液液萃取-HPLC法檢測(cè)人參皂苷Rg3的研究

楊文志，杜躍中，高宇，馬雙欣，宋瑩瑩

（吉林人參研究院·吉林通化·134001）

在現(xiàn)有的人參質(zhì)量評(píng)價(jià)中,人參皂苷Rg3未列入檢測(cè)項(xiàng)目,但隨著對(duì)人參藥材認(rèn)識(shí)的深入,Rg3重要性和特殊性顯示了出來(lái),Rg3不僅是人參中的一種重要的有效成分,同時(shí)也體現(xiàn)出不同人參品種的差別。

人參皂苷Rg3具有抗疲勞、舒張血管、提高免疫力、抗腫瘤作用,是一種功能活性較強(qiáng)的人參皂苷,在天然人參中含量極微,而在加工品種紅參中其含量顯著增加。據(jù)報(bào)道[1-3],野山參和紅參都含有Rg3成分,人參莖葉也發(fā)現(xiàn)含有Rg3。對(duì)于園參是否含有Rg3,野山參和紅參Rg3的含量范圍,本研究在建立了人參中Rg3檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上,分別對(duì)不同產(chǎn)地、5個(gè)批次的野山參、紅參及園參進(jìn)行了Rg3檢測(cè),以證實(shí)和確定野山參、紅參及園參的Rg3含量及其特點(diǎn)。

1 材料、試劑與儀器設(shè)備

1.1 材料

野山參,紅參及園參各5個(gè)樣品,其中野山參參齡在15年以上,樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 野山參、紅參及園參的樣本來(lái)源

1.2 試劑

乙腈（色譜純）、甲醇、乙酸乙酯、吡啶為分析純；人參皂苷對(duì)照品產(chǎn)自吉林人參研究院植化研究室,純度分別是Rg3(S)（93.04%）、Rg3(R)（98.86%）。

1.3 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀Agilent 1260(美國(guó))；色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(Made in USA)；4.6×250mm；旋轉(zhuǎn)薄層蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；250mL玻璃回流裝置（國(guó)產(chǎn)）。

2 供試樣品的制備

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg3(S)、Rg3(R),加甲醇溶解,制成每1mL各含1mg的溶液,作為對(duì)照品母液。分別取對(duì)照品母液再混合定容,制成標(biāo)準(zhǔn)曲線使用的對(duì)照品溶液,濃度范圍0.2～0.04 mg.mL-1。Rg3(R)在甲醇中溶解困難,需要加一點(diǎn)吡啶。

2.2 供試品溶液的制備

分別精密稱取人參樣品2.0g,用甲醇吡啶（4：1）50mL浸泡過(guò)夜,次日回流提取1次（1h）,提取液過(guò)濾,濾渣用適量甲醇洗1次,與前液合并；將溶液回收,殘?jiān)盟芙夂?用乙酸乙酯萃取,共6次,將乙酸乙酯萃取液合并,回收試劑,殘?jiān)眉状级ㄈ萦?mL的容量瓶中,制成供試樣品,上樣前,進(jìn)行微孔濾膜(0.45μm)過(guò)濾。

3 檢測(cè)方法及方法驗(yàn)證

3.1 HPLC色譜條件及測(cè)定方法

儀器檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm；柱溫30℃；流速：1mL/min；以乙腈為流動(dòng)相A,水為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫。

時(shí)間（分鐘）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）0～152575 15～4525→4075→60 45～504060 50～8040→6260→38

測(cè)試：分別吸取對(duì)照品溶液與供試品過(guò)濾溶液,注入液相色譜儀中,定量環(huán)上樣,記錄色譜保留時(shí)間與峰面積。

3.2 線性關(guān)系的考察

將對(duì)照品溶液分別進(jìn)行HPLC色譜分析,每個(gè)濃度供試品平行測(cè)定3次,共5個(gè)濃度梯度,計(jì)算每個(gè)濃度下峰面積的平均值,以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸分析,計(jì)算回歸方程。

3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

將對(duì)照品Rg3(S)及Rg3(R)連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)得各次峰面積,計(jì)算峰面積的RSD。

3.4 供試品制備參數(shù)的研究

3.4.1 取樣量范圍試驗(yàn)

分別梯度稱取野山參2.0、1.5、1.0及0.5g,共4個(gè)樣品,用甲醇吡啶（4：1）50mL分別浸泡過(guò)夜,按供試品溶液制備方法制成供試品,測(cè)試Rg3含量,計(jì)算±RSD。

3.4.2 提取次數(shù)

精密稱取野山參2g,共6個(gè)平行樣,分別標(biāo)號(hào)為1#、2#、3#、4#、5#、6#。各樣品用50mL甲醇吡啶（4：1）浸泡過(guò)夜,次日回流提取,每次1h,提取液過(guò)濾,然后再加入新的提取試劑重復(fù)提??；1#用甲醇吡啶提1遍,2#重復(fù)提2遍；以此類推,6#重復(fù)提6遍,每個(gè)樣品過(guò)濾后,最后的濾渣用適量甲醇吡啶洗一次,與之前過(guò)濾液合并,然后,旋蒸回收提取溶劑,剩余旋蒸不易回收的溶劑用甲醇轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中,放于水浴上揮干,殘?jiān)謩e用20mL水溶解,乙酸乙酯15mL萃取6次；水浴上揮干乙酸乙酯,用2mL甲醇定容成供試品,測(cè)試Rg3的含量,計(jì)算±RSD。

3.4.3 萃取次數(shù)

精密稱取野山參樣品2g,共6個(gè)平行樣,分別標(biāo)號(hào)為1#、2#、3#、4#、5#、6#,按提取1次的方法操作,提取后的各樣品分別用20mL水溶解,用乙酸乙酯15mL萃??；1#萃取1次；2#萃取2次；依此類推,6#萃取6次,將每個(gè)樣品的乙酸乙酯萃取液合并,在水浴上揮干乙酸乙酯,用2mL色譜甲醇定容成供試品,測(cè)試Rg3的含量,計(jì)算±RSD。

3.5 回收率實(shí)驗(yàn)

將已知含量的野山參樣品精密加入Rg3(S)標(biāo)準(zhǔn)溶液,共6個(gè)平行加標(biāo)樣品,測(cè)試Rg3含量,計(jì)算回收率。

3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取野山參樣品2g,5個(gè)平行樣,按供試品溶液制備方法制成供試品,測(cè)試Rg3的含量,計(jì)算RSD。

3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將野山參供試品分別在0～30h時(shí)間段中,不同時(shí)間點(diǎn)間隔取樣測(cè)試Rg3,計(jì)5次,計(jì)算保留時(shí)間及峰面積的RSD。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

供試野山參樣品只檢測(cè)出S型Rg3,而R型Rg3未檢出。

4.1 Rg3線性關(guān)系及最低檢測(cè)限

以對(duì)照品峰面積的平均值與其濃度分別作Y（mAU）軸和X（濃度C：mg.mL-1）軸,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程如下。

Rg3（S）:Y=8526.616 C+31.682（r=0.9975,n=5）；

Rg3（R）：Y=7815.414 C+10.483（r=0.9989,n=5）。

注n為供試品數(shù)量。

結(jié)果表明,上述各Rg3皂苷質(zhì)量在4～0.8μg區(qū)間與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)照品Rg3(S)及Rg3(R)連續(xù)進(jìn)樣6次,其Rg3(S)峰面積的RSD為1.21%,Rg3(R)峰面積的RSD為1.12%。

4.3 取樣量范圍

不同取樣量測(cè)試的結(jié)果見(jiàn)表2,結(jié)果表明,野山參取樣量范圍在0.5～2g之間,Rg3(S)含量的RSD為3.80%,其結(jié)果基本一致,產(chǎn)生的差異可以認(rèn)為是隨機(jī)誤差,因此取樣范圍定為0.5～2g之間。

表2 野山參Rg3(S)差異取樣量的測(cè)定結(jié)果

4.4 提取次數(shù)

野山參提取1～6次的Rg3(S)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明提取1～6次測(cè)定結(jié)果的RSD為5.01%,其結(jié)果基本一致,存在偶然誤差,但在可接受范圍內(nèi),而從節(jié)約角度選擇,將提取次數(shù)定為1次。

表3 野山參不同提取次數(shù)Rg3(S)的測(cè)定結(jié)果

4.5 萃取次數(shù)

野山參萃取1～6次的Rg3(S)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明萃取1～6次測(cè)定結(jié)果的RSD為12.3%,說(shuō)明萃取次數(shù)對(duì)結(jié)果影響較大；而萃取5次和萃取6次的偏差（0.56%）最小,可認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)誤差,說(shuō)明體系中Rg3已被充分萃取出來(lái),為減少萃取對(duì)結(jié)果的影響,將萃取次數(shù)確定為6次。

表4 野山參不同萃取次數(shù)Rg3(S)的測(cè)定結(jié)果

4.6 準(zhǔn)確度

回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。野山參檢測(cè)Rg3(S)的加標(biāo)回收率是99.06%,說(shuō)明方法有一定的準(zhǔn)確度。

表5 Rg3（S）回收率測(cè)試結(jié)果

4.7 重復(fù)性

樣品重復(fù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6。Rg3(S)含量的RSD為3.70%,表明方法具有良好的重復(fù)性。

表6 野山參重復(fù)檢測(cè)Rg3(S)的測(cè)定結(jié)果

4.8 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。野山參供試樣品在0～30h時(shí)間范圍內(nèi),Rg3(S)保留時(shí)間的RSD為0.33%,其峰面積的RSD為0.84%,表明樣品在這個(gè)時(shí)間范圍測(cè)試,數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

表7 野山參Rg3(S)穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

5 不同人參品種Rg3 的檢測(cè)結(jié)果

不同人參品種Rg3的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表8及圖1。

表8 野山參、紅參及園參不同產(chǎn)地樣品Rg3檢測(cè)結(jié)果

圖1 野山參、紅參及園參Rg3色譜圖

結(jié)果顯示,野山參檢出Rg3(S),其平均含量是0.029%,含量較分散,而Rg3(R)未檢出。紅參檢出Rg3(S)及Rg3(R),其平均含量分別是0.097%及0.008%,含量較分散。圓參的Rg3(S)及Rg3(R)均未檢出。

野山參與紅參Rg3(S)的數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗(yàn)分析,紅參的Rg3(S)含量極顯著高于野山參,t=4.493**。

6 討論

6.1利用該方法做了人參皂苷Rh2的測(cè)試實(shí)驗(yàn),對(duì)照品Rh2與響應(yīng)信號(hào)具有良好的線性關(guān)系,線性回歸方程分別是,Rh2（S）：Y（峰面積）=9905.265×X（mg/mL）-61.007;r=0.9962；Rh2（R）：Y（峰面積）=11942.148×X（mg/mL）-46.132;r=0.9955,但是在人參中卻未檢出Rh2,是方法存在問(wèn)題,還是野山參、紅參及園參中Rh2含量極低檢不出來(lái),或不含有,這有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。Rg3與Rh2對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖2。6.2本實(shí)驗(yàn)取樣量為2g,目的是增大取樣量以觀察Rh2的檢測(cè)情況。按照本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果是,野山參和紅參均未檢出Rh2；由最低檢出限推算,它們Rh2的含量應(yīng)低于百萬(wàn)分之二,或者樣品中就沒(méi)有Rh2。6.3本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇吡啶（4：1）,甲醇及80%甲醇溶液提取野山參Rg3的效果,三種試劑均能提取出Rg3(S),其含量分別為0.053%、0.054%及0.058%,以80%甲醇溶液提取測(cè)得的含量較高,三者含量的RSD為4.81%,結(jié)果相近；但甲醇和80%甲醇溶液提取得到的供試品色譜圖,其在Rh2附近的色譜峰分離不好,不易辨識(shí),因此實(shí)驗(yàn)選擇了甲醇吡啶（4：1）作為提取劑。詳見(jiàn)圖3。

圖2 Rg3及Rh2與甲醇空白的HPLC色譜圖

圖3 甲醇吡啶、甲醇及80%甲醇提取物色譜圖比較