CPT1A基因外顯子純合缺失變異導致的肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A缺乏癥1例

張志華，王 蘭，周霄穎，鄭必霞，林 謙*

1南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院消化科，2兒科學重點實驗室，江蘇 南京 210029

肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（carnitine palmitoyltrans?ferase 1A，CPT1A）缺乏癥（OMIM#255120）是一種長鏈脂肪酸氧化障礙的常染色體隱性遺傳疾病，由CPT1A 基因（OMIM#600528）變異導致。CPT1A 是長鏈脂肪酸進入線粒體進行β氧化的限速酶。當CPT1A缺乏癥患者長期禁食或處于病理狀態(tài)時，糖原貯備不足，肝臟線粒體脂肪酸β氧化提供能量被抑制，出現(xiàn)低血糖、肝性腦病等多系統(tǒng)癥狀［1］。該疾病罕見，到目前為止，人類基因組突變數(shù)據(jù)庫（Human Genome Mutation Database，HGMD）僅收錄了41種突變（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=CPT1A），多為點突變，本文首次報道了中國人群中1例外顯子4～5純合缺失的變異類型，豐富了該基因變異譜，并結(jié)合qPCR進行了驗證。

1 病例資料

患兒，男，2歲10個月。因“肝功能異常3周”入院?；純? 周前因“低血糖暈厥”于當?shù)蒯t(yī)院治療，查丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）173.0 U/L，予美能、谷胱甘肽保肝治療3周，復查肝功能，ALT 250 U/L，遂來就診。入院查體：肝臟右肋下3 cm，質(zhì)中。余查體無異常。父母體健，否認家族史。入院診斷：肝功能損害。

基因測序：采集患兒及其父母靜脈血3 mL（EDTA 抗凝）送至北京全譜醫(yī)學檢驗實驗室，進行全外顯子組測序，外周血標本DNA 抽提前，患兒監(jiān)護人填寫知情同意書，本研究獲南京兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。本實驗將正常對照樣本與先證者及父母樣本進行同組熒光定量PCR檢測，以ALB基因為內(nèi)參基因，對目標基因CPT1A 的4～5 外顯子的拷貝數(shù)進行相對定量檢測（用熒光定量PCR法）。計算公式為2-ΔΔCt。qPCR所用引物序列見表1。

表1 CPT1A基因外顯子4～5 qPCR擴增引物設(shè)計

入院后輔助檢查結(jié)果：ALT 206 U/L，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）154 U/L，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）348 U/L，血糖4.11 mmol/L；凝血功能無異常；血氨、銅藍蛋白、噬肝病毒、傳染病4項無異常。彩超示肝臟右肋下38 mm，肝臟形態(tài)增大，腹部CT 示肝臟實質(zhì)密度彌漫性減低。肝組織光鏡病理：肝細胞腫脹、胞質(zhì)空亮，廣泛脂肪變性，匯管區(qū)纖維組織中度增生伴少量淋巴細胞浸潤（圖1）；肝組織電鏡病理：肝細胞胞質(zhì)內(nèi)可見大量脂滴沉積，細胞質(zhì)內(nèi)線粒體增多，線粒體局灶可見腫脹及空泡變性等改變，糖原顆粒輕度增多。遺傳代謝血液篩查示游離肉堿（C0）顯著升高，多種?；鈮A（C16、C18）降低，C0/（C16+C18）為2 609.78（正常值2.50～54.00）。以上檢查結(jié)果高度提示患兒為遺傳代謝性疾病，進一步采用全外顯子組測序進行基因檢測以明確診斷。

圖1 先證者肝臟穿刺活檢組織光鏡病理

基因診斷：全外顯子組測序結(jié)果提示患兒CPT1A基因外顯子4～5純合缺失，患兒父親、母親為該突變雜合攜帶者。CPT1A基因的純合或復合雜合型突變可以導致CPT1A缺乏癥。進一步采用qPCR的方法驗證該患兒CPT1A基因外顯子4～5純合缺失變異。

將正常對照樣本與先證者及父母樣本進行同組qPCR檢測，以ALB基因為內(nèi)參基因，對目標基因CPT1A 4～5外顯子的拷貝數(shù)進行檢測。由圖2結(jié)果可見，先證者CPT1A 基因4～5 外顯子的拷貝數(shù)與正常對照的比值約為0，提示先證者CPT1A 基因4～5外顯子存在純合缺失，先證者父母CPT1A 基因4～5外顯子的拷貝數(shù)與正常對照的比值約為0.5，提示先證者父母CPT1A 基因4～5 外顯子存在雜合缺失。qPCR檢測結(jié)果與全外顯子組測序結(jié)果一致。

圖2 CPT1A基因外顯子4～5純合缺失突變qPCR驗證結(jié)果

2 討論

CPT1A 缺乏癥是一種常染色體隱性遺傳代謝性疾病，屬于長鏈脂肪酸氧化代謝紊亂類疾病，由11q13染色體上的CPT1A基因上的純合或復合雜合型突變所致。該疾病由Bougnères 等［2］于1981 年首次報道，具有種族特異性，在阿拉斯加、加拿大、格陵蘭島和西伯利亞東北地區(qū)發(fā)病率較高［3-5］，其他地區(qū)較罕見，目前中國人群的患病率未知。

CPT1A 缺陷患者臨床表現(xiàn)差異較大，在正常生理情況下沒有明顯的臨床表現(xiàn)，當糖原儲備顯著減少時，出現(xiàn)低血糖、嘔吐、腹瀉、抽搐、肝腫大、肝性腦病等典型的臨床特征［6］，一些個體可出現(xiàn)腎小管性酸中毒表型［7-8］。也有個案報道以黃疸為首發(fā)癥狀［9］。心臟或骨骼肌受累并不常見［1］。實驗室檢查可顯示低酮型低血糖、肝酶升高、高血氨等，實驗室診斷的重要依據(jù)是脂酰肉堿的合成顯著減少，C0水平升高。本例患兒2 歲10 個月時因低血糖暈厥起病，肝功能持續(xù)異常，肝臟腫大，C0/（C16+C18）約為正常上限值的50倍，肝細胞胞質(zhì)內(nèi)存在大量脂滴沉積，線粒體增多且線粒體局灶可見腫脹及空泡變性等改變，臨床表現(xiàn)及實驗室檢查支持CPT1A 缺乏癥，我們采用全外顯子組測序進行基因檢測以進一步明確了診斷。

CPT1A缺乏癥的致病基因CPT1A位于11q13染色體上，包含20 個外顯子，編碼大小為773 個氨基酸殘基的CPT1A［10-11］。目前HGMD數(shù)據(jù)庫中收錄了41種CPT1A基因突變，多為錯義突變、無義突變、剪切突變及插入缺失突變，以點突變?yōu)橹?。全外顯子檢測顯示本例患兒CPT1A基因4～5外顯子存在純合缺失，父母為該雜合突變攜帶者，qPCR 結(jié)果與基因測序結(jié)果一致。在正常人群數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)該變異，未見相關(guān)文獻報道。CPT1A 基因的4～5 外顯子連續(xù)缺失屬于基因水平中型變異，造成開放閱讀框大片段缺失，從而影響蛋白功能，結(jié)合該患兒的臨床表現(xiàn)，CPT1A基因外顯子缺失變異是本例患兒發(fā)病的分子機制。

CPT1A 缺乏癥患者出現(xiàn)急性低血糖癥時，應盡快提供足量10%葡萄糖注射液以糾正低血糖，并防止脂肪分解和隨后脂肪酸向線粒體的動員。血糖濃度正常后應繼續(xù)葡萄糖輸注，為糖原合成提供足夠底物。CPT1A 缺乏癥患者在應激狀態(tài)下存在神經(jīng)系統(tǒng)損傷、肝功能衰竭、癲癇發(fā)作、昏迷及猝死風險，預防急性發(fā)病可明顯改善預后。CPT1A缺乏癥患者應經(jīng)常進食，嬰兒夜間可予玉米淀粉喂養(yǎng)提供緩慢釋放碳水化合物的恒定來源，以防睡眠期低血糖癥；因為中鏈脂肪酸不需CPT1A協(xié)助即可進入線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)化為能量，應采用高碳水化合物、減少長鏈脂肪酸攝入、增加中鏈甘油三酯的飲食結(jié)構(gòu)［1］。本例患兒在采取合理飲食結(jié)構(gòu)后，肝轉(zhuǎn)氨酶較前下降，未再出現(xiàn)低血糖等臨床表現(xiàn)。

預防CPT1A缺乏癥急性發(fā)作、及時采取干預措施可明顯改善患者預后，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合基因檢測有助于早期診斷。本例患者是國內(nèi)首例外顯子4～5 純合缺失的CPT1A 缺乏癥患者，豐富了該基因變異譜。近年來全外顯子測序技術(shù)臨床應用進展很快，可以檢出外顯子缺失和重復的中型變異，結(jié)合qPCR 或者多重連接探針擴增技術(shù)驗證，可以為這類變異的患兒提供精準的分子診斷。