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      飼料中黃曲霉毒素檢測及其對牛奶品質(zhì)的影響

      2021-12-29 02:54:32魏姜勉
      中國飼料 2021年22期
      關(guān)鍵詞:黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)溶液毒素

      魏姜勉

      (黃淮學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,河南駐馬店 463000)

      牛奶營養(yǎng)成分豐富,包括豐富的蛋白質(zhì)、各類維生素和鈣質(zhì)等營養(yǎng)元素,在增強(qiáng)人體免疫力,治療人體動脈硬化、高血壓和骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要效用,為人體運動提供豐富的能量來源。隨著社會經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展,以及人們的生活改善,牛奶出現(xiàn)供不應(yīng)求的現(xiàn)狀,拓展了牛奶市場的發(fā)展空間(董順華,2020)。近年來,乳源性疾病在奶牛中不斷爆發(fā),人們對牛奶質(zhì)量格外重視,因此,牛奶安全問題已成為人們最為關(guān)注的焦點。研究發(fā)現(xiàn),少部分黃曲霉毒素在牛奶樣品中被檢測出來,而黃曲霉毒素是真菌代謝產(chǎn)生的二級代謝物,廣泛存在于飼料、谷物和食品中。近些年來,學(xué)者發(fā)現(xiàn),動物飼料中的霉菌毒素污染情況與牛奶質(zhì)量息息相關(guān)。奶牛一旦攝入的飼料中含有少量黃曲霉毒素,會給奶牛帶來營養(yǎng)不良、免疫力下降等問題,給乳制品帶來安全隱患(關(guān)一凡等,2019;白陽等,2019;王倩,2019;孫瑞濤等,2019)。

      黃曲霉毒素M1是奶牛飼料中攜帶的黃曲霉毒素B1被奶牛攝入體內(nèi)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物,黃曲霉毒素M1主要存在于奶牛的乳、肝、腎臟和血液中。牛奶中存在部分黃曲霉毒素M1,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,在乳制品生產(chǎn)和貯藏中含量不會發(fā)生明顯變化,不受消毒劑的影響(查滿千等,2019)。而牛奶和乳制品作為食品,對黃曲霉毒素的限量極為嚴(yán)格。目前,測定黃曲霉素毒素的方法有高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、質(zhì)譜法和放射免疫測定法,這些方法操作過程繁瑣、檢測周期長、靈敏度低,黃曲霉毒素M1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)較難獲取,結(jié)果精確度低(王麗和劉文嬌,2018)。因此,本研究采用免疫親和柱-熒光光度計法測定動物體內(nèi)黃曲霉毒素M1含量,更好地測定飼料和動物體內(nèi)的黃曲霉毒素含量;本研究檢測奶牛常規(guī)飼料(青綠飼料、粗飼料、能量飼料、蛋白飼料)的黃曲霉毒素含量,以便分析奶牛飼料污染情況,以及其對牛奶品質(zhì)的影響程度。

      1 材料與方法

      1.1 實驗材料 牛奶樣品,青綠飼料,粗飼料,能量飼料,蛋白飼料。

      1.2 實驗試劑 甲醇(純度高),氯化鈉(分析純),0.02%溴水儲備液,溴水使用液體,二水硫酸奎寧,硫酸溶液,黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液,三氯甲烷,無水硫酸鈉。

      1.3 實驗設(shè)備 熒光光度計,離心機(jī),試管,燒杯,分液漏斗,濾紙,粉碎破碎儀,渦旋離心機(jī),酶標(biāo)儀,電動振蕩儀器,普通和精密移液槍。

      1.4 黃曲霉素M1檢測方法 黃曲霉素M1檢測采用免疫親和柱-熒光光度法。

      1.4.1 牛奶樣品預(yù)處理 牛奶樣品加入一定量氯化鈉,用離心機(jī)離心牛奶樣品,對牛奶進(jìn)行脫脂處理,而后過濾。

      1.4.2 免疫親和柱洗脫 將免疫親和柱連接玻璃注射器中,調(diào)節(jié)液體流速清洗柱子,對混合液進(jìn)行洗脫純化。

      1.4.3 結(jié)果測定 在待測樣品中加入黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液,依據(jù)上述操作獲得分離純化的洗脫液,再加0.002%溴溶液,將標(biāo)準(zhǔn)樣品放入熒光光度計中測定黃曲霉毒素M1溶液的熒光強(qiáng)度,且繪制黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線,將待測溶液放入熒光光度計中黃曲霉毒素M1的熒光光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃曲霉毒素M1的含量。

      1.5 飼料中黃曲霉素B1檢測方法

      采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行測定。

      1.5.1 飼料樣品提取與加標(biāo) 將飼料樣品放入無菌燒杯中均勻混合,經(jīng)過濾后放入50 mL磨口試管中作為對照組提取液。將樣品提取液各自取4 mL放入試管中,再加入一定量的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液,使用渦旋機(jī)進(jìn)行渦旋,作為對照組的樣品提取液。

      1.5.2 樣品測定 在酶標(biāo)板上加入50 μL的黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)溶液,標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(0、0.5、2、9、15 ng/ mL),其余各孔中加入50 ul樣品提取液,再分別加入50 μL酶標(biāo)抗原溶液,放入37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h后,樣品中分別加入50 μL顯色劑,用酶標(biāo)儀(500nm)測定牛奶樣品各孔吸光度值。

      1.6 計算方法

      1.6.1 黃曲霉素M1計算方法 黃曲霉毒素M1計算公式如下:

      A=CV/M

      式中:A表示樣品中黃曲霉毒素M1含量,μg/kg;C表示樣品中黃曲霉毒素M1的濃度,ng/mL;V表示樣品的定容體積,mL;M表示樣品的質(zhì)量,g。

      1.6.2 黃曲霉毒素B1的計算方法 建立線性方程來計算黃曲霉毒素B1的含量:用黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值A(chǔ)與標(biāo)準(zhǔn)溶液A0的比值為線性方程的縱坐標(biāo),黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),從而建立線性方程。待測樣品的吸光度值除以標(biāo)準(zhǔn)溶液A0的吸光度值,將其放入線性方程求出標(biāo)準(zhǔn)溶液的橫坐標(biāo)值,用對數(shù)計算公式來計算標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,與稀釋倍數(shù)相乘即可得到黃曲霉毒素B1的含量,結(jié)果取平均值。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 黃曲霉毒素M1熒光光度計波長的測定 本研究使用熒光光度計檢測樣品中黃曲霉毒素M1的光譜信息,確定本實驗中黃曲霉毒素M1被激發(fā),最佳的熒光光度計發(fā)射波長為550nm。

      2.2 黃曲霉毒素M1的檢測方法精確度分析 本實驗根據(jù)實驗方法對黃曲霉毒素M1的含量進(jìn)行檢測,確定樣品實驗添加范圍為0.03 μg/L,這個數(shù)值范圍符合國際限量標(biāo)準(zhǔn);牛奶樣品中添加黃曲霉毒素M1的安全量為0.05 μg/L,根據(jù)上述實驗開展10次重復(fù)實驗,實驗結(jié)果顯示,樣品中黃曲霉毒素M1的平均值為0.046 μg/L,標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.0045,該實驗結(jié)果表明,黃曲霉毒素M1的檢測方法較為精確。

      2.3 牛奶樣品的回收率測定 本研究是以陰性樣品為對照組,在不同陰性牛奶樣品中添加不同濃度的黃曲霉毒素M1,每組實驗為5個平行,分析不同濃度梯度對牛奶樣品回收率的影響,由表2可知,不同濃度的黃曲霉毒素(0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 μg/kg)添加到牛奶樣品中,不同添加水平牛奶樣品的黃曲霉毒素M1的平均含量分別為 0.23、0.53、0.80、1.03 和 1.40 μg/kg;牛 奶 樣品中黃曲霉毒素M1的含量為0.3 μg/kg時,牛奶樣品的平均回收率最小,為76.67%;牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的含量為1.5 μg/kg時,牛奶樣品的平均回收率最大,為93.33%;隨著牛奶樣品中黃曲霉毒素M1添加量的增加,牛奶樣品中的變異系數(shù)先上升后下降,牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的含量為0.9 μg/kg時,牛奶樣品的變異系數(shù)最大,為2.8%;牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的含量為0.3 μg/kg時,牛奶樣品變異系數(shù)最低,為0.45%。

      表2 添加不同水平的黃曲霉毒素M1對牛奶樣品回收率的影響

      2.4 不同類型飼料原料樣品的黃曲霉毒素B1測定 本研究參照上述實驗方法,對不同類型飼料中黃曲霉毒素B1的含量進(jìn)行計算,結(jié)果如表3所示。由表3可知,青綠飼料、粗飼料、能量飼料和蛋白飼料等樣品的陽性樣品中黃曲霉毒素B1的測定率為100%,在青綠飼料樣品中黃曲霉毒素B1的最大值是 12.34 μg/kg,最小值是 2.56 μg/kg;粗飼料樣品中黃曲霉毒素B1的含量是11.68 μg/kg,最小值是1.24 μg/kg;能量飼料樣品中黃曲霉毒素B1的含量是9.86 μg/kg,最小值是0.68 μg/kg;蛋白飼料樣品中黃曲霉毒素B1的含量是9.36 μg/kg,最小值是 2.09 μg/kg。飼料污染程度參照黃曲霉毒素制定的國際標(biāo)準(zhǔn),如表1所示,而青綠飼料、粗飼料、能量飼料和蛋白飼料陽性樣品中黃曲霉毒素B1的平均含量分別為11.45、4.25、5.24 和 7.58 μg/kg,小于 20 μg/kg,均屬于為輕度污染。

      表1 黃曲霉毒素B1污染程度和標(biāo)準(zhǔn)

      表3 不同類型飼料中黃曲霉毒素B1的測定

      2.5 不同污染飼料飼喂奶牛后,牛奶樣品黃曲霉毒素M1的測定結(jié)果 由表4可知,被黃曲霉毒素B1污染的青綠飼料、粗飼料、能量飼料和蛋白飼料飼喂奶牛后,牛奶樣品中黃曲霉毒素M1陽性測定率分別為98.7%、95.6%、94.6%和93.4%;青綠飼料的牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的最大含量是 0.167 μg/kg,最小含量是 0.005 μg/kg;粗飼料的牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的最大含量是0.187 μg/kg,最小含量是0.009 g/kg;能量飼料的牛奶樣品中黃曲霉毒素M1最大含量是0.197 μg/kg,最小含量是0.004 μg/kg;蛋白飼料牛奶樣品中黃曲霉毒素M1最大含量是0.201 μg/kg,最小含量是0.008 μg/kg。不同飼料中牛奶樣品的黃曲霉毒素M1的平均值分別為0.057、0.084、0.068和0.073 μg/kg。在本研究中,不同類型飼料的牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的測定率不同,青綠飼料牛奶樣品中陽性樣品測定率最高,結(jié)果表明,奶制品中的霉菌毒素污染源頭主要為青綠飼料。目前,我國衛(wèi)生部對乳制品的黃曲霉毒素M1含量限制為0.05 μg/kg,而本研究中牛奶樣品陽性最高值為 0.201 μg/kg,最低值為 0.004 μg/kg,平均值最大為0.084 μg/kg,嚴(yán)重超過我國衛(wèi)生部門制定的標(biāo)準(zhǔn)。

      表4 不同類型飼料中牛奶的黃曲霉毒素M1的測定

      3 討論

      3.1 黃曲霉毒素M1測定方法的影響因素分析 本研究采用免疫親和柱-熒光光度法對不同類型飼料牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的含量進(jìn)行測定。樣品中黃曲霉毒素M1屬于一種免疫抗原,可在動物體內(nèi)形成一定量的抗體,該抗體用于免疫親和柱中,便于吸附黃曲霉毒素M1。免疫反應(yīng)的抗體具有單一識別抗原能力強(qiáng)和靈敏度高等特性,免疫親和柱的單克隆抗體可有效吸附牛奶樣品黃曲霉毒素M1,用離心機(jī)離心和濾膜過濾后,將會提高樣品中黃曲霉毒素M1的純度,從而提高黃曲霉毒素M1測量的精準(zhǔn)度。免疫親和柱被應(yīng)用于食品中霉菌的分離和凈化,且柱內(nèi)單克隆抗體專一識別樣品中黃曲霉毒素M1,兩者進(jìn)行高度結(jié)合,避免其他外來物質(zhì)的干擾,可高度特異地識別外來牛奶樣品的霉菌毒素,具有溶劑使用量少,再生利用等特點(王新紅,2018)。

      本研究采用熒光光度法檢測牛奶樣品中黃曲霉毒素M1含量,精準(zhǔn)含量為0.0001 μg/kg,且牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的添加水平為0.3~1.5 μg/kg,牛奶的回收率范圍76.67%~93.33%,變異系數(shù)為0.45%~2.8%,滿足我國制定的檢測標(biāo)準(zhǔn)。熒光光度法中樣品檢測速率極快,操作便捷、準(zhǔn)確、高效和安全,且儀器設(shè)備小,便于攜帶,度數(shù)穩(wěn)定,結(jié)果靈敏度高。熒光光度法一種高效檢測樣品霉菌毒素含量的方法,為樣品中霉菌毒素含量的檢測提供理論基礎(chǔ)。

      3.2 飼料中黃曲霉毒素對牛奶品質(zhì)影響的分析 黃曲霉毒素是一類真菌代謝產(chǎn)生的毒素,對動物生長發(fā)育和肝臟產(chǎn)生重大損害(劉康和張佩華,2018)。畜禽類動物食用黃曲霉毒素污染的飼料后會引起動物中毒,給畜牧業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。董順華(2020)等研究發(fā)現(xiàn),飼料中出現(xiàn)霉菌毒素污染會對奶牛器官、產(chǎn)奶量及牛奶安全和品質(zhì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。而黃曲霉毒素是動物飼料中的霉菌種類之一,但牛奶品質(zhì)也會受動物年齡、飼料含量及外部環(huán)境等因素影響。查滿千等(2019)研究發(fā)現(xiàn),奶牛投喂0.04 μg/kg的黃曲霉毒素會降低生產(chǎn)性能和免疫機(jī)能,當(dāng)飼料沒有黃曲霉毒素時,奶牛生產(chǎn)性能較好,產(chǎn)奶量增加35%;劉康(2018)等研究發(fā)現(xiàn),飼料中添加少量的黃曲霉毒素會降低奶牛的產(chǎn)奶性能。本研究發(fā)現(xiàn),奶牛攝入飼料中的黃曲霉毒素B1,經(jīng)體內(nèi)發(fā)生羥基化形成M1形式。

      飼料是奶牛賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ),為牛奶提供充足的營養(yǎng),奶牛良好的生產(chǎn)性能取決于良好的飼料配方,牛奶品質(zhì)與奶牛產(chǎn)能息息相關(guān)。營養(yǎng)豐富的飼料是奶牛生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛奶的物質(zhì)基礎(chǔ)(白陽等,2019;孫瑞濤等,2019)。建立高效安全的飼料產(chǎn)業(yè)是安全牛奶的重要保障。奶牛飼料在加工過程中要及時處理污染飼料,加強(qiáng)對飼料質(zhì)量的監(jiān)督和管理;飼料利用生物脫毒方法,安全高效地去掉飼料中的霉菌毒素;及時管理飼料霉變,及時處理霉變飼料;在飼料投喂環(huán)節(jié),及時處理殘存飼料,降低飼料污染率,提高奶牛飼料的安全性,發(fā)展健康、安全、優(yōu)質(zhì)的飼料,進(jìn)而提高牛奶質(zhì)量(王倩,2019)。

      本研究中發(fā)現(xiàn)飼料中黃曲霉毒素B1屬于輕度污染,而牛奶中黃曲霉毒素M1嚴(yán)重超過國家衛(wèi)生部門制定的標(biāo)準(zhǔn)。霉菌污染是影響畜牧飼料業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素,也會對牛奶品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響。奶牛飼養(yǎng)過程中,黃曲霉毒素對奶產(chǎn)品的影響程度較大,面對奶產(chǎn)品的需求量不斷擴(kuò)大,因此,應(yīng)加強(qiáng)飼料管理,及時檢測飼料污染物情況和預(yù)防霉菌污染,減少飼料中黃曲霉毒素的含量,保障奶牛健康和牛奶品質(zhì)。

      4 結(jié)論

      黃曲霉毒素是飼料中常見的污染毒素之一,嚴(yán)重影響奶牛的健康和牛奶品質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn),可采用免疫親和柱-熒光光度法檢測黃曲霉毒素M1含量,該方法簡單、高效、安全和靈敏度高,檢測速度快,滿足牛奶樣品的檢測需求。本研究對奶牛飼料中青綠飼料、粗飼料、能量飼料和蛋白飼料中的黃曲霉毒素B1及牛奶樣品中的黃曲霉毒素M1的含量進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)飼料樣品屬于輕度污染,而牛奶樣品嚴(yán)重超過國家相關(guān)部門制定的標(biāo)準(zhǔn),污染程度較大;飼料中黃曲霉毒素B1經(jīng)奶牛攝食后形成牛奶中的黃曲霉毒素M1。為了保證人體健康,飼料生產(chǎn)過程中應(yīng)注意控制霉菌毒素的產(chǎn)生,加強(qiáng)飼料的安全品質(zhì)管理,提高牛奶質(zhì)量。

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