基因編輯研究進(jìn)展與展望

譚 磊，陳明月，沈 彬

南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211166

CRISPR?Cas系統(tǒng)是細(xì)菌、古細(xì)菌對(duì)抗病毒進(jìn)化出來(lái)的免疫機(jī)制，2012 年，首次將CRISPR?Cas9 系統(tǒng)成功應(yīng)用于大腸桿菌基因組編輯［1］，隨后這一系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用到哺乳動(dòng)物和人類(lèi)細(xì)胞中［2］，從此基因編輯進(jìn)入了新時(shí)代。目前已知的絕大部分疾病是由堿基突變導(dǎo)致的，為了構(gòu)建疾病模型或者修復(fù)致病突變，基于CRISPR?Cas9 系統(tǒng)的堿基編輯器應(yīng)運(yùn)而生，可以實(shí)現(xiàn)A·T 到G·C 和C·G 到T·A 的突變，最近出現(xiàn)的先導(dǎo)編輯器（Prime editors）可實(shí)現(xiàn)12種單堿基的任意替換、短片段的刪除和插入［3］。雖然CRISPR?Cas9 技術(shù)日趨完善，但將其廣泛應(yīng)用于臨床基因治療還存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，其在特異性、安全性和在體轉(zhuǎn)導(dǎo)方面仍有待提升。

1 CRISPR?Cas9系統(tǒng)的特異性

野生型SpCas9 存在嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)［4］，為了降低這一系統(tǒng)的脫靶活性，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化。利用Cas9切口酶和雙sgRNA［5］，或者利用失活Cas9融合Fok1和雙sgRNA 都可以顯著降低脫靶［6］。對(duì)sgRNA 的改造也可用來(lái)增加特異性，比如截短sgRNA（Truncated sgRNA）［7］和發(fā)卡sgRNA（haripin?sgRNA）［8］等。基于Cas9 蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化可以在降低脫靶效應(yīng)同時(shí)保持較高的編輯活性。Slay?maker 等［9］通過(guò)丙氨酸掃描技術(shù)，開(kāi)發(fā)了eSpCas9（1.1），這種Cas9 變體降低了Cas9 與非互補(bǔ)鏈DNA的親和力。利用類(lèi)似的原理，Kleinstiver 等［10］開(kāi)發(fā)了高保真突變體SpCas9?HF1。Chen 等［11］利用eSp?Cas9（1.1）和SpCas9?HF1 在與非靶向序列結(jié)合時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)換成非活躍狀態(tài)的機(jī)制對(duì)野生型Cas9 進(jìn)行氨基酸突變，獲得了兼具高切割活性和低脫靶活性的HypaCas9。Casini 等［12］在酵母上對(duì)Rec3 結(jié)構(gòu)域突變的SpCas9 文庫(kù)進(jìn)行篩選，鑒定出了四重突變體evoCas9，盡管這一突變體特異性很高，但也極大地降低了編輯活性。Lee 等［13］利用大腸桿菌篩選出Sniper?Cas9，在降低脫靶活性的同時(shí)，也能保持與野生型SpCas9相當(dāng)?shù)木庉嫽钚浴?/p>

相對(duì)于野生型SpCas9 的編輯活性，絕大部分Cas9 高保真突變體的基因編輯活性均下降，雖然Sniper?Cas9 保持了和野生型Cas9 相當(dāng)?shù)幕蚓庉嫽钚?，但是特異性比其他突變體低［14］。因此，開(kāi)發(fā)高活性和高特異性的突變體Cas9勢(shì)在必行。

2 基因編輯技術(shù)的安全性

基因編輯技術(shù)的深入研究和廣泛應(yīng)用暴露了其出乎意料的安全性問(wèn)題，如Cas9介導(dǎo)DNA雙鏈斷裂（double?strand breakage，DSB）會(huì)導(dǎo)致DNA 大片段缺失和染色體易位［15］，Cas9 的表達(dá)會(huì)激活P53通路［16］，Cas9在臨床應(yīng)用中存在潛在的抗原抗體反應(yīng)等［17］。堿基編輯器、先導(dǎo)編輯器、Cas9 活性的精準(zhǔn)調(diào)控等在一定程度上可以解決安全性問(wèn)題。

2.1 堿基編輯器

DSB 的產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)是非常嚴(yán)重的事件，基于Cas9開(kāi)發(fā)的堿基編輯器既避免了DSB的產(chǎn)生，又實(shí)現(xiàn)了高效編輯。目前已開(kāi)發(fā)出兩類(lèi)堿基編輯器：胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）［18］和腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE）［19］。CBE使用胞嘧啶脫氨酶催化胞嘧啶（C）脫氨基產(chǎn)生尿嘧啶（U），在DNA修復(fù)和復(fù)制過(guò)程中，U被聚合酶識(shí)別為胸腺嘧啶（T），誘導(dǎo)C 到T 的突變；ABE 使用細(xì)菌中人工進(jìn)化而來(lái)的腺苷脫氨酶（TadA）催化腺嘌呤（A）轉(zhuǎn)換成肌苷（I），在復(fù)制和修復(fù)的過(guò)程中DNA聚合酶將I識(shí)別為G，引入A到G的突變。

最初的CBE 版本BE3 具有序列偏好性和較高的脫靶活性，在目標(biāo)位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)一定比例的錯(cuò)誤突變（C 突變成A 或G）。BE4 在BE3 基礎(chǔ)上將尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白（uracil glycosylase inhibitor pro?tein，UGI）增加到兩個(gè)，提高了編輯效率，降低了脫靶活性［20］。Thuronyi等［21］利用噬菌體輔助進(jìn)化技術(shù)開(kāi)發(fā)的evoAPOBEC1?BE4max，可以提高CBE 在GC序列上的編輯效率。當(dāng)目標(biāo)位點(diǎn)附近存在多個(gè)C時(shí)會(huì)出現(xiàn)旁觀者脫靶現(xiàn)象，設(shè)計(jì)編輯窗口更窄［22-23］或序列依賴［24］的脫氨酶可以有效降低這種旁觀者脫靶活性。雖然堿基編輯器不會(huì)產(chǎn)生DSB，但堿基切除修復(fù)發(fā)生時(shí)仍會(huì)有插入/缺失副產(chǎn)物，BE4融合一種噬菌體來(lái)源的斷裂末端保護(hù)蛋白Mu Gam可以有效減少CBE 介導(dǎo)的插入/缺失［20］。通過(guò)優(yōu)化脫氨酶TadA與nCas9切口酶（D10A）之間的連接序列，可以得到編輯效率更高的ABEmax［25］。Richter等［26］通過(guò)噬菌體輔助進(jìn)化進(jìn)一步優(yōu)化了TadA，得到的ABE8e版本極大地提高了A·T到G·C的編輯效率，但也造成了較為嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)。

由于堿基編輯器使用的脫氨酶會(huì)與單鏈DNA和RNA結(jié)合，尤其是CBE，會(huì)在單鏈DNA和RNA上產(chǎn)生高頻率的脫靶［27-28］。為了減少堿基編輯器的脫靶，Zhou等［29］通過(guò)破壞脫氨酶與RNA的結(jié)合能力開(kāi)發(fā)了3 個(gè)CBE 變異體和1 個(gè)ABE 變異體，極大地提高了堿基編輯器的保真性。

2.2 先導(dǎo)編輯器

Auzalone等［3］開(kāi)發(fā)的先導(dǎo)編輯器，可以精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)12種點(diǎn)突變和小片段的插入/刪除。先導(dǎo)編輯器包括nCas9切口酶（H840A）和逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域，以及3′端攜帶目標(biāo)突變的逆轉(zhuǎn)錄模板和負(fù)責(zé)起始轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)（primer binding site，PBS）的pe?gRNA。在pegRNA 引導(dǎo)下，nCas9 切割并釋放非互補(bǔ)鏈，釋放的非互補(bǔ)鏈與pegRNA 3′端PBS 序列互補(bǔ)配對(duì)后，逆轉(zhuǎn)錄酶以pegRNA 3′端攜帶的模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，新合成的DNA 通過(guò)DNA 修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變或小片段的插入/刪除。與傳統(tǒng)同源重組方法相比，先導(dǎo)編輯器具有更高的編輯效率和更好的靶向靈活性。

2.3 CRISPR/Cas9活性的精確調(diào)控

2.3.1 抗CRISPR蛋白

隨著天然拮抗劑anti?CRISPR（Acr）蛋白的發(fā)現(xiàn)，科學(xué)家開(kāi)始選擇這些蛋白用于控制Cas9蛋白的活性［30］。Acr 蛋白干擾CRISPR?Cas9 系統(tǒng)的方式主要是與sgRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Cas9蛋白，或者直接抑制Cas9 核酸酶活性。已闡明Ⅱ型Acr 蛋白與Cas9 的直接相互作用［31-32］，限制了其與DNA 結(jié)合，或阻止了HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域的激活［33］。由于Acr 蛋白具有嚴(yán)格的開(kāi)關(guān)控制作用，因此可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Cas 核酸酶的精準(zhǔn)調(diào)控，例如在CRISPR 系統(tǒng)發(fā)揮作用之后轉(zhuǎn)入AcrⅡA4可有效減少脫靶編輯［34］。

2.3.2 光調(diào)控

通過(guò)光激活的方式也可以對(duì)Cas9活性進(jìn)行精確調(diào)控。光調(diào)控是非入侵性的，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Cas9核酸酶活性的可逆控制。Hemphill等［35］使用光鎖定賴氨酸，設(shè)計(jì)出了一種光控Cas9，通過(guò)在細(xì)胞中添加進(jìn)化產(chǎn)生的吡咯酰tRNA（PylT）/tRNA合成酶（PCKRS）［36］，可以使光鎖定賴氨酸特異性地?fù)饺隒as9 中。這種光控的Cas9 核酸酶在365 nm 光照射120 s 后，其活性可以恢復(fù)到野生型水平。Nihongaki 等［37］報(bào)道了一種光激活Cas9（paCas9），利用一種光誘導(dǎo)二聚化蛋白［38］，將Cas9的兩個(gè)片段分別連接磁性蛋白的正負(fù)極，在藍(lán)光照射下，異源二聚體相互配對(duì)，重組的pa?Cas9與野生型Cas9活性沒(méi)有顯著差異。

此外，Zhang 等［39］報(bào)道了一種通過(guò)光控crRNA來(lái)調(diào)控CRISPR?Cas9 活性的方法，這一策略將維生素E 與5′不耐光連接子偶聯(lián)合成了一種新的crRNA，維生素E 修飾會(huì)抑制Cas9?crRNA/tracrRNA與DNA的結(jié)合，在365 nm紫外光照射下，維生素E和不耐光接頭被去除，恢復(fù)CRISPR?Cas9系統(tǒng)的功能。

2.3.3 小分子抑制劑

Choudhary 實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)了一種高通量篩選平臺(tái)［40］，鑒定出一種小分子SpCas9 抑制劑BRD0539，對(duì)這種抑制劑進(jìn)行優(yōu)化后可以將SpCas9 的活性降低78%。BRD0593調(diào)控Cas9的活性是可逆的，并且對(duì)蛋白酶有抵抗力，可在人血漿中穩(wěn)定存在，其對(duì)CRISPR?Cas9 進(jìn)行精準(zhǔn)地時(shí)空調(diào)控，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.4 P53效應(yīng)與免疫原性

CRISPR?Cas9的細(xì)胞毒性在不同細(xì)胞系中有所不同，這種毒性與細(xì)胞中P53 蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路相關(guān)。在對(duì)人細(xì)胞系轉(zhuǎn)染Cas9后，攜帶野生型TP53 基因的細(xì)胞系表現(xiàn)出更高的細(xì)胞周期停滯水平［41］。Enache 等［16］發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)癌細(xì)胞系中引入Cas9 會(huì)導(dǎo)致p53 通路的上調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Ihry等［42］在對(duì)人類(lèi)多能干細(xì)胞進(jìn)行編輯時(shí)，Cas9誘導(dǎo)的雙鏈斷裂會(huì)讓大多數(shù)細(xì)胞死亡，這種細(xì)胞毒性主要依賴于TP53 激活，所以大大降低了攜帶野生型TP53細(xì)胞的基因編輯效率，也就意味著如果使用經(jīng)過(guò)篩選的編輯細(xì)胞用于細(xì)胞治療，這些細(xì)胞TP53突變或者低表達(dá)，可能會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。因此在利用基因編輯細(xì)胞進(jìn)行治療時(shí)，監(jiān)測(cè)TP53的狀態(tài)尤為重要。除了引起P53效應(yīng)，Charlesworth 等［43］對(duì)人類(lèi)血清進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，34例捐贈(zèng)者中至少一半人的血清中含有SaCas9 和SpCas9 抗體，因此Cas9的免疫原性也增加了臨床使用的風(fēng)險(xiǎn)。另外，體外合成的gRNA也會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)［44］，對(duì)gRNA進(jìn)行修飾可以增加穩(wěn)定性，抑制免疫反應(yīng)［45］。

雖然在Cas9的安全性方面已經(jīng)做了諸多改進(jìn)，但一些未知及潛在的安全性問(wèn)題仍是Cas9 編輯技術(shù)走向臨床應(yīng)用的障礙，因此開(kāi)發(fā)易調(diào)控Cas9 突變體、抑制TP53 激活的Cas9 突變體、低免疫原性Cas9 突變體等可以為基因治療提供更安全、更有效的工具。

3 基因編輯器的在體轉(zhuǎn)導(dǎo)

高效的基因編輯取決于將編輯器有效地傳遞到體內(nèi)細(xì)胞和組織中，在體轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)基因編輯來(lái)說(shuō)是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。目前大多數(shù)研究使用腺相關(guān)病毒（Adeno associated virus，AAV）和慢病毒進(jìn)行在體轉(zhuǎn)導(dǎo)基因編輯，存在以下問(wèn)題：①病毒載體的容量有限；②持續(xù)性的表達(dá)會(huì)造成脫靶效應(yīng)；③遞送載體本身會(huì)引發(fā)獨(dú)特的免疫反應(yīng)；④潛在的致癌性。

AAV 載體可以攜帶約4.4 kb 的外源DNA，具有多種血清型，對(duì)不同組織具有不同的親和性［46-47］。使用分子量更小的SaCas9 或?qū)pCas9/堿基編輯器分成兩部分，再通過(guò)內(nèi)含子蛋白剪接系統(tǒng)重組克服了運(yùn)載能力的限制［48-49］。當(dāng)然，從自然界中或者通過(guò)蛋白工程，尋找或者開(kāi)發(fā)更小版本的Cas 蛋白是解決AAV 運(yùn)載限制更好的選擇［50］。AAV 的另一個(gè)缺點(diǎn)是對(duì)天然血清型存在先天性體液免疫反應(yīng)，這很大程度上限制了其應(yīng)用［51］，通過(guò)對(duì)AAV的衣殼進(jìn)行改造可以減輕這一影響［52］。

慢病毒載體可以容納長(zhǎng)達(dá)10 kb的外源DNA［53］，并將其半隨機(jī)整合到基因組中。慢病毒可以與不同包膜蛋白進(jìn)行組裝，以靶向不同的細(xì)胞類(lèi)型［54］。與AAV不同的是，慢病毒攜帶的基因會(huì)整合到細(xì)胞基因組中，由此產(chǎn)生的核酸酶長(zhǎng)期表達(dá)對(duì)細(xì)胞不利。整合酶缺陷慢病毒載體具有瞬時(shí)表達(dá)和更弱的整合能力，可以解決這一問(wèn)題［55］。最近，有研究開(kāi)發(fā)了一種類(lèi)病毒載體，可以直接包裝Cas9 mRNA，使其不會(huì)整合到靶細(xì)胞的基因組中，可以在小鼠組織中轉(zhuǎn)導(dǎo)和瞬時(shí)表達(dá)核酸酶［56］。

由于病毒載體存在一些難以避免的缺陷，目前也開(kāi)發(fā)了一些非病毒傳遞載體［57］?；蚓庉嬈鞯姆遣《据d體傳遞效率低于病毒載體，但是它提供了瞬時(shí)核酸酶活性的優(yōu)勢(shì)。更重要的是，非病毒載體，如脂質(zhì)納米顆粒、電穿孔技術(shù)等可以重復(fù)多次給藥［58］，這也為基因疾病治療提供了更多的可能。

雖然研究者對(duì)基因編輯工具的在體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式進(jìn)行了優(yōu)化，但在轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、安全性、靶向性、致癌性等方面還存在諸多問(wèn)題，亟待開(kāi)發(fā)安全、高效的在體轉(zhuǎn)導(dǎo)工具和小版本的Cas 蛋白，以盡快打通基因編輯技術(shù)走向臨床治療的“最后一公里”。

4 總結(jié)與展望

從CRISPR?Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在發(fā)展出了多種精準(zhǔn)且多功能的基因編輯工具，在不到8 年的時(shí)間里，基因編輯技術(shù)的發(fā)展為新一代人類(lèi)基因療法奠定了基礎(chǔ)。盡管基因編輯工具仍存在脫靶和安全風(fēng)險(xiǎn)，但其強(qiáng)大的功能和廣泛的適用性，仍然是精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展方向。隨著基因編輯工具的不斷發(fā)展，以及在體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式的改進(jìn)，將極大地促進(jìn)基因編輯技術(shù)走向臨床應(yīng)用。目前，盡管利用CRIS?PR系統(tǒng)進(jìn)行基因治療已經(jīng)有很大突破，但將這一方法廣泛運(yùn)用到臨床治療中還有一段距離，仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。相信不遠(yuǎn)的未來(lái)會(huì)開(kāi)發(fā)出更加安全高效的編輯工具和在體轉(zhuǎn)導(dǎo)體系，用于臨床疾病的治療。