液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜用于快速篩查動(dòng)物組織中多種激素殘留的方法研究和應(yīng)用

葉磊海，葉佳明，裘鈞陶，鐘世歡，黃 南，詹越城，何 斌，王慶玲

（1.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江杭州 310009；2.贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江杭州 310009）

激素是一類(lèi)調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，協(xié)調(diào)機(jī)體器官系統(tǒng)之間活動(dòng)并維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的物質(zhì)，主要包括糖皮質(zhì)激素，性激素和孕激素[1]。近些年來(lái)，其快速高效的治療效果誘使人們不但將其用于動(dòng)物疾病的治療，而且添加到動(dòng)物飼料或飲用水中用于非治療性的防病和促生長(zhǎng)，提高蛋白轉(zhuǎn)化率，改善畜產(chǎn)品品質(zhì)，在動(dòng)物養(yǎng)殖行業(yè)中非法使用[2]，研究表明，某些激素可長(zhǎng)期在動(dòng)物體內(nèi)中殘留，過(guò)量攝入后會(huì)對(duì)人體正常激素平衡造成干擾，引起體內(nèi)分泌功能紊亂，抑制機(jī)體的免疫功能，誘發(fā)感染，甚至有致癌風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，歐盟、美國(guó)食品藥物管理局嚴(yán)格規(guī)定禁止在動(dòng)物源性食品使用激素類(lèi)藥物[4]，我國(guó)農(nóng)業(yè)部250號(hào)公告[5]也明確規(guī)定禁止在動(dòng)物性食品中檢出甲基睪丸酮與群勃龍等激素類(lèi)藥物。食品中獸藥最大殘留限量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中也對(duì)部分藥物進(jìn)行了限量規(guī)定，比如倍他米松在動(dòng)物肌肉中限量 0.75 μg/kg，地塞米松 1.0 μg/kg[6]。

目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)激素藥物的方法[7]主要有氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）[8]、高效液相色譜法（LC）[9]和液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法（LC-MS）[10-11]。其中；GC-MS方法樣品需要衍生化，前處理繁瑣，有的激素也不容易通過(guò)衍生得到很好的極性和穩(wěn)定性，制約了其在多殘留分析中的應(yīng)用[12-14]；LC由于檢測(cè)器的局限性，定性能力差，難以應(yīng)用于多組分的的篩查和確證；LC-MS由于具有高靈敏和高選擇性的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在獸藥，農(nóng)殘的檢測(cè)工作。目前以四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q-TOF/MS）[15-16]等為代表的高分辨質(zhì)譜技術(shù)為多組分藥物殘留的篩查帶來(lái)了新的手段，其具有高質(zhì)量準(zhǔn)確度、高質(zhì)量分辨率，可提供全面的定性和定量信息等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)精確質(zhì)量數(shù)的自動(dòng)檢索匹配以及二級(jí)特征碎片離子的確定，來(lái)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的高通量的篩查和確證。

QuEChERS作為一種常用的分散固相萃取技術(shù)被越來(lái)越多應(yīng)用到高通量藥物篩查工作中，一些傳統(tǒng)的吸附劑如：十八烷基鍵合硅膠（C18），N-丙基乙二胺（PSA），石墨碳黑（GCB），中性氧化鋁（Alu-N），其中PSA和GCB能吸附基質(zhì)中的糖類(lèi)和色素，C18和Alu-N具有良好除脂能力，但是針對(duì)性較差，在去掉基質(zhì)干擾物的同時(shí)也會(huì)吸附目標(biāo)物。已有研究表明，一些新的材料憑借其某些特殊的性能被用來(lái)作為新型吸附劑用于農(nóng)殘，抗生素和激素多殘留的檢測(cè)[17]。其中增強(qiáng)型脂質(zhì)去除吸附劑（EMR）作為一種新型的吸附劑，采用特殊聚合物基質(zhì)專(zhuān)門(mén)吸附脂質(zhì)中C5及以上的碳鏈，對(duì)脂質(zhì)具有非常強(qiáng)的選擇吸附性，官能化聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP-2）吸附劑，其表面鍵合有吡咯烷酮和微量的脲基官能團(tuán)，具有富于電荷的表面結(jié)構(gòu)，可以吸附大多數(shù)高極性化合物。

測(cè)定激素藥物的前處理方法主要有液液萃取法[18]、固相萃取法[19]、QuEChERS（quick, easy,cheap, effective, rugged and safe)法[20]。液液萃取法要使用大量的有機(jī)試劑且步驟繁瑣，固相萃取法雖然凈化效果好，但使用的萃取小柱成本過(guò)高，QuEChERS早期應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，隨著不同種類(lèi)的新型吸附劑的開(kāi)發(fā)，近年來(lái)也逐漸在測(cè)定激素工作中得到應(yīng)用。本研究以常用32種激素為研究對(duì)象，旨在建立一種高效液相色譜一四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-Q-TOF/MS）同時(shí)測(cè)定動(dòng)物組織32種激素殘留的快速篩查和定量方法。方法擬用增強(qiáng)型脂質(zhì)去除劑（EMR），N-丙基乙二胺（PSA）和官能化聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP-2）等吸附劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的吸附材料，以解決傳統(tǒng)QuEChERS所用的吸附劑在除脂和目標(biāo)物共吸附的矛盾，以期為此類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)提供更多的技術(shù)選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

32種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 純度均大于95.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer，具體信息見(jiàn)表1；乙腈、甲酸、甲醇 色譜純，美國(guó)J.T.Baker；氯化鈉、硫酸鎂 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；增強(qiáng)型脂質(zhì)去除吸附劑（EMR） 美國(guó) Agilent公司；十八烷基鍵合硅膠C18、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳黑（CCB）、中性氧化鋁（Al-N）、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP-2）吸附劑 天津博納艾杰爾公司；實(shí)驗(yàn)用水 Millipore-iQ高純水凈化儀制得；牛肉、雞肉、豬肝 均采自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，均質(zhì)后-18 ℃保存待用。

表1 32種激素質(zhì)譜篩查參數(shù)Table 1 Screening parameters of 32 hormones by mass spectrometry

Agilent 1290高效液相色譜-6545四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；SOP萬(wàn)分之一電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HS260旋渦振蕩器 德國(guó)IKA公司；N-EVAPl l 2水浴式氮吹儀 美國(guó)Organomation公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g（精確到0.01 g）混合均勻的樣品于50 mL離心管中，加入5 mL水，旋渦混勻30 s，準(zhǔn)確加入乙腈15 mL，超聲提取10 min，5000 r/min離心5 min，取上清液于另一離心管中，用乙酸乙酯10 mL重復(fù)提取殘?jiān)?次，合并兩次上清液，加入1 g EMR吸附劑（預(yù)先加5 mL水進(jìn)行活化），旋渦 30 s，然后 5000 r/min離心5 min，取全部上清液加入鹽析劑（3 g無(wú)水硫酸鎂和1 g氯化鈉），旋渦混勻30 s，然后5000 r/min離心5 min ，取全部上層清液加入100 mgPSA和10 mg官能化聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP-2），旋渦混勻 30 s，然后 5000 r/min離心5 min，取上清液在40 ℃下用氮?dú)獯抵两?，加?1 mL 0.1% 甲酸水-乙腈（90:10，V:V）復(fù)溶，旋渦30 s，過(guò) 0.22 μm 濾膜上機(jī)。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse Plus-C18柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相：A：0.1% 甲酸，B：0.1% 甲酸乙腈，梯度洗脫程序：0～3 min，10%～30% B%，3～10 min，30%～75% B%，10～13 min，75%～75% B%，13～15 min，75%～90% B%，15～16 min，90%～90% B%，16～16.1 min，90%～10% B%，16.1～20 min，10%～10% B%。流速：0.3 mL/min ，溫度：30 ℃，進(jìn)樣量：5 μL。

1.2.3 TOF/MS條件 離子源：Dual AJS ESI源，掃描方式：正離子全掃描采集一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，Target MS/MS模式采集二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)；掃描范圍：m/z 50～700；毛細(xì)管電壓：4000 V；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：12 L/min；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：10 L/min；裂解電壓：150 V；飛行時(shí)間管真空度：2.05×10-7Torr；使用嘌呤（m/z 121.050873）和六磷氮（m/z 922.009798）作為參比液進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量校準(zhǔn)，質(zhì)量誤差精度低于5×10-6。

1.2.4 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立 用甲醇溶液分別配制各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為100 μg/mL，并用50%甲醇水配制成質(zhì)量濃度1.0 μg/mL 32種混合標(biāo)液，為按上述儀器條件，在全掃描模式下對(duì)32種混合標(biāo)液進(jìn)行分析，獲得化合物的精確分子質(zhì)量，同位素信息和保留時(shí)間，建立一級(jí)譜庫(kù)。然后在Target MS/MS模式下分析，得到不同碰撞能（10、20、40 eV）下碎片離子的質(zhì)譜圖，建立二級(jí)譜庫(kù)，最后將兩次采集的信息導(dǎo)入PCDL軟件，完成質(zhì)譜庫(kù)的建立。32種激素的分子式、精確質(zhì)量數(shù)、質(zhì)量偏差、保留時(shí)間、子離子等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用安捷倫公司的質(zhì)譜定性分析數(shù)據(jù)處理軟件（MassHunter Qualitative Analysis B.5.00）。樣品分別在全掃描模式和Target MS/MS模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，通過(guò)建立好的32 種激素類(lèi)化合物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行化合物提取與匹配，主要通過(guò)保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)、化合物同位素豐度進(jìn)行定性。通過(guò)基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？瞻讟悠钒床襟E1.2.1方法進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)，以此配制質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100、200、1000 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，LC-QTOF/MS進(jìn)樣測(cè)定，以各化合物的一級(jí)母離子響應(yīng)峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度繪制曲線，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取劑的選擇 對(duì)目標(biāo)物的提取效果取決于樣品的基質(zhì)和化合物的極性，由于動(dòng)物組織中基質(zhì)復(fù)雜，含有蛋白質(zhì)、脂肪等內(nèi)源性物質(zhì)，干擾目標(biāo)物的分析，使得性激素多殘留分析檢測(cè)具有一定的難度[21-23]，試驗(yàn)涉及到的激素類(lèi)藥物屬于弱極性或中等極性化合物，易溶于有機(jī)溶劑[24]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取雞肉、牛肉、豬肝作為不同類(lèi)型的基質(zhì)代表，以甲醇、乙腈、乙酸乙酯為提取劑考察不同提取劑的提取效果，具體見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在50 μg/kg的加標(biāo)水平下，三種提取劑甲醇提取效果較差，個(gè)別組分如丙酸諾龍單次提取效率只有20%～40%，乙腈和乙酸乙酯單次提取效率較高，但是在豬肝復(fù)雜基質(zhì)中個(gè)別組分如孕酮，在乙腈中的提取效率要高于乙酸乙酯，而在雞肉等簡(jiǎn)單基質(zhì)中，孕酮在乙酸乙酯中的提取效率要好于乙腈?？赡苁怯捎谠趶?fù)雜基質(zhì)中乙酸乙酯提取共萃物較多，導(dǎo)致更多的基質(zhì)效應(yīng)。因此本實(shí)驗(yàn)采用乙腈和乙酸乙酯分步提取的方式，能夠兼顧不同基質(zhì)不同組分的提取效率，兩次提取后各藥物平均回收率在85%以上。

表2 32種激素中不同基質(zhì)中3種提取劑回收率的比較Table 2 Comparison of recovery rates of three extractants in different substrates of 32 hormones

2.1.2 凈化條件的選擇 本研究通過(guò)加標(biāo)回收率考察了 C18、Alu-N、GCB、EMR、PSA、PEP-2這 6種吸附劑對(duì)32種激素的吸附情況。結(jié)果表明C18、Alu-N、GCB對(duì)目標(biāo)化合物均有不同程度的吸附，其中C18、Alu-N對(duì)丙酸睪酮、氫化可的松等親脂性較強(qiáng)的激素有明顯吸附，平均回收率在80%左右，GCB因其可吸附帶苯環(huán)官能團(tuán)的藥物，對(duì)大部分藥物均有明顯的吸附，平均回收率不足70%。而適量的EMR、PSA和PEP-2對(duì)化合物的吸附影響較小，回收率在90%以上，具體見(jiàn)圖1。通過(guò)平均回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果，進(jìn)一步考察了不同添加量的凈化效果，參考文獻(xiàn)[25]和經(jīng)驗(yàn)，分別比較了在100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中添加 EMR 1～5 g，PSA 100～500 mg，PEP-2 10～50 mg不同添加量的凈化效果，具體見(jiàn)表3，結(jié)果表明：EMR不同添加量回收率和基質(zhì)效應(yīng)基本沒(méi)有差別，PSA加入100 mg時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)適中，回收率最佳，而PEP-2在加入量超過(guò)30 mg的時(shí)候，平均回收率不到75%，加入量在減少至10 mg，平均回收率在90%以上，與不加入對(duì)比，樣液的澄清度和圖譜上雜質(zhì)峰情況有明顯改善。所以本實(shí)驗(yàn)最終確定加入1 g EMR吸附劑，100 mg PSA，10 mg PEP-2作為最終的添加量。

表3 3種吸附劑不同加入量對(duì)32種目標(biāo)物回收率的影響Table 3 Efects of different amounts of three adsorbents on the recoveries of 32 target compounds

圖1 不同吸附劑對(duì)32種目標(biāo)物回收率的影響Fig.1 Effect of different adsorbents on the recovery of 32 target compounds

吸附劑實(shí)驗(yàn)表明，基于增強(qiáng)型脂質(zhì)吸附劑（EMR）的QuEChERS法能夠解決傳統(tǒng)吸附劑與目標(biāo)物共吸附的矛盾，可以去除基質(zhì)中大部分雜質(zhì)，很大程度上降低了基質(zhì)干擾，提高整個(gè)方法的靈敏度。

2.2 質(zhì)譜和色譜條件的優(yōu)化及數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

2.2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化和數(shù)據(jù)庫(kù)的建立 使用Dual AJS ESI源，在m/z 50～700范圍內(nèi)對(duì)32種1.0 μg/mL目標(biāo)化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析，得到目標(biāo)化合物的總離子色譜圖，結(jié)果顯示，所有藥物在正離子得到的碎片信息要多于負(fù)離子模式，正離子模式下形成[M+H]+準(zhǔn)離子峰。比較各個(gè)化合物提取離子流色譜圖的響應(yīng)和峰型，依次對(duì)離子源參數(shù)（毛細(xì)管電壓、干燥器溫度、干燥器流速、鞘氣流速、鞘氣溫度等）進(jìn)行優(yōu)化，使質(zhì)譜儀靈敏度達(dá)到最優(yōu)，然后優(yōu)化各化合物的裂解電壓，使其響應(yīng)值最大，其范圍在120～170V，最終選擇均能獲得較高響應(yīng)值的150 V作為本方法的裂解電壓。

飛行時(shí)間質(zhì)譜主要利用各化合物的篩查參數(shù)來(lái)篩查和確證目標(biāo)物，本方法主要通過(guò)Agilent Mass-Hunter Qualitative Analysis（B.5.00）軟件完成化合物質(zhì)譜篩查參數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立。在全掃描模式下先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，得到目標(biāo)化合物的保留時(shí)間、精確分子質(zhì)量、同位素信息、質(zhì)量誤差等相關(guān)信息，然后在Target MS/MS模式下采集得到碰撞能為10、20、40 eV各化合物的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，建立32種目標(biāo)化合物的篩查數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)歐盟2002/657/EC法案的中累計(jì)4個(gè)識(shí)別點(diǎn)鑒定化合物的要求，高分辨質(zhì)譜母離子得到2個(gè)識(shí)別點(diǎn)，碎片離子得到2.5識(shí)別點(diǎn)。因此基于保留時(shí)間，一級(jí)母離子飛行時(shí)間質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度匹配、二級(jí)特征離子碎片等信息的飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜具有比低分辨質(zhì)譜更可靠的定性分析優(yōu)勢(shì)。

2.2.2 色譜條件優(yōu)化 32種激素在C18色譜柱上均有較好的保留，考慮到選擇的激素藥物中有多種同分異構(gòu)體，主要有潑尼松龍和可的松，地塞米松和倍他米松，曲安奈德、倍他米松醋酸酯、地塞米松醋酸酯和氟尼縮松，阿氯米松雙丙酸酯和倍氯米松雙丙酸酯，甲基潑尼松龍醋酸酯和地索奈德共5組同分異構(gòu)體，給分離造成了一定的困難，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)[26-27]，主要通過(guò)不同的色譜柱和不同的流動(dòng)相及梯度洗脫體系進(jìn)行了優(yōu)化。本研究主要比較Extend C18、BEH C18、Eclipse Plus-C18三種色譜柱對(duì)32種激素的保留行為，結(jié)果表明目標(biāo)化合物包括5組同分異構(gòu)體在EclipsePlus-C18色譜柱能獲得較理想的分離度。

同時(shí)，對(duì)比了甲醇水、乙腈水體系兩種流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇-水流動(dòng)相時(shí)，幾種同分異構(gòu)體無(wú)法有效分離，而乙腈-水體系不僅能有效分離同分異構(gòu)體，而且峰型更尖銳，響應(yīng)值更高，主要是因?yàn)橐译孑^甲醇有更強(qiáng)的洗脫能力。所以，選擇乙腈為有機(jī)流動(dòng)相，再進(jìn)一步比較不同pH的水系流動(dòng)相（水、0.1%甲酸、0.2%甲酸、1%甲酸水溶液）。結(jié)果表明，在水中加入0.1%甲酸，能提高目標(biāo)化合物的響應(yīng)，并獲得滿意的分離效果，為了保持流動(dòng)相體系的平衡，在乙腈中也加入0.1%甲酸。故最終選擇0.1%乙腈-0.1%甲酸水作為本方法的流動(dòng)相體系，EclipsePlus-C18色譜柱作為分離工具，可以兼顧32種激素藥物的色譜保留行為及質(zhì)譜響應(yīng)，經(jīng)優(yōu)化后的梯度洗脫能在20 min內(nèi)有效分離32種化合物。在以上條件優(yōu)化后的離子色譜圖2。

圖2 32種激素提取離子色譜圖Fig.2 High resolution extracted ion chromatogram of 32 hormones

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的研究

基質(zhì)效應(yīng)是利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析復(fù)雜藥物時(shí)影響定量準(zhǔn)確性的重要因素[28]，共流出在離子源競(jìng)爭(zhēng)性離子化，會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物離子化效果的增強(qiáng)或抑制，從而表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)或者抑制現(xiàn)象[29-30]。本實(shí)驗(yàn)以豬肉為研究對(duì)象，在空白豬肉提取液中加入不同濃度的混合標(biāo)液，并與空白甲醇試劑配制的標(biāo)液進(jìn)行比較，以Matrix Effect（ME）表示基質(zhì)效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)每種目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果如表4所示，ME值越接近1，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)越小，反之亦然。結(jié)果表明，在優(yōu)化后方法處理后，各藥物的基質(zhì)效應(yīng)在0.725～0.913，具體見(jiàn)表4，說(shuō)明本方法的前處理能有效降低基質(zhì)效應(yīng)，為了獲得更準(zhǔn)確的定量結(jié)果，本方法還是采用基質(zhì)標(biāo)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量計(jì)算。本方法也可以通過(guò)使用內(nèi)標(biāo)物降低基質(zhì)效應(yīng)影響，但是考慮到內(nèi)標(biāo)物造價(jià)昂貴，很難找到滿足所有藥物篩查條件的內(nèi)標(biāo)物，因此本實(shí)驗(yàn)并未采用添加內(nèi)標(biāo)的方法。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍、回歸方程、檢出限和定量限 在本文確定條件下，對(duì)32種激素藥物進(jìn)行測(cè)定，用牛肉空白基質(zhì)配制一系列濃度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行測(cè)定，以一級(jí)母離子響應(yīng)3倍信噪比和10倍信噪比分別確定樣品的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），通過(guò)表4可以看到32種藥物在各自線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)≥0.995以上，線性相關(guān)良好，LOD范圍為1～10 μg/kg，LOQ范圍為 3～30 μg/kg，靈敏度滿足實(shí)際檢測(cè)的需要。

表4 32種激素的基質(zhì)效應(yīng)、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限（LOD）及定量限(LOQ)Table 4 Matrix effect, regression equation, correlation coefficient, linear range, LOD and LOQ of 32 hormones

2.4.2 方法回收率和精密度驗(yàn)證 選取牛肉、雞肉、豬肝不同基質(zhì)陰性樣品分別添加10、50、100 μg/kg 3個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，考察方法回收率和精密度，從結(jié)果來(lái)看，該方法回收率在不同基質(zhì)中達(dá)到70.3%～116.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.87%～8.97%，說(shuō)明本方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。其中牛肉中加標(biāo)回收率和RSD具體見(jiàn)表5，其他數(shù)據(jù)不一一列出。

表5 牛肉中32種激素加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 5 Recoveries and relative standard deviations of 32 hormones in beef (n=6)

續(xù)表5

2.5 實(shí)際樣品的篩查

采用本方法對(duì)市售30批次雞肉，30批次牛肉和20批次豬肝進(jìn)行檢測(cè)，每種樣品進(jìn)行雙平行測(cè)定，其中檢測(cè)出豬肝中地塞米松1份，雞肉中地塞米松 1份，含量分別為 10.2、6.7 μg/kg，均超過(guò)最大殘留限量1.0 μg/kg規(guī)定[6]，陽(yáng)性樣品用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行方法驗(yàn)證，測(cè)量結(jié)果非常接近。表明本方法結(jié)果可靠，可作為日常樣品的篩查。

3 結(jié)論

本方法建立了基于QTOF高分辨質(zhì)譜快速篩查動(dòng)物組織中多種激素殘留檢測(cè)方法，通過(guò)乙腈和乙酸乙酯分步提取，提取劑用EMR、PSA、PEP-2分步凈化，通過(guò)C18色譜柱進(jìn)行分離，在全掃描模式下采集一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，以待測(cè)物的準(zhǔn)分子離子峰的峰面積定量，以保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比等特征信息定性，并應(yīng)于于市售80份實(shí)際樣品的篩查分析。結(jié)果說(shuō)明，該方法操作簡(jiǎn)單，回收率高，重現(xiàn)性好。80份樣品檢測(cè)出豬肝中地塞米松 1 份，雞肉中地塞米松 1 份，含量分別為 10.2、6.7 μg/kg，均超過(guò)最大殘留限量 1.0 μg/kg 規(guī)定。采用一次制備樣品，可以同時(shí)快速篩查動(dòng)物組織中32種激素藥物，一次進(jìn)樣分析，可同時(shí)提供定量和定性的結(jié)果，大大提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力，為進(jìn)一步準(zhǔn)確篩查動(dòng)物組織中激素殘留提供了豐富的技術(shù)手段。