LINC02532調(diào)控miR-194-3p/HMGB1分子軸對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

王樹民，張 朔

（青海省第五人民醫(yī)院燒傷整形科，西寧 810000）

瘢痕疙瘩繼發(fā)于皮膚損傷，是以成纖維細(xì)胞異常增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成分過(guò)度沉積為特征的良性皮膚腫瘤，伴有瘙癢、疼痛，不隨時(shí)間自發(fā)消退。局部類固醇激素治療、冷凍治療、放射治療、激光治療、手術(shù)切除等治療效果均不佳[1]。近年來(lái)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）被認(rèn)為是腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移過(guò)程的重要調(diào)控因素，其通過(guò)與miRNA特異結(jié)合間接調(diào)控靶mRNA表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展[2-3]。LINC02532是一種胃癌致癌性lncRNA，其上調(diào)與高臨床分期、低分化相關(guān)，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞惡性表型[4]。目前LINC02532 在瘢痕疙瘩進(jìn)展中的作用尚未闡明。研究證實(shí)，瘢痕疙瘩中miR-194-3p 表達(dá)較低，miR-194-3p 過(guò)表達(dá)抑制人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（HKF）增殖和遷移[5-7]。高遷移率族蛋白1（HMGB1）是一種與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白，人瘢痕疙瘩組織HMGB1 中高表達(dá)，可誘導(dǎo)人真皮成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠原合成[8]。DIANA Tool 軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-194-3p 與LINC02532、HMGB1 存在結(jié)合位點(diǎn)，于是推測(cè)LINC02532 可能調(diào)控miR-194-3p 和HMGB1在瘢痕疙瘩進(jìn)展中發(fā)揮作用。本研究通過(guò)檢測(cè)瘢痕疙瘩組織中LINC02532、miR-194-3p 表達(dá)，分析干擾LINC02532表達(dá)、過(guò)表達(dá)miR-194-3p對(duì)HKF增殖和凋亡的影響，驗(yàn)證LINC02532、miR-194-3p和HMGB1 之間的關(guān)系，為瘢痕疙瘩的治療提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本采集 收集2016 年1 月至2017 年1月青海省第五人民醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織（研究組）23例，其中男9例，女14例；年齡16～53歲，平均（36.3±6.8）歲；耳垂5例，腹部7例，肩部6 例，上臂5 例。同期收集正常皮膚組織（正常組）23例，為我科住院手術(shù)患者供皮區(qū)皮膚，其中男9 例，女14 例，平均（35.4±7.3）歲。本研究已取得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞和試劑 HKF（上海雅吉生物科技公司）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青—鏈霉素雙抗（美國(guó)Gibco 公司）；PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（大連takara生物公司）；SYBR?Green Supermix預(yù)混液（上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；miR-194-3p 模擬物（mimics）及其對(duì)照（miR-NC）、miR-194-3p抑制劑（anti-miR-194-3p）及其對(duì)照（anti-miR-NC）、LINC02532 小干擾RNA（si-LINC02532）及其對(duì)照（si-NC）（上海生工生物工程公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）（福州飛凈生物科技）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin v-FITC）凋亡檢測(cè)試劑盒（北京百奧萊博生物公司）；兔抗人HMGB1 多克隆抗體、兔抗人GAPDH 單克隆抗體、羊抗兔IgG二抗、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物公司）。

1.3 RT-qPCR 檢測(cè)LINC02532 和miR-194-3p 瘢痕疙瘩組織中表達(dá) 采用總RNA快速分離試劑盒提取研究組、正常組標(biāo)本的總RNA。以PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用SYBR?Green Supermix 在ABI 7500 型熒光定量PCR 儀上進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃3 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。LINC02532 引物（上游5’-TCCTGGTGCCACTGAGACTGTG-3’；下 游5’-AGCCTCCATGATTCCTGCCTCTAG-3’），GAPDH（上游5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3’，下游5’-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3’），miR-194-3p（上游5’-GCCAGTGGGGCTGCTGT-3’，下游5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’），U6（上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下 游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’）。LINC02532（內(nèi)參為GAPDH）和miR-194-3p（內(nèi)參為U6）表達(dá)量以2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HKF用含89%DMEM+10%胎牛血清+1%青—鏈霉素雙抗的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d換液一次，收集第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HKF進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照2×105個(gè)/孔的密度在6孔板鋪板，細(xì)胞60%融合后嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000 說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-LINC02532組（轉(zhuǎn)染si-LINC02532）、miR-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-194-3p 組（轉(zhuǎn)染miR-194-3p mimics）、si-LINC02532+anti-miR-NC組（轉(zhuǎn)染si-LINC02532和anti-miR-NC）、si-LINC02532+anti-miR-194-3p（轉(zhuǎn) 染si-LINC02532 和anti-miR-194-3p）組。收獲轉(zhuǎn)染48 h 細(xì)胞，RT-qPCR 檢測(cè)LINC02532和miR-194-3p表達(dá)水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.5 CCK-8法和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

CCK-8 法：將轉(zhuǎn)染48 h 的HKF 接種于96 孔板，培養(yǎng)48 h 后，按照10 μL/孔加入CCK-8 溶液，在37 ℃下與細(xì)胞相互作用2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞在450 nm處的吸光度（OD）值以表示細(xì)胞活力。

集落形成實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染48 h 的HKF 按照1×103個(gè)/孔的密度接種于6孔板，加入2 mL培養(yǎng)基使細(xì)胞分散均勻。置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育直到出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞集落。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。顯微鏡下統(tǒng)計(jì)大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將轉(zhuǎn)染48 h 的HKF 重懸于1×結(jié)合緩沖液中，調(diào)整為1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液。按照Annexin v-FITC試劑盒步驟對(duì)HKF 細(xì)胞進(jìn)行暗室染色。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blotting法檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá)

RIPA 裂解法從各組HKF 中提取蛋白，SDSPAGE 電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。膜封閉后，分別使用兔抗人HMGB1 多克隆抗體（1∶800 稀釋）、兔抗人GAPDH 單克隆抗體（1∶500稀釋）4 ℃孵育24 h，再用羊抗兔IgG 二抗（1∶1 000稀釋）37 ℃孵育2 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影定影，以Quantity One 軟件分析結(jié)果，以HMGB1 蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH 灰度值的比值表示HMGB1蛋白表達(dá)量。

1.8 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將含有miR-194-3p預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的LINC02532野生型（WT）序列或不含預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的突變型（MUT）序列分別克隆到psiCHECK-2 熒光素酶載體，構(gòu)建重組熒光素酶報(bào)告載體WT-LINC02532、MUT-LINC02532。將含有miR-194-3p 預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的HMGB1-3’-UTR 的WT 序列或不含預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的MUT 序列分別克隆到psiCHECK-2 熒光素酶載體，構(gòu)建重組熒光素酶報(bào)告載體WT-HMGB1、MUT-HMGB1。使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑將WT-LINC02532、MUT-LINC02532、WT-HMGB1、MUT-HMGB1 分別與miR-194-3p mimics、miR-NC 轉(zhuǎn)染到HKF 中。培養(yǎng)48 h后，收獲細(xì)胞。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HKF細(xì)胞螢火蟲和海腎熒光素酶活性，計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性以表示miR-194-3p 與LINC02532或HMGB1的結(jié)合程度。相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC02532、miR-194-3p在瘢痕疙瘩中的表達(dá)

研究組LINC02532 表達(dá)量較正常組顯著升高（P＜0.05），而miR-194-3p 表達(dá)量較正常組顯著降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 LINC02532、miR-194-3p的表達(dá)

2.2 LINC02532、miR-194-3p 和HMGB1 的靶向關(guān)系DIANA Tools 預(yù)測(cè)到miR-194-3p 與LINC02532序列存在特異性結(jié)合位點(diǎn)，Targetscan 預(yù)測(cè)到miR-194-3p 與HMGB1 的3’-UTR 區(qū)域存在特異性結(jié)合位點(diǎn)，見圖2A。與miR-NC 和WT-LINC02532（或WT-HMGB1）共轉(zhuǎn)染比較，miR-194-3p mimic 和WT-LINC02532（或WT-HMGB1）共轉(zhuǎn)染組HKF 細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；與miRNC 和MUT-LINC02532（或MUT-HMGB1）共轉(zhuǎn)染比 較，miR-194-3p mimic 和MUT-LINC02532（或MUT-HMGB1）共轉(zhuǎn)染組HKF細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2B、2C。表明miR-194-3p 是LINC02532 的靶基因，HMGB1是miR-194-3p的靶基因。

圖2 LINC02532、miR-194-3p和HMGB1的互補(bǔ)序列及熒光素酶活性檢測(cè)

2.3 干擾LINC02532 表達(dá)對(duì)miR-194-3p 和HMGB1表達(dá)的影響 與si-NC組比較，si-LINC02532組HKF 細(xì)胞LINC02532 表達(dá)水平、HMGB1 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），miR-194-3p表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與miR-NC 組比較，miR-194-3p 組HKF 細(xì)胞miR-194-3p 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），HMGB1 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與si-LINC02532+anti-miR-NC 組比較，si-LINC02532+anti-miR-194-3p 組HKF 細(xì)胞miR-194-3p 表達(dá)水平顯降低（P＜0.05），HMGB1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 LINC02532、miR-194-3p mRNA及HMGB1蛋白表達(dá)的檢測(cè)

2.4 干擾LINC02532表達(dá)及miR-194-3p對(duì)HKF細(xì)胞增殖的影響 與si-NC 組比較，si-LINC02532 組HKF 細(xì)胞活力、集落形成數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與miR-NC組比較，miR-194-3p組HKF細(xì)胞活力、集落形成數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與si-LINC02532+antimiR-NC 組比較，si-LINC02532+anti-miR-194-3p 組HKF 細(xì)胞活力、集落形成數(shù)顯著升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 細(xì)胞活性和集落形成數(shù)的檢測(cè)

2.5 干擾LINC02532 表達(dá)及miR-194-3p 對(duì)HKF 細(xì)胞凋亡的影響 與si-NC組[（7.04±0.55）%]比較，si-LINC02532 組HKF 細(xì)胞凋亡率[（19.95±1.11）%]顯著升高（P＜0.05）；與miR-NC 組[（7.13±0.45）%]比較，miR-194-3p組HKF細(xì)胞凋亡率[（24.05±1.10）%]顯著升高（P＜0.05）；與si-LINC02532+anti-miR-NC組[（20.00±1.03）%]比較，si-LINC02532+anti-miR-194-3p組HKF細(xì)胞凋亡率[（9.11±0.72）%]顯著降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HKF細(xì)胞凋亡

3 討論

lncRNA 是一類異質(zhì)性RNA 分子，其通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、miRNA 調(diào)控多種機(jī)制參與多種細(xì)胞過(guò)程。近年來(lái)多種lncRNA被證實(shí)與瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制有關(guān)，例如瘢痕疙瘩組織和成纖維細(xì)胞中l(wèi)ncRNA H19明顯上調(diào)，沉默H19能夠抑制I型膠原表達(dá)、抑制成纖維細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[9]。lncRNA同源異形盒基因A11反義RNA（HOXA11-AS）高表達(dá)可抑制HKF 凋亡，促進(jìn)血管生成，促進(jìn)瘢痕疙瘩形成[10]。因此，闡明lncRNA在瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制中的作用有助于尋找有效的分子治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，瘢痕疙瘩組織中LINC02532 表達(dá)顯著升高，轉(zhuǎn)染si-LINC02532干擾LINC02532表達(dá)顯著降低HKF 活力和集落形成能力，增加細(xì)胞凋亡率，這與Zhang 等[4]報(bào)道干擾LINC02532 表達(dá)的抗增殖特性一致，這表明通過(guò)干擾LINC02532可能通過(guò)調(diào)控HKF增殖和凋亡對(duì)瘢痕疙瘩進(jìn)展具有抑制作用。

目前研究顯示，lncRNA主要通過(guò)lncRNA/miRNA/mRNA 分子軸發(fā)揮作用，例如lncRNA HOXA11-AS通過(guò)靶向miR-124-3p激活Smad5信號(hào)進(jìn)而誘導(dǎo)I型膠原合成，促進(jìn)瘢痕疙瘩形成[11]。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)LINC02532 與miR-194-3p之間的直接相互作用。既往研究表明，miR-194-3p 在脊柱骨肉瘤組織中表達(dá)降低，miR-194-3p 通過(guò)靶向基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）抑制脊柱骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲[12]。在乳腺癌中l(wèi)inc-ROR通過(guò)下調(diào)miR-194-3p促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲，降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)雷帕霉素的敏感性[13]。本研究發(fā)現(xiàn)瘢痕組織中miR-194-3p 表達(dá)明顯降低，過(guò)表達(dá)miR-194-3p 抑制HKF 增殖，促進(jìn)HKF凋亡，這些數(shù)據(jù)證明miR-194-3p作為一種抑制因子抑制瘢痕疙瘩進(jìn)展。HMGB1 是一種核蛋白，當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí)HMGB1移位到細(xì)胞質(zhì)，在感染、炎癥和免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮作用[14]。HMGB1 表達(dá)改變與創(chuàng)面愈合質(zhì)量有關(guān)[15]。HMGB1 還可介導(dǎo)成纖維細(xì)胞活性，加速HKF 遷移，導(dǎo)致皮膚異常瘢痕形成[16]。HMGB1 抑制劑顯著抑制HKF 增殖和自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制膠原蛋白合成[17]，以上研究表明抑制HMGB1 表達(dá)對(duì)瘢痕疙瘩形成具有抑制作用。由于HMGB1 是miR-194-3p 的直接靶點(diǎn)，過(guò)表達(dá)miR-194-3p或干擾LINC02532均可下調(diào)HMGB1表達(dá)，而干擾LINC02532 可上調(diào)miR-194-3p 表達(dá)，提示瘢痕疙瘩中存在LINC02532/miR-194-3p/HMGB1分子軸。為證實(shí)干擾LINC02532 表達(dá)的作用依賴于miR-194-3p 表達(dá)增加，本研究進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，抑制miR-194-3p 表達(dá)可減弱干擾LINC02532 表達(dá)對(duì)HKF 增殖、HMGB1 表達(dá)的抑制作用以及凋亡促進(jìn)作用，這進(jìn)一步表明LINC02532通過(guò)靶向miR-194-3p/HMGB1 分子軸從而調(diào)節(jié)HKF增殖和凋亡。

總之，本研究證實(shí)干擾LINC02532可能通過(guò)上調(diào)miR-194-3p/HMGB1分子軸抑制HKF增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這表明LINC02532可能是治療瘢痕疙瘩的新靶點(diǎn)。