響疼痛病人的生活質(zhì)量，給病人及其家庭和社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。內(nèi)熱針療法在腰椎間盤(pán)突出癥、腰椎管狹窄、頑固性腰腿疼痛、各型頸椎病、粘連性肩關(guān)節(jié)囊炎等慢性軟組織疼痛的治療中療效顯著，可以有效、安全地緩解各種慢性肌肉、軟組織疾病引起的痛覺(jué)過(guò)敏[1～5]。但其治療機(jī)制值得探討，目前已經(jīng)從外周敏化，如炎性反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的角度進(jìn)行了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)降低TNF-α、IL-1β及IL-6 等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，改善局部炎癥反應(yīng)，通過(guò)降低p-Akt和NF-κB蛋白水平，抑制Akt/NF-κB信號(hào)通路的激活，促進(jìn)組織損傷的修復(fù)[6]。但當(dāng)機(jī)體發(fā)生慢性軟組織疼痛時(shí)，軀體感覺(jué)通路被激活，除了外周炎性損傷，中樞系統(tǒng)也會(huì)發(fā)生一系列的復(fù)雜變化。其中中樞敏化是損傷后超敏感性疼痛的主要原因，也是慢性軟組織疼痛中痛覺(jué)過(guò)敏的主要病理基礎(chǔ)。中樞敏化是指脊髓背角傷害性突觸信息傳遞增強(qiáng)導(dǎo)致痛覺(jué)敏感[7]。

內(nèi)熱針療法是一種沿革于溫針灸而優(yōu)于溫針灸的新式針灸，采用針芯電阻絲均勻加熱，可對(duì)針尖溫度進(jìn)行電腦溫控，通過(guò)針具的內(nèi)部改良和電流的結(jié)合產(chǎn)生溫控效應(yīng)，可有效解決受熱不均勻、皮膚燒燙傷的問(wèn)題，同時(shí)也不再產(chǎn)生油煙、氣味等污染環(huán)境。其又沿襲了溫針灸溫經(jīng)散寒、活血通絡(luò)的作用，又能通過(guò)對(duì)軟組織的密集針刺改善肌肉痙攣和局部組織血液循環(huán)，是對(duì)溫針灸療法的沿襲和傳承，又是對(duì)它的一種革新。

本研究采用內(nèi)熱針干預(yù)慢性軟組織疼痛大鼠，通過(guò)觀察L4-6脊髓節(jié)段相關(guān)遞質(zhì)的表達(dá)及脊髓背角神經(jīng)元突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)的影響，來(lái)探討內(nèi)熱針干預(yù)慢性軟組織疼痛的脊髓中樞敏化的機(jī)制。以期為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，最終尋找到一種有效的治療慢性軟組織疼痛的方法，減輕病人及其給家庭和社會(huì)帶來(lái)的嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雄性SD大鼠45只，3月齡，體重 300～350 g，由三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，本研究涉及的所有動(dòng)物操作，均嚴(yán)格遵循三峽大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定，動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（鄂）2017-0061。同一條件下分籠飼養(yǎng)，所有大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)儀器：KF型內(nèi)熱針治療儀（濟(jì)南佳科醫(yī)療科技有限公司）。內(nèi)熱針總長(zhǎng)6 cm，針柄長(zhǎng)2 cm，針體長(zhǎng)4 cm，針體產(chǎn)熱長(zhǎng)度4 cm（濟(jì)南佳科醫(yī)療科技有限公司）。機(jī)械痛測(cè)痛儀（美國(guó)Model2390CE,IITC, Life science, Inc）。熱痛測(cè)痛儀（美國(guó)Mode390,IITC, Life science, Inc）。Z2J-MB-NCC08 型肌電圖儀（上海諾誠(chéng)醫(yī)療器械有限公司）。鎢絲微電極電極阻抗（美國(guó)Stoelting）。TGL-16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (Biobase)。DR-200B 酶標(biāo)儀（無(wú)錫華衛(wèi)德朗）。JY600E 電泳系統(tǒng) (Junyi)。110V-240V 凝膠成像儀（上海勤翔）。KZ-II型勻漿儀（康濤科技）。D3024R型臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī) (DragonLab)。SLAN熒光定量PCR儀（上海宏石醫(yī)療器械有限公司）。SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰）。NanoDrop2000超微量分光光度計(jì) (Thermo)。FBZ2001-up-p標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司）。

實(shí)驗(yàn)試劑及耗材：NC膜 (PALL)，脫脂奶粉(BD)，彩色預(yù)染蛋白marker, ECL, SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液 (5x)，PMSF，磷酸酶抑制劑，蛋白酶抑制劑 (Biosharp)，BCA蛋白濃度定量試劑盒（碧云天），TRIZOL（天根生物），三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），Hy-Pure TMMolecular Biology Grade Water (HyClone)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo)，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master (Rox)(Roche)，引物（天一輝遠(yuǎn)）。

2.實(shí)驗(yàn)方法

分組：將45只大鼠編號(hào)，用SPSS編程隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、內(nèi)熱針組，每組15只。

模型制備：組織損傷模型參考 Mc Brier等[8]與王緒明[9]機(jī)械沖擊挫傷軟組織的造模方法，將實(shí)驗(yàn)大鼠稱重編號(hào)后，自然飼養(yǎng)，用10%的水合氯醛以3 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后將大鼠俯臥位，四肢逐個(gè)固定于大鼠臺(tái)上，防止大鼠移位。將左側(cè)后肢腓腸肌處皮膚剪毛，直至可見(jiàn)大鼠肉色皮膚但不損傷皮膚為宜。用緩沖墊將左側(cè)后肢墊起，以防止其懸空和下肢移位。將左后肢稍外旋，使其小腿后群肌置于脛骨、腓骨內(nèi)側(cè)，將固定器置于腓腸肌上方壓緊，防止大鼠移動(dòng)導(dǎo)致目標(biāo)肌群移位。將實(shí)驗(yàn)打擊器械中央桿上的500 g砝碼（其中心穿過(guò)長(zhǎng)為40 cm的圓形鐵桿，鐵桿末端對(duì)準(zhǔn)固定器的中央）置于中央桿最高點(diǎn)處（25 cm處），從中央桿最高點(diǎn)處沿著鐵桿自由下落，作用于下方的固定器上方，導(dǎo)致肌肉組織的一次性鈍、挫傷，反復(fù)重復(fù)10次，造成大鼠組織急性鈍、挫傷。造模后，不給實(shí)驗(yàn)大鼠任何治療或處理，正常環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)。

造模評(píng)價(jià)：造模后對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)定以初步判斷造模成功與否，模型組及內(nèi)熱針組大鼠在造模后第1天精神狀態(tài)均較萎靡，活動(dòng)減少，足趾并攏卷曲，行走時(shí)有跛行傾向，左后肢拖地，重心偏右?？梢源顺醪脚袛鄬?shí)驗(yàn)大鼠造模成功。經(jīng)過(guò)15天，形成大鼠慢性軟組織損傷動(dòng)物模型。在進(jìn)行取材后，取模型組及內(nèi)熱針組大鼠局部組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察，造模后左側(cè)后肢腓腸肌肌肉肌腱接頭處肌肉組織肌纖維部分?jǐn)嗔?、結(jié)構(gòu)紊亂、排列混亂、間隙變大、大量中央多角形萎縮的肌纖維、肌萎縮嚴(yán)重、有中央多核的胞漿呈泡沫狀及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以此證明造模成功（見(jiàn)圖1）。否則排除，不納入實(shí)驗(yàn)。

圖1 慢性軟組織疼痛大鼠左側(cè)后肢腓腸肌肌肉肌腱接頭處組織標(biāo)本病理形態(tài)學(xué)改變（HE染色，× 200 Scale bar = 200 μm）Fig. 1 Pathomorphological changes of tissue specimens in muscle-tendon junction of left hind limb gastrocnemius in experimental rats with chronic soft tissue pain (HE staining, × 200 Scale bar = 200 μm)

處理方法：對(duì)照組：正常飼養(yǎng)，不采取任何干預(yù)措施。模型組：造模完成后正常飼養(yǎng)。內(nèi)熱針組：造模完成后，采用內(nèi)熱針治療，常規(guī)麻醉固定，實(shí)驗(yàn)大鼠左側(cè)損傷的組織皮膚消毒，參照華興邦《常用動(dòng)物動(dòng)物腧穴圖譜》定位，以“承山”為中心，與腓腸肌肌肉組織走行相平行的方向刺入損傷組織，針尖觸及骨面，布針2～3枚，連接內(nèi)熱式針灸治療儀，43℃恒溫加熱20 min后取針，按壓止血并消毒。每周治療1次，共治療2次。

3.取材及指標(biāo)檢測(cè)

取材：將3組大鼠在內(nèi)熱針治療完成后第4天用10%的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，將麻醉后的大鼠固定于解剖臺(tái)上，固定方法同前。切開(kāi)大鼠胸部皮膚，剪斷劍突兩側(cè)肋骨，迅速暴露心臟。將動(dòng)脈套管針從左心室插入升主動(dòng)脈，止血鉗固定套管針，在右心耳剪一小口，經(jīng)套管針快速灌注4%多聚甲醛固定液，待右心耳處流出液清亮?xí)r再緩慢灌注500 ml固定液固定。灌流畢，取L4-6脊髓節(jié)段部分浸泡于4%多聚甲醛固定液，置于4℃冰箱過(guò)夜備用。

觀察指標(biāo)：觀察大鼠行為學(xué)改變，機(jī)械縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT) 及熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)。采用Western Blot法觀察慢性軟組織疼痛大鼠L4-6脊髓節(jié)段離子型谷氨酸受體(iGluRs)相關(guān)亞單位NR1、NR2B、GluR1蛋白的表達(dá)。采用RT-PCR法觀察慢性軟組織疼痛大鼠L4-6脊髓節(jié)段離子型谷氨酸受體(iGluRs)相關(guān)亞單位NR1、NR2B、GluR1 mRNA的表達(dá)。采用電生理方法誘導(dǎo)檢測(cè)脊髓背角神經(jīng)元突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng) (long-term potentiation, LTP)。

指標(biāo)檢測(cè)：各組大鼠在造模完成后的第1天、6天、14天，分別測(cè)定大鼠的MWT。將待測(cè)大鼠置于透明的有機(jī)玻璃箱中，底為鐵絲網(wǎng)。觸覺(jué)用一勻速上升的觸針測(cè)定。待其適應(yīng)環(huán)境安靜后，用儀器機(jī)械力觸針垂直對(duì)準(zhǔn)左后肢足底后外處。啟動(dòng)儀器，觸針上升經(jīng)底板網(wǎng)眼碰觸測(cè)試部位，當(dāng)觸頂?shù)臋C(jī)械力增大到一定程度時(shí)大鼠會(huì)因疼痛而抬起后足，儀器自動(dòng)記錄該部位受碰觸后抬足或離開(kāi)時(shí)觸針?biāo)┡鲇|力單位。最大碰觸力經(jīng)測(cè)試定為50 g，運(yùn)行時(shí)間5 s。共測(cè)量5次，每次間隔5 min，取5次數(shù)值的平均值。

在造模完成后的第1天、6天、14天，分別采用熱板實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)各組大鼠TWL。將熱平板溫度設(shè)置為 (52±0.2)℃。待溫度穩(wěn)定后，將大鼠放置于熱平板上，記錄從接觸平板到抬起右后足或舔右后足的間隔時(shí)間。測(cè)量時(shí)間上限值為30 s，共測(cè)量5次，每次間隔時(shí)間大于15 min，取5次數(shù)值的平均值。

NR1、NR2B、GluR1 蛋白及mRNA的表達(dá)：標(biāo)本置于冰鎮(zhèn)玻璃試管中，按每100 mg組織濕重3 ml的比例加入4℃的10%磺基水楊酸，在冰浴下用內(nèi)切式勻漿機(jī)制備組織勻漿。采用分子生物學(xué)（Western Blot 和RT-PCR）方法，觀察慢性軟組織疼痛大鼠L4-6脊髓節(jié)段中樞敏化相關(guān)主要iGluRs相關(guān)亞單位NR1、NR2B、GluR1蛋白及mRNA的表達(dá)。

Western Blot法：用含1%苯甲基磺酰氟的RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，將提取的蛋白溶液按照4:1比例加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性10 min，保存于-20℃冰箱備用。在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離出目的蛋白，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（即 PVDF）膜上，之后用 5%的脫脂牛奶封閉洗脫2 h，將PVDF膜在4℃一抗孵育過(guò)夜，次日室溫下用TBST緩沖液洗滌3次。將PVDF 膜在二抗中孵育1 h，使用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒曝光，上機(jī)分析目的條帶的灰度值。其中NR1分子量為21 kDa，NR2B分子量為166 kDa，GluR1分子量為100 kDa，GAPDH分子量為36 kDa。

RT-PCR法：用Trizol裂解液提取各組細(xì)胞的總RNA，并將各組細(xì)胞 RNA終濃度調(diào)整為200 ng/μl。進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用反轉(zhuǎn)錄20 μl體系，加入4 μl 5×Reaction Buffer緩沖液，1 μl Oligo (dT)18Primer (50 uM),1 μl Servicebio?RT Enzyme Mix, 12 μl RNase free water, 2 μl mRNA，混勻后在PCR儀上25℃保溫300 s，42℃保溫1800 s，之后85℃保溫5 s終止反應(yīng)，得到合成的cDNA。在無(wú)酶 PCR 管內(nèi)加入5 μl 2×SYBR Green qPCR Master Mix, 0.2 μl Forward primer,0.2 μl Reverse primer, 2.6 μl Nuclease-Free Water, 2 μl cDNA。進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，預(yù)變性95℃ 30 s。95℃ 15 s轉(zhuǎn)60℃ 30 s 為1次循環(huán)，循環(huán)40次。熔解曲線為60℃～105℃。以GAPDH作為參照，檢測(cè)各組細(xì)胞基因以及內(nèi)參表達(dá)量，結(jié)果采用 2ΔΔCT法作定量分析。引物均由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司提供，引物序列見(jiàn)表1。

表1 目的基因及內(nèi)參基因(GAPDH)所用引物及序列Table 1 Primers and sequences of target gene and internal reference gene (GAPDH)

脊髓背角C纖維、Aδ纖維及Aβ纖維群峰電位的記錄和LTP的誘發(fā)：用鎢絲微電極電極阻抗插入脊髓表面，在脊髓背角II層（插入深度為20～100 μm的范圍內(nèi)）尋找C纖維誘發(fā)場(chǎng)電位信號(hào)，在脊髓背角Ⅰ層（插入深度為0～20 μm的范圍內(nèi)）尋找Aδ纖維誘發(fā)場(chǎng)電位信號(hào)，在脊髓背角III-IV層（插入深度為100～220 μm的范圍內(nèi)）尋找Aβ纖維誘發(fā)場(chǎng)電位信號(hào)，用波寬0.15 ms，頻率每5 min 1次的單脈沖波進(jìn)行刺激，強(qiáng)度為引起群峰電位最大反應(yīng)的60%左右時(shí)的刺激強(qiáng)度，在每層仔細(xì)尋找并記錄最明顯的脊髓背角C纖維、Aδ纖維及Aβ纖維誘發(fā)場(chǎng)電位信號(hào), 為群峰電位。待群峰電位穩(wěn)定10～15 min后，再行強(qiáng)直刺激，刺激參數(shù)為100 Hz、400個(gè)脈沖、60%最大刺激強(qiáng)度、波寬0.15 ms。給予強(qiáng)直刺激后群峰電位幅度增加20%，并持續(xù)30 min以上，即判定為長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)發(fā)生。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每 5 min觀察記錄1次，記錄時(shí)間為2 h。電位經(jīng)微電極放大器放大后，存入帶有HXD-2000處理軟件的計(jì)算機(jī)，再行分析處理。

4. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)表示，計(jì)量數(shù)據(jù)的組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。多組間計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析 (one-way ANOVA)，方差齊時(shí)以Tukey 法和 SNK-q法多重比較，方差不齊時(shí)用 Dunnett T3檢驗(yàn)。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 行為學(xué)觀察

（1）大鼠行為觀察：造模前各組大鼠精神狀態(tài)可，步態(tài)正常，足趾伸展、運(yùn)動(dòng)及協(xié)調(diào)承重均正常。

模型組及內(nèi)熱針組大鼠在造模后第1天精神狀態(tài)均較萎靡，活動(dòng)減少，足趾并攏卷曲，行走時(shí)有跛行傾向，左后肢拖地，重心偏右。在內(nèi)熱針治療完成后第4天對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠精神可，但活動(dòng)較對(duì)照組大鼠減少，足趾時(shí)有并攏卷曲，行走時(shí)稍有跛行傾向，左后肢無(wú)拖地，重心偏右。內(nèi)熱針組大鼠精神狀態(tài)尚可，步態(tài)、足趾伸展、運(yùn)動(dòng)及協(xié)調(diào)承重與對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯改變。

（2）MWT：與對(duì)照組相比，模型組大鼠在相應(yīng)各個(gè)時(shí)間的MWT均明顯降低(P＜ 0.01)，說(shuō)明在慢性軟組織疼痛模型造模成功后，大鼠MWT降低；內(nèi)熱針組的MWT在造模成功后的第14天較造模成功后的第1天明顯升高(P＜ 0.01)，較模型組明顯升高(P＜ 0.01)，與對(duì)照組第14天后相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明內(nèi)熱針治療能有效提高機(jī)械痛閾（見(jiàn)圖2）。

圖2 各組慢性軟組織疼痛大鼠MWT比較 (n = 15,±SEM)**P ＜ 0.01，與本組造模后第1天相比； ##P ＜ 0.01，與模型組造模后第14天相比；△△P ＜ 0.01，與對(duì)照組同一時(shí)間相比Fig. 2 Comparison of MWT of each group of rats with chronic soft tissue pain (n = 15,±SEM)**P ＜ 0.01, compared with the first day after modeling in this group; ##P ＜ 0.01, compared with the model group on the 14th day after modeling; △△P ＜ 0.01, compared with control group at the same time.

（3）TWL：與對(duì)照組相比，模型組大鼠在相應(yīng)各個(gè)時(shí)間的TWL均明顯降低(P＜ 0.01)，說(shuō)明在慢性軟組織疼痛模型造模成功后，大鼠的TWL降低；內(nèi)熱針組的TWL在造模成功后的第14天較造模成功后的第1天明顯升高(P＜ 0.01)，較模型組明顯升高(P＜ 0.01)，與對(duì)照組第14天后相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明內(nèi)熱針治療能有效提高熱痛閾（見(jiàn)圖3）。

圖3 各組慢性軟組織疼痛大鼠TWL比較 (n = 15,±SEM)**P ＜ 0.01，與本組造模后第1天相比； ##P ＜ 0.01，與模型組造模后第14天相比；△△P ＜ 0.01，與對(duì)照組同一時(shí)間相比Fig. 3 Comparison of TWL of each group of rats with chronic soft tissue pain (n = 15,±SEM)**P ＜ 0.01, compared with the first day after modeling in this group; ##P ＜ 0.01, compared with the model group on the 14th day after modeling; △△P ＜ 0.01, compared with control group at the same time.

2. Western Blot法觀察慢性軟組織疼痛大鼠L4-6脊髓節(jié)段iGluRs相關(guān)亞單位NR1、NR2B、GluR1蛋白的表達(dá)

各組大鼠L4-6脊髓節(jié)段iGluRs相關(guān)亞單位NR1、NR2B及GluR1蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)內(nèi)熱針組＜模型組，對(duì)照組與內(nèi)熱針組基本持平；與對(duì)照組相比，模型組NR1、NR2B及GluR1蛋白的表達(dá)明顯升高 (P＜ 0.01)；與模型組相比，內(nèi)熱針組NR1、NR2B及GluR1蛋白的表達(dá)明顯降低 (P＜ 0.01)；與對(duì)照組相比，內(nèi)熱針組NR1蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜ 0.01)，但內(nèi)熱針組NR2B及GluR1的蛋白表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異（見(jiàn)圖4）。

圖4 各組慢性軟組織疼痛大鼠L4-6脊髓節(jié)段NR1、NR2B及GluR1蛋白的表達(dá)(n = 5,±SEM)(A) WB檢測(cè)L4-6脊髓節(jié)段NR1、NR2B、GluR1蛋白表達(dá)的條帶圖，GAPDH為內(nèi)參條帶；(B) 脊髓節(jié)段NR1、NR2B及GluR1蛋白表達(dá)的組間比較**P ＜ 0.01，與對(duì)照組相比；##P ＜ 0.01，與模型組相比Fig. 4 The expression of NR1, NR2B, and GluR1 proteins in L4-6 spinal cord segment of rats with chronic soft tissue pain in each group (n = 5,±SEM)(A) Showing the band of NR1, NR2B, and GluR1 protein expression in spinal cord segment L4-6 detected by WB, with GAPDH as the internal reference; (B)Comparison of protein expressions of NR1, NR2B and GluR1 in spinal cord segments between groups.**P ＜ 0.01, compared with group control; ##P ＜ 0.01,compared with group model.

3. RT-PCR法觀察慢性軟組織疼痛大鼠L4-6脊髓節(jié)段iGluRs相關(guān)亞單位NR1、NR2B及GluR1m-RNA的表達(dá)

各組大鼠L4-6脊髓節(jié)段NR1、NR2B及GluR1 mRNA表達(dá)水平為對(duì)照組＜內(nèi)熱針組＜模型組；與對(duì)照組相比，模型組NR1、NR2B及GluR1 mRNA的表達(dá)明顯升高(P＜ 0.01)；與模型組相比，內(nèi)熱針組NR1、NR2B及GluR1 mRNA的表達(dá)明顯降低(P＜ 0.01)；與對(duì)照組相比，內(nèi)熱針組NR1及GluR1 mRNA的表達(dá)升高 (P＜ 0.05)，但內(nèi)熱針組NR2B mRNA的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異（見(jiàn)圖5）。

圖5 各組慢性軟組織疼痛大鼠L4-6脊髓節(jié)段NR1、NR2B及GluR1 mRNA的表達(dá)**P ＜ 0.01，與對(duì)照組相比；##P ＜ 0.01，與模型組相比Fig. 5 The expression of NR1, NR2B and GluR1 mRNA in L4-6 spinal cord segment of each group of rats with chronic soft tissue pain**P ＜ 0.01, compared with group control; ##P ＜ 0.01,compared with group model.

4. 脊髓背角神經(jīng)元突觸LTP情況

（1）脊髓背角C纖維LTP情況：以強(qiáng)直刺激脊髓背角各層的群峰電位幅度為100%計(jì)算，在對(duì)脊髓背角相關(guān)板層對(duì)C纖維誘發(fā)場(chǎng)電位信號(hào)，對(duì)照組未誘發(fā)出LTP效應(yīng)，其在30 min時(shí)為刺激前的73.3%±12.8%；在60 min時(shí)為刺激前的72.1%±10.9%；在2 h時(shí)為刺激前的76.0%±16.8%。模型組脊髓背角強(qiáng)直刺激后其群峰電位幅度顯著增高，在30 min時(shí)為刺激前的184.3%±22.1%，形成了長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)；在60 min時(shí)為刺激前的227.2%±58.9%；在2 h時(shí)為刺激前的169.9%±43.2%。內(nèi)熱針組未誘發(fā)出LTP效應(yīng)，在30 min時(shí)為刺激前的74.3%±15.7%；在60 min時(shí)為刺激前的77.7%±20.5%；在2 h時(shí)為刺激前的71.1%±18.8%。模型組在強(qiáng)直刺激30 min、60 min及2 h時(shí)的群峰電位幅度明顯高于對(duì)照組(P＜ 0.01)；內(nèi)熱針組在強(qiáng)直刺激30 min、60 min及2 h時(shí)的群峰電位幅度明顯低于模型組(P＜ 0.01)；與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖6）。

圖6 各組大鼠脊髓背角C纖維長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)情況**P ＜ 0.01，與對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)相比；##P ＜ 0.01，與模型組同一時(shí)間點(diǎn)相比Fig. 6 The LTP of C fibers in spinal dorsal horn of rats in each group**P ＜ 0.01, compared to the group control at the same time point; ##P ＜ 0.01, compared to the group model at the same time point.

（2）脊髓背角Aδ纖維LTP情況：以強(qiáng)直刺激脊髓背角各層的群峰電位幅度為100%計(jì)算，在對(duì)脊髓背角相關(guān)板層對(duì)Aδ纖維誘發(fā)場(chǎng)電位信號(hào)，對(duì)照組未誘發(fā)出LTP效應(yīng)，其在30 min時(shí)為刺激前的59.8%±17.3%；在60 min時(shí)為刺激前的64.4%±19.0%；在2 h時(shí)為刺激前的62.9%±17.9%。模型組脊髓背角強(qiáng)直刺激后其群峰電位幅度顯著增高，在30 min時(shí)為刺激前的141.0%±21.6%，形成了長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)；在60 min時(shí)為刺激前的178.3%±24.9%；在2 h時(shí)為刺激前的155.2%±20.1%。內(nèi)熱針組未誘發(fā)出LTP效應(yīng)，在30 min時(shí)為刺激前的64.4%±13.9%；在60 min時(shí)為刺激前的72.6%±15.7%；在2 h時(shí)為刺激前的70.1%±16.5%。模型組在強(qiáng)直刺激30 min、60 min及2 h時(shí)的群峰電位幅度明顯高于對(duì)照組(P＜ 0.01)；內(nèi)熱針組在強(qiáng)直刺激30 min、60 min及2 h時(shí)的群峰電位幅度明顯低于模型組(P＜ 0.01)；與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖7）。

圖7 各組大鼠脊髓背角Aδ纖維長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)情況**P ＜ 0.01，與對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)相比； ##P ＜ 0.01，與模型組同一時(shí)間點(diǎn)相比Fig. 7 The LTP of Aδ fibers in spinal dorsal horn of rats in each group**P ＜ 0.01, compared to the group control at the same time point；##P ＜ 0.01, compared to the group model at the same time point.

（3）脊髓背角Aβ纖維LTP情況：以強(qiáng)直刺激脊髓背角各層的群峰電位幅度為100%計(jì)算，在對(duì)脊髓背角相關(guān)板層對(duì)Aβ纖維誘發(fā)場(chǎng)電位信號(hào)，對(duì)照組未誘發(fā)出LTP效應(yīng)，其在30 min時(shí)為刺激前的67.3%±20.5%；在60 min時(shí)為刺激前的73.3%±16.8%；在2 h時(shí)為刺激前的72.9%±21.3%。模型組未誘發(fā)出LTP效應(yīng)，且在脊髓背角強(qiáng)直刺激后其群峰電位幅度有所降低，其在30 min時(shí)為刺激前的70.7%±18.8%；在60 min時(shí)為刺激前的45.6%±11.0%；在2 h時(shí)為刺激前的49.8%±13.7%。內(nèi)熱針組在30 min時(shí)為刺激前的166.4%±31.3%，形成了長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)；在60 min時(shí)為刺激前的209.7%±42.4%；在2 h時(shí)為刺激前的158.9%±34.1%。模型組在強(qiáng)直刺激30 min、60 min及2 h時(shí)的群峰電位幅度與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；內(nèi)熱針組在強(qiáng)直刺激30 min、60 min及2 h時(shí)的群峰電位幅度明顯高于模型組及對(duì)照組（P＜ 0.01，見(jiàn)圖8）。

圖8 各組大鼠脊髓背角Aβ纖維長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)情況**P ＜ 0.01，與模型組同一時(shí)間點(diǎn)相比；##P ＜ 0.01，與對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)相比Fig. 8 The LTP of Aβ fibers in spinal dorsal horn of rats in each group**P ＜ 0.01, compared to the group model at the same time point; ##P ＜ 0.01, compared to the group control at the same time point.

討 論

當(dāng)機(jī)體發(fā)生慢性軟組織疼痛時(shí)，軀體感覺(jué)通路被激活，除了外周炎性損傷，中樞系統(tǒng)也會(huì)發(fā)生一系列的復(fù)雜變化。其中中樞敏化是損傷后超敏感性疼痛的主要原因，也是慢性軟組織疼痛中痛覺(jué)過(guò)敏的主要病理基礎(chǔ)。中樞敏化是指脊髓背角傷害性突觸信息傳遞增強(qiáng)導(dǎo)致痛覺(jué)敏感[7]。外周傷害性感受器的傳入激發(fā)神經(jīng)元興奮性，釋放興奮性氨基酸、抑制性氨基酸和神經(jīng)肽類神經(jīng)遞質(zhì)，作用于脊髓神經(jīng)元突觸后受體，導(dǎo)致神經(jīng)元突觸后膜離子型谷氨酸受體 (iGluRs) 之NMDA 受體上調(diào)，而NMDA 受體的兩個(gè)亞基NR1/2在脊髓背角NR1/2基磷酸化對(duì)脊髓中樞敏化至關(guān)重要。NR1/2 亞基磷酸化導(dǎo)致NMDA 受體通道Ca2+電流明顯增加；鈣離子活動(dòng)增強(qiáng)進(jìn)一步引發(fā)蛋白激酶C (PKC) 活化，激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，使突觸后表達(dá)更多的NMDA和AMPA受體，它們的過(guò)度激活導(dǎo)致了C類纖維傳入末梢與脊髓背角傷害性神經(jīng)元聯(lián)結(jié)突觸的可塑性，從而形成一個(gè)谷氨酸和天冬氨酸神經(jīng)遞質(zhì)的正反饋回路，這種正反饋是神經(jīng)元突觸可塑性長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)LTP 形成的基礎(chǔ)。而LTP是中樞敏化產(chǎn)生的重要基礎(chǔ)[10～12]。

組織炎癥和神經(jīng)損傷等刺激使傷害性信息的初級(jí)整合中樞脊髓背角的神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其中包括外周傷害性傳入末梢在脊髓背角分布區(qū)域的變化[13]。正常生理情況下，外周Aβ類傳入纖維終止于脊髓背角第III-IV層，傳遞低閾值的感覺(jué)神經(jīng)信號(hào)（如觸覺(jué)、壓覺(jué)等）；Aδ纖維多終止于第I、III層傳遞快痛信息；而C類纖維傳入末梢則只終止在第II層即膠質(zhì)層，主要傳遞慢痛信息。在針刺鎮(zhèn)痛公認(rèn)的閘門學(xué)說(shuō)中認(rèn)為，在脊髓背角內(nèi)存在一種類似閘門的神經(jīng)機(jī)制，粗纖維 (Aβ) 和細(xì)纖維（Aδ和C）的相對(duì)活動(dòng)控制著痛覺(jué)信號(hào)的傳入。Duan 等[14]的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步充實(shí)了閘門學(xué)說(shuō)。脊髓背角膠質(zhì)中表達(dá)生長(zhǎng)抑素 (somatostatin, SOM) 的興奮性中間神經(jīng)元和強(qiáng)啡肽 (dynorphin, Dyn) 的抑制性中間神經(jīng)元，受來(lái)自軀體同一神經(jīng)節(jié)段的 C/Aδ纖維和 Aβ纖維的拮抗性支配，C/Aδ纖維的傳入激活 SOM+ 神經(jīng)元，開(kāi)放閘門，引起疼痛；Aβ纖維的傳入激活 Dyn+ 神經(jīng)元，抑制 SOM+ 神經(jīng)元的活性，閘門關(guān)閉從而阻斷疼痛傳入。針刺通過(guò)激活 Aβ 纖維，關(guān)閉閘門起到對(duì)同源疼痛的抑制作用。

內(nèi)熱針療法是一種新型治療慢性肌肉損傷的方法，其有效地將傳統(tǒng)的針刺治療和熱療結(jié)合在一起，通過(guò)現(xiàn)代電子技術(shù)和工藝材料技術(shù)的改造，使其具有內(nèi)部可加熱、溫度可控、熱能集中等特點(diǎn)，在腰椎間盤(pán)突出癥、腰椎管狹窄、頑固性腰腿疼痛、各型頸椎病、粘連性肩關(guān)節(jié)囊炎等慢性軟組織疼痛的治療中療效顯著，可以有效緩解各種慢性肌肉、軟組織疾病引起的痛覺(jué)過(guò)敏。研究顯示[15,16]，針刺的刺激或艾灸的熱能作用于穴位，通過(guò)分布于皮膚肌肉感覺(jué)神經(jīng)元末梢的機(jī)械或溫度感受器產(chǎn)生局部感受器電位并以電緊張的形式傳播，當(dāng)去極化達(dá)到閾電位水平，產(chǎn)生動(dòng)作電位并沿感覺(jué)神經(jīng)向中樞傳導(dǎo)。在兩個(gè)神經(jīng)元之間，又借助突觸結(jié)構(gòu)相聯(lián)系，根據(jù)信息傳遞媒質(zhì)的不同，分為電突觸或稱縫隙連接和化學(xué)性突觸。因此，電生理學(xué)方法和神經(jīng)化學(xué)方法是研究針灸原理的兩種重要的實(shí)驗(yàn)方法[17]。由于針灸效應(yīng)的發(fā)揮需要從外周到中樞各級(jí)神經(jīng)的參與，所以在體電生理學(xué)方法在針灸研究中又尤為重要[18]。而內(nèi)熱針來(lái)自于傳統(tǒng)針灸，又結(jié)合了針刺及艾灸的治療效應(yīng)，更需要采用體電生理學(xué)的方法來(lái)揭示其治療機(jī)制。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)熱針組能降低慢性軟組織疼痛大鼠L4-6脊髓節(jié)段離子型谷氨酸受體(iGluRs) 相關(guān)亞單位NR1、NR2B及GluR1蛋白及mRNA的表達(dá)；慢性軟組織疼痛模型大鼠能誘發(fā)脊髓背角C纖維、Aδ纖維的LTP；不能誘發(fā)脊髓背角Aβ纖維LTP，甚至出現(xiàn)一定的長(zhǎng)時(shí)程減弱。慢性軟組織疼痛模型大鼠破壞了中樞神經(jīng)系統(tǒng)原來(lái)的興奮-抑制動(dòng)態(tài)平衡，使神經(jīng)元興奮性和突觸可塑性處于異常的活動(dòng)增強(qiáng)或者減弱狀態(tài)，導(dǎo)致了脊髓中樞的敏化，開(kāi)放閘門，從而引發(fā)了疼痛。內(nèi)熱針治療可有效抑制慢性軟組織疼痛，可能與調(diào)節(jié)脊髓背角相關(guān)遞質(zhì)的表達(dá)，抑制脊髓背角C纖維、Aδ纖維的LTP，促進(jìn)Aβ纖維的LTP，產(chǎn)生中樞敏化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與Xu等[18]和Zhu等[19]的研究結(jié)果相符。該研究在痛源一側(cè)同神經(jīng)節(jié)段水平，A 類纖維的激活就能產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，蛇毒造成A纖維脫髓鞘損傷后，針刺鎮(zhèn)痛效應(yīng)顯著削弱。而在痛源對(duì)側(cè)或遠(yuǎn)離痛源部位針刺，只有激活C類纖維的的針刺強(qiáng)度才能明顯抑制傷害性肌電反應(yīng)，辣椒素阻斷C纖維或切斷高位頸髓造成脊髓化后該抑制效應(yīng)消失，提示針刺通過(guò)興奮外周不同直徑的傳入纖維，通過(guò)脊髓水平閘門控制或是觸發(fā)DNIC系統(tǒng)的不同機(jī)制產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)[19]。

本研究已初步通過(guò)電生理學(xué)方法和神經(jīng)化學(xué)方法兩種方法，推斷內(nèi)熱針的治療機(jī)制可能與其能調(diào)節(jié)L4-6脊髓節(jié)段相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)，抑制脊髓背角C纖維、Aδ纖維的LTP，促進(jìn)Aβ纖維的LTP，激活A(yù)β纖維，關(guān)閉閘門，抑制慢性軟組織疼痛有關(guān)。依據(jù)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是否可以推測(cè)內(nèi)熱針治療緩解慢性軟組織疼痛是通過(guò)L4-6脊髓節(jié)段iGluRs相關(guān)亞單位NR1、NR2B及GluR1等遞質(zhì)的介導(dǎo)，從而有效抑制脊髓背角C纖維、Aδ纖維的LTP，促進(jìn)其對(duì)Aβ纖維的LTP，激活A(yù)β纖維，有效調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮-抑制動(dòng)態(tài)平衡？理論上來(lái)說(shuō)，L4-6脊髓節(jié)段相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)與LTP的增強(qiáng)與減弱存在著相關(guān)性，但本研究尚不能確定其因果性，不能明確其間的傳導(dǎo)反應(yīng)過(guò)程，上下游轉(zhuǎn)錄因子、相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的正反饋回路等一系列信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，下一階段需進(jìn)一步基于脊髓中樞敏化系統(tǒng)，加入iGluRs抑制劑和激動(dòng)劑對(duì)照，以判斷iGluRs是否為介導(dǎo)脊髓背角相關(guān)纖維LTP的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，從背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角神經(jīng)遞質(zhì)的上下游關(guān)系方面更深入地探討其干預(yù)機(jī)制。