枸杞多糖通過Nrf2/HO-1信號對百草枯致肺損傷的保護作用

朱 宇，張志俊，劉科藍

0 引 言

百草枯(paraquat, PQ)中毒是最常見的中毒類型之一。由于缺乏有效的特異性解毒藥物，百草枯中毒患者的病死率極高，達到60%～80%[1]。由于肺部的主動攝取機制，百草枯常積聚于肺并引起肺損傷和肺纖維化。百草枯中毒引起肺組織病變的相關分子機制并不明確，主要涉及氧化-抗氧化失衡、脂質過氧化、炎癥激活和細胞凋亡等病理生理過程[2]。近年來，中藥以及中藥相關活性成分對肺損傷的保護作用逐漸受到重視，如血必凈[3]、牛蒡子苷元[4]等。其中枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides, LBP)被認為具有抗氧自由基、抗腫瘤、免疫調節(jié)等作用，具備一定的轉化應用價值[5]。本研究擬探究枸杞多糖對百草枯所致大鼠肺損傷的保護作用并初步探索潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑枸杞多糖(Solarbio, 純度≥90%)，百草枯(Sigma公司)，羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量測定試劑盒(Solarbio)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，白細胞介素-1β(IL-1β)檢測ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測ELISA試劑盒(上海碧云天公司)，蛋白質免疫印跡(Western blot)檢測核轉錄因子NF-E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、β-actin相關抗體(美國Abcam公司)。

1.2 動物實驗分組及取材SPF級雄性SD大鼠24只(8～10周齡，體重200～220 g)由江蘇省人民醫(yī)院實驗動物房提供，實驗動物許可證號：SCXK(蘇)2016-0002。飼養(yǎng)于相對濕度50%～60%、溫度22～24 ℃的環(huán)境中，光照周期12 h，自由飲水和進食。采用隨機數字表法分為3組：百草枯組(n=8)：腹腔注射百草枯(20 mg/kg)；PQ+LBP組(n=8)：腹腔注射百草枯(20 mg/kg)后灌胃給予枸杞多糖(400 mg/kg)；對照組(n=8)：腹腔注射等量等滲鹽水。大鼠于實驗后3 d麻醉處死并留取肺組織標本。

1.3 大鼠肺濕/干重比分析和羥脯氨酸含量檢測測定大鼠肺濕/干重比檢測時，取左肺擦干表面液體，稱取其濕質量(W)，將其置于烘箱中晾干至恒重，稱取干質量(D)，計算兩者比值即為濕/干重比(W/D)。按照試劑盒標準流程檢測檢測肺組織羥脯氨酸含量。

1.4 MPO、MDA和SOD水平檢測按照對應試劑盒說明書要求分別檢測肺組織勻漿中MPO、MDA和 SOD的水平。

1.5 IL-1β、TNF-α表達水平檢測采用ELISA試劑盒分別檢測3組大鼠肺組織勻漿中炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達水平。

1.6 Western blot檢測肺組織Nrf2和HO-1表達水平取大鼠肺組織按每100 毫克加1 mL組織裂解液，充分勻漿后收集上清并測定蛋白濃度。聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，濕轉法轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，采用含有5%牛血清白蛋白(BSA)的封閉液封閉后，加入對應一抗，孵育后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，孵育后增強化學發(fā)光法(ECL)顯色，條帶灰度值采用Image J軟件分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠肺組織學改變、濕/干重比和羥脯氨酸含量比較大鼠肺組織切片經HE染色后，在光鏡下觀察發(fā)現：百草枯組大鼠在腹腔注射百草枯 3 d后，肺部滲出明顯增多，大量炎細胞浸潤，肺泡塌陷，組織結構受損嚴重。與百草枯組比較，經枸杞多糖灌胃處理的PQ+LBP組大鼠肺部炎癥滲出顯著減少，炎細胞浸潤得到一定的緩解，肺組織結構基本正常，見圖1。與對照組大鼠比較，百草枯組大鼠肺組織的濕/干重比和羥脯氨酸含量顯著增加(P<0.05)，而PQ+LBP組大鼠肺組織的濕/干重比和羥脯氨酸含量較百草枯組顯著降低(P<0.05)，見圖2。

圖1 各組大鼠肺組織切片(HE染色 ×100)

2.2 各組大鼠肺組織MPO、MDA和SOD水平比較與對照組比較，百草枯組大鼠肺組織中MPO活性和MDA含量顯著增加，而SOD活性降低(P<0.05)。與百草枯組比較，PQ+LBP組大鼠肺組織MPO活性和MDA含量下調(P<0.05)，而SOD水平顯著增加(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肺組織MPO、MDA、SOD表達水平

2.3 各組大鼠肺組織IL-1β和TNF-α表達水平比較與對照組比較，百草枯組大鼠肺組織中IL-1β和TNF-α的表達水平顯著增加(P<0.05)。與百草枯組比較，PQ+LBP組大鼠肺組織中IL-1β和TNF-α的表達水平下調(P<0.05),說明枸杞多糖能夠降低大鼠肺組織中IL-1β和TNF-α的表達水平，見表2。

表2 各組大鼠肺組織IL-1β、TNF-α表達水平

2.4 各組大鼠肺組織Nrf2和HO-1蛋白表達水平比較與對照組比較，百草枯組大鼠肺組織Nrf2和HO-1的表達受到抑制(P<0.05)。PQ+LBP組大鼠肺組織Nrf2和HO-1蛋白表達水平較百草枯組顯著上調(P<0.05)，見圖3。

與對照組比較，*P<0.05；與百草枯組比較，#P<0.05圖3 各組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1分子蛋白表達水平

3 討 論

百草枯導致的肺損傷和肺纖維化是中毒患者死亡的主要原因[6]，其發(fā)生發(fā)展的分子機制尚不明確，尋找有效的肺損傷和肺纖維化抑制劑對改善患者的預后具有重要意義[7]。近年來，多種中藥活性成分在不同病因導致的肺損傷治療方面的價值逐漸受到重視[8]。枸杞多糖作為枸杞的主要活性成分，主要由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、等多種水溶性復合多糖組成，具有重要的藥理學活性，包括抗癌、抗氧化、抗衰老、免疫調節(jié)等作用[9-10]。

本研究通過構建大鼠動物模型發(fā)現，枸杞多糖能夠減輕百草枯中毒導致的肺損傷、減少肺組織滲出、減少肺組織羥脯氨酸的沉積。通過對氧化應激相關分子MPO、MDA和SOD的檢測和比較發(fā)現，枸杞多糖能夠降低MPO活性和MDA水平，上調SOD活性，提示枸杞多糖有助于提升清除自由基的能力、抑制脂質過氧化反應、減少氧化應激造成的組織損傷。而PQ+LBP組大鼠肺組織中IL-1β和TNF-α的表達水平下調，表明枸杞多糖具有一定的抗炎作用。在相關分子機制研究方面，枸杞多糖處理后，大鼠肺組織Nrf2和HO-1蛋白水平上調，該通路參與多種組織器官的抗氧化應激反應，是機體重要的抗氧化損傷機制。此外，Nrf2/HO-1還具有調節(jié)免疫應激、抗炎、減少線粒體損傷和抗凋亡等作用[11-12]。

對于其他病因引起的肺部疾患，枸杞多糖也能發(fā)揮一定的治療作用。Chen等[13]在小鼠和人肺微血管內皮細胞(HPMECs)兩個水平研究枸杞多糖對脂多糖(LPS)誘導的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的保護作用及分子機制，發(fā)現：枸杞多糖能夠通過抑制NF-κB信號途徑發(fā)揮抗凋亡和抗氧化作用，減少內皮細胞損傷，減輕肺部炎癥和水腫。也有報道枸杞多糖通過Akt/eNOS 通路減輕LPS致ARDS小鼠肺損傷，發(fā)揮抗炎、抗氧化應激及抗凋亡作用[14]。對于病情穩(wěn)定的慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者中，枸杞多糖能夠降低并穩(wěn)定血清缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)濃度，抑制病情加重[15]。在肺纖維化研究方面，枸杞多糖能夠抑制肺纖維化相關基因COL1A1和α-SMA的表達，減少肺組織羥脯氨酸的沉積，同時還能夠抑制成纖維細胞過度增殖和轉分化[16]。相關機制與百草枯中毒導致的肺纖維化發(fā)生發(fā)展關系密切，枸杞多糖是否能夠抑制上述過程進而阻斷百草枯所致的肺纖維化有待探討。

綜上所述，本研究中，枸杞多糖作為一種重要的植物活性成分對百草枯誘導的肺損傷具有較好的保護作用，同時能夠發(fā)揮抗氧化應激和抗炎活性，Nrf2/HO-1信號途徑可能參與這個過程。相關分子調控機制及轉化應用前景還需進一步研究。