柴胡莖葉總黃酮生物活性研究

叢登立，孟憲蘭，李鵬飛

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春130021；2.通化盛吉信生物科技股份有限公司，通化134008；3.修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，通化134008）

柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,稱之為地熏、茈胡,《本草綱目》載“治陽氣下陷,平肝、膽、三焦,包絡(luò)相火以及頭痛、眩暈、目昏諸瘧及婦人熱入血室、經(jīng)水不調(diào)、小兒痘疹余熱、五疳羸熱”等。柴胡作為傳統(tǒng)中藥材具有疏散退熱,疏肝解郁,升舉陽氣作用。臨床常用于感冒發(fā)熱,寒熱往來,胸脅脹痛,月經(jīng)不調(diào),子宮脫垂,脫肛等病癥[1]。藥典2020版規(guī)定柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzoneri-folium Willd.的干燥根。近代對柴胡根研究較多,柴胡根中主要有效成分是柴胡皂苷[2],具有抗炎、保肝、對心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)起作用等多種生物學(xué)活性[2],具有抗腫瘤作用,其對多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有抑制作用[3,4,5,6]。一直以來,柴胡根用于入藥,地上部分莖葉棄之不用,造成柴胡地上部分資源大量浪費(fèi),近年不斷有實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)柴胡地上部分莖、葉含有黃酮類等多種有效成分,具有解熱鎮(zhèn)痛、對心血管系統(tǒng)具有一定治療作用[4,6]。本文對柴胡地上部分莖葉總黃酮提取方法及莖葉總黃酮生物活性進(jìn)行抗疲勞作用研究,為挖掘柴胡的藥用部位,更好地開發(fā)利用柴胡這一傳統(tǒng)中藥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥材柴胡地上部分莖和葉(柴胡采自吉林省榆樹市大坡鎮(zhèn)柴胡種植基地,經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)胡廣權(quán)教授鑒定為北柴胡),自然晾干。

1.1.2 實(shí)驗動物

健康昆明種小鼠,6～8周齡,體質(zhì)量20.0～22.0g,由吉林大學(xué)實(shí)驗動物中心提供,動物合格證號：醫(yī)動字第（吉）2020-0001。

1.1.3 試劑

肝糖原、肌糖原、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase,LDH）、血乳酸（blood lactic acid,LAC）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；無水乙醇（AR）購自成都科隆化學(xué)品有限公司。

1.1.4 主要儀器

紫外可見分光光度計(日本日立HITACHI U-1900)；Eppendorf高速離心機(jī)(contrifuge5810R)；EL204萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；RE-52A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SIB-III型循環(huán)式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 柴胡莖葉總黃酮提取

采用正交實(shí)驗對提取條件（溶劑濃度、浸泡時間、料液比、提取時間）進(jìn)行優(yōu)化,以柴胡莖葉總黃酮提取率和浸膏得率為指標(biāo)確定柴胡莖葉總黃酮提取方法。

稱取柴胡地上部分粗粉2.00g,置入1000mL燒瓶,并加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液200mL,室溫浸泡過夜,然后電熱套加熱回流60min,冷卻后減壓過濾,濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃以下減壓蒸干稱重得117mg,柴胡莖葉總黃酮提取率5.85%。同法制備柴胡莖葉總黃酮水溶液1.0g·mL-1備用。

1.2.2 實(shí)驗動物分組與用藥健康昆明種小鼠,雌雄各半隨機(jī)分為5組,每組10只：陰性對照組（蒸餾水）、陽性對照組（復(fù)方高山紅景天口服液）和3個不同劑量柴胡莖葉總黃酮水溶液組即低劑量組（濃度為0.25g·mL-1）；中劑量組（濃度為0.5g·mL-1）和高劑量組（濃度為1.0g·mL-1）。小鼠分籠飼養(yǎng),標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)室適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后,3個給藥組按規(guī)定劑量每天分別灌胃。陽性對照組每天用復(fù)方高山紅景天口服液灌胃,每次灌胃量按小鼠體質(zhì)量以0.02g·mL-1灌胃,陰性對照組每天灌胃同量蒸餾水。實(shí)驗周期為4周。

1.2.3 運(yùn)動小鼠肝糖原和肌糖原含量活力測定

各組最后1次給藥后20min,將小鼠尾部負(fù)荷2g的鉛塊,放入25.0℃±0.5℃的水中游泳60min,出水休息20min后,眼眶取血,肝素抗凝,立即脫頸椎處死。取肝臟和肌肉樣本各100mg,用生理鹽水2mL漂洗后濾紙吸干,按標(biāo)本質(zhì)量（mg）：堿液體積（μL）=1：3（即肝臟、肌肉10mg與300μL堿水）加入試管中,每管勻漿3～5min,勻漿液以3000r·min-1離心10min,上清液置沸水浴煮20min,流水冷卻,加入蒸餾水定溶。按試劑盒要求加入試劑?；靹蚝笾梅兴兄?min,冷卻后于620nm波長,測定各管吸光度（A）值。

1.2.4 運(yùn)動小鼠LDH活力及LAC、BUN含量測定

最后1次給藥20min后,將小鼠尾部負(fù)荷2g的鉛塊,放入25.0℃±0.5℃的水中游泳60min,出水后休息20min,眼眶取血1次。所得血液樣品加入0.3mL蛋白沉淀劑和肝素抗凝后輕輕顛倒混勻,靜置10min后,以3000r·min-1離心8min,分離血清。分別采用LAC、BUN、LDH相關(guān)試劑盒并按要求測定。

1.2.5 運(yùn)動耐力測定

各組在最后1次給藥30min后,將小鼠放入水深30cm、水溫25.0℃±0.5℃的水中游泳,鼠尾部負(fù)荷2g的鉛塊,記錄小鼠自游泳開始至力竭死亡的時間（小鼠自游泳開始至沉入水中10 s不能浮出水面,且放在平面時無法完成翻正反射的連續(xù)游泳時間）。

1.2.6 運(yùn)動小鼠SOD活力測定

各組在最后1次給藥30min后,將小鼠尾部負(fù)荷2g的鉛塊,放入25.0℃±0.5℃的水中游泳60min,出水后休息30min立即脫頸椎處死。取肝組織約200mg在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,試紙拭干,稱質(zhì)量,放入盛有組織塊質(zhì)量9倍的預(yù)冷的生理鹽水玻璃杯內(nèi)。盡快剪碎組織塊,并倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿。將制備好的10%勻漿用低溫離心機(jī)3500r·min-1離心10min。采用SOD試劑盒測定。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果分析

2.1 柴胡莖葉總黃酮提取條件優(yōu)化結(jié)果

柴胡莖葉總黃酮提取溶劑濃度為50%、提取前浸泡過夜、溶劑用量為藥材的10倍、最優(yōu)的提取時間為60min,柴胡地上部分總黃酮提取率及浸膏得率為最佳條件選擇指標(biāo)。

2.2 柴胡莖葉總黃酮對運(yùn)動小鼠肝糖原、肌糖原、LDH、LAC、BUN和SOD的影響

與陰性和陽性對照組比較,柴胡莖葉總黃酮提取物三個劑量組明顯提高運(yùn)動后小鼠肝糖原、肌糖原水平和運(yùn)動小鼠LDH活力,降低LAC及BUN含量水平（P＜0.01）。柴胡莖葉總黃酮三個劑量組明顯提高運(yùn)動小鼠SOD活力（P＜0.05）。詳見表1。

表1 柴胡莖葉總黃酮提取物對小鼠游泳后肝糖原、肌糖原、LDH、LAC、BUN和SOD的影響Table 1 Effect of Bupleurum stalk and leaf total flavonoids extract on liver glycogen,muscle glycogen,LDH,LAC,BUN and SOD after swimming in mice（n=10,±s）

表1 柴胡莖葉總黃酮提取物對小鼠游泳后肝糖原、肌糖原、LDH、LAC、BUN和SOD的影響Table 1 Effect of Bupleurum stalk and leaf total flavonoids extract on liver glycogen,muscle glycogen,LDH,LAC,BUN and SOD after swimming in mice（n=10,±s）

*P＜0.05,**P＜0.01 compared with negative control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with positive control group.

GroupHepatic glycogen（WB/mg·g-1）LAC（cB/mmol·L-1）Negative control 13.22±0.103.36±0.052957±4376.81±0.26 Positive control25.66±0.296.57±0.934289±4835.99±0.12 Low dose34.35±0.27＊8.19±0.19＊4877±415＊4.92±0.15 Middle dose36.72±0.16＊△8.51±0.16＊4981±462＊＊△4.83±0.14 High dose42.89±0.21＊＊△8.95±0.12＊△△5116±512＊＊△4.79±0.12＊△Muscle glycogen（WB/mg·g-1）LDH（λB/U·L-1）BUN（cB/mmol·L-1）9.13±1.98 8.79±1.46 6.82±0.89＊7.66±1.50 7.25±1.78 SOD（λB/U·mg-1）363.66±27.63 370.17±33.87 453.96±36.11＊477.67±34.95＊△498.36±35.89＊△

2.3 柴胡莖葉總黃酮對小鼠運(yùn)動耐力的影響

與陰性和陽性對照組比較,柴胡莖葉總黃酮提取物三個劑量組小鼠負(fù)重游泳時間明顯延長（P＜0.01）,表明柴胡莖葉總黃酮具有提高小鼠耐力作用。詳見表2。

表2 柴胡莖葉總黃酮提取物對小鼠負(fù)重游泳時間的影響Table 2 Effect of Bupleurum stalk and leaf total flavonoids extract on swimming time of mice（n=10,±s t/min）

表2 柴胡莖葉總黃酮提取物對小鼠負(fù)重游泳時間的影響Table 2 Effect of Bupleurum stalk and leaf total flavonoids extract on swimming time of mice（n=10,±s t/min）

*P＜0.05,**P＜0.01 compared with negative control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with positive control group.

GroupLoaded swimming time Negative control96.67±1.07 Positive control115.46±1.15 Low dose129.25±1.19＊△Middle dose133.66±0.93＊△High dose137.49±1.02＊＊△△

3 討論

通過對比分析后確定柴胡莖葉提取所用溶劑和提取方法。柴胡莖葉總黃酮提取過程中對提取前浸泡時間、料液比和提取時間采用正交方法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計,這幾個因子對柴胡地上部分總黃酮提取率及浸膏得率均有影響,但料液比和提取時間對其提取率和浸膏得率的影響較大。

運(yùn)動小鼠給予柴胡莖葉總黃酮提取物三個劑量后均能使肝糖原、肌糖原、LDH、LAC、BUN和SOD含量發(fā)生變化,并延長小鼠負(fù)重游泳時間。在負(fù)重游泳實(shí)驗中,與陰性和陽性對照組比較,柴胡莖葉總黃酮提取物的3個劑量組都能提高運(yùn)動小鼠運(yùn)動耐力。肝糖原的作用是輸出葡萄糖來補(bǔ)充血糖的消耗,保持血糖的正常水平。血糖作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基本燃料,是長時間骨骼肌可動用的必需燃料。糖是肌肉活動時能量的重要來源[7,8]。本研究表明柴胡莖葉總黃酮提取物具有抗疲勞作用,其作用機(jī)制可能是柴胡莖葉總黃酮提取物中某些成分促進(jìn)了脂肪向糖的轉(zhuǎn)化、不斷補(bǔ)充運(yùn)動后血糖的消耗,增加糖元的儲備、維持血糖的正常水平從而保護(hù)肌細(xì)胞膜完整性,保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)、運(yùn)動肌等組織的糖供給,延緩運(yùn)動性疲勞的產(chǎn)生[9,10]。