發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)單面針毛狀根及PCR 檢測(cè)研究

呂思航，苗卓文，劉修霆，馮思晴，孫吉康

（中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410004）

單面針（Zanthoxylum dissitum Hemsl.）是蕓香科花椒屬木質(zhì)藤本植物，普遍分布于我國(guó)南方地區(qū)海拔500～1200m 的山地林下、林緣、灌叢中[1]。2013 年9 月2日，環(huán)境保護(hù)部和中國(guó)科學(xué)院聯(lián)合編制發(fā)布的《中國(guó)生物多樣性紅色名錄——高等植物卷》顯示，蕓香科花椒屬16 種花椒中，1 種瀕危、9 種近危、6 種易危。單面針屬近危物種，影響野生單面針資源存量的主要原因包括：生態(tài)環(huán)境惡化、人為掠奪性采伐、種子萌發(fā)率低下。

單面針中富含生物堿、黃酮、香豆素等生物活性成分，是婦科千金膠囊的主要成分，同時(shí)，具有活血散瘀、續(xù)筋接骨的作用[2-3]。單面針根莖是其主要用藥部位，但單面針植株根系分支少、短，根系不發(fā)達(dá)且生長(zhǎng)緩慢。此外，人工栽培單面針?biāo)幉拇嬖谏L(zhǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、藥材品質(zhì)低下等問題。

20 世紀(jì)80 年代，White 等人[4]發(fā)現(xiàn)，發(fā)根農(nóng)桿菌通過傷口，將Ri 質(zhì)粒上的T-DNA 插入植物基因組，其所攜帶的rol B 等基因在宿主細(xì)胞中整合表達(dá)，從而誘導(dǎo)植物長(zhǎng)出毛狀根。許多專家學(xué)者發(fā)現(xiàn)，毛狀根中可以提取許多次生代謝物質(zhì)，其正是藥用植物發(fā)揮醫(yī)藥療效的基礎(chǔ)物質(zhì)。誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根具有生長(zhǎng)速度快、分化程度高、生理生化和遺傳性穩(wěn)定、操作控制簡(jiǎn)單、不需要外源植物激素等特點(diǎn)。目前，許多藥用植物已經(jīng)成功培育出毛狀根，如顛茄、丹參、地黃、何首烏、金鐵鎖、車前葉藍(lán)薊、黃岑等[5]。

但迄今對(duì)單面針的毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)技術(shù)未見報(bào)道。擬利用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1 和ATCC10060 轉(zhuǎn)化單面針不同外植體以誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根，建立單面針毛狀根誘導(dǎo)技術(shù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

使用單面針無菌苗來自湖南省張家界種子萌發(fā)，發(fā)根農(nóng)桿菌菌株C58C1 和ATCC10060 由本試驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單面針無菌苗培養(yǎng)。挑選生長(zhǎng)活力好的單面針種子，敲除外殼，將種子浸泡于540mg/L GA3溶液中5.5h；在超凈工作臺(tái)內(nèi)，0.1%升汞消毒3.5min，無菌水沖洗5次；接種于MS 固體培養(yǎng)基內(nèi)，置于25℃人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，至子葉完全長(zhǎng)出后轉(zhuǎn)移至光培養(yǎng)。置于16/8h 光照周期環(huán)境，光照強(qiáng)度為60 μmol·m-2s-1，培養(yǎng)45d 后得到單面針無菌幼苗。

1.2.2 活化發(fā)根農(nóng)桿菌。保存在-80℃超低溫冰箱中的發(fā)根農(nóng)桿菌，取100μL 加入30mL 含有50mg/L 利福平的YEB 液體培養(yǎng)基中，于30℃、120r 搖床培養(yǎng)13～15h，測(cè)菌液OD600 值達(dá)0.5～0.7。取20mL 菌液加入20mL含有100 μm AS（乙酰丁香酮）的YEB 液體培養(yǎng)基中，添加利福平至濃度為50mg/L，培養(yǎng)1.5～2h，至菌液OD600 值達(dá)0.5～0.7。將菌液倒入滅菌的50mL 離心管中，以5000r 離心8～12min，棄上清液，加入40mL 含有100 μm AS 的MS 液體培養(yǎng)基中，重懸沉淀至無絮狀物，這時(shí)培養(yǎng)基中活化的菌液達(dá)到了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即可用于侵染。

1.2.3 外植體選取及處理。分別取無菌苗的葉片（劃傷）、葉柄（帶葉片），于MS 空白固體培養(yǎng)基中，在25±2℃的人工氣候箱中暗培養(yǎng)2d。

1.2.4 外植體侵染與培養(yǎng)。將預(yù)培養(yǎng)的外植體浸入活化好的菌液在搖床中以30℃、120r 的條件震蕩10min，無菌水沖洗1～2 次，后將外植體取出后，用無菌濾紙吸干表面水分，將處理好的外植體移入MS+AS（乙酰丁香酮100μm）固體培養(yǎng)基中，在25±2℃的人工氣候箱中培養(yǎng)2d，后置于MS+Cef（頭孢霉素500mg/L）固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)，每隔3～10d 更換新鮮培養(yǎng)基，直至毛狀根長(zhǎng)出。1.2.5 毛狀根rol B 基因的PCR 檢測(cè)。提取單面針幼苗根、單面針毛狀根DNA 及C58C1 農(nóng)桿菌質(zhì)粒，利用引物5'-GCT CTT GCA GTG CTA GATTT-3' 和5'-GAA GGT GCAAGC TAC CTCTC-3'進(jìn)行PCR。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，按94℃變性30sec、55℃退火40sec、72℃延伸1min 的程序進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，在72℃下延伸8min 結(jié)束反應(yīng)，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳25～30min，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察和拍照記錄（120V 電壓，25 min），對(duì)獲得的毛狀根進(jìn)行分子鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體對(duì)單面針毛狀根發(fā)根情況的影響

在侵染10min 的條件下，選擇發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1進(jìn)行侵染，研究比較不同外植體，即單面針葉柄（帶葉片）和單葉片（劃傷），對(duì)誘導(dǎo)毛狀根發(fā)根情況的影響，試驗(yàn)結(jié)果（見表1、圖1）。

表1 外植體不同對(duì)單面針毛狀根發(fā)根情況的影響

圖1 C58C1 誘導(dǎo)的單面針毛狀根

從表1 中可見，單葉片（劃傷）作為外植體沒有發(fā)根出現(xiàn)，選取葉柄（帶葉片）作為外植體時(shí)，經(jīng)過35d 誘導(dǎo)培養(yǎng)后開始發(fā)根，其發(fā)根率可達(dá)25%。故選取葉柄（帶葉片）作為外植體誘導(dǎo)單面針毛狀根最為合適。圖1 顯示，單面針毛狀根為乳白色，失去向地生長(zhǎng)特性，而且生長(zhǎng)較為迅速，需5d 即可長(zhǎng)至1～1.5cm。

2.2 發(fā)根農(nóng)桿菌菌種不同對(duì)單面針毛狀根發(fā)根情況的影響

根據(jù)2.1 相關(guān)內(nèi)容，以單面針葉柄（帶葉片）為外植體，侵染時(shí)間為10min。分別選擇發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1 和ATCC10060 進(jìn)行侵染，目的是為找到最優(yōu)的侵染菌種。

從表2 試驗(yàn)結(jié)果可見，發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1 的誘導(dǎo)成功率明顯高于ATCC10060 菌株，因此，選擇發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1。

表2 發(fā)根農(nóng)桿菌菌種不同對(duì)單面針毛狀根發(fā)根情況的影響

3 毛狀根PCR 檢測(cè)

分別以C58C1 發(fā)根農(nóng)桿菌Ri 質(zhì)粒、單面針幼苗根和單面針毛狀根的基因組DNA 為模板，以前述引物對(duì)rol B 基因進(jìn)行PCR 檢測(cè)（見圖2）。結(jié)果表明，在單面針毛狀根基因組DNA 和C58C1 質(zhì)粒中，能擴(kuò)增到400bp的特異性DNA 片段，而在幼苗根DNA 中擴(kuò)增失敗。因此，證明發(fā)根農(nóng)桿菌中的Ri 質(zhì)粒已導(dǎo)入單面針毛狀根中。

圖2 單面針毛狀根rol B 基因PCR 檢測(cè)

3 結(jié)語

通過毛狀根提取次生代謝物被廣泛應(yīng)用于各種植物來源的藥物生產(chǎn)[6]。毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)受很多物理、化學(xué)因素影響，如外植體、發(fā)根農(nóng)桿菌種類、預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時(shí)間、外源激素等[7]。目前，對(duì)單面針的遺傳轉(zhuǎn)化還沒有報(bào)道，選擇不同的外植體部位進(jìn)行條件的優(yōu)化，是因?yàn)檗r(nóng)桿菌侵染時(shí)發(fā)根性與外植體的不同而有所不同。

本研究利用2 種發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1 和ATCC10060轉(zhuǎn)化單面針不同外植體部位，確定發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1轉(zhuǎn)化單面針葉柄（帶葉片）對(duì)毛狀根的誘導(dǎo)成功率最高，單面針毛狀根失去向地性而且生長(zhǎng)迅速。采用PCR 對(duì)成功誘導(dǎo)出來的單面針毛狀根進(jìn)行PCR 分子驗(yàn)證，證明發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1 菌株中Ri 質(zhì)粒T-DNA 片段已整合進(jìn)毛狀根基因組中。本研究成功建立單面針毛狀根誘導(dǎo)技術(shù)，為今后單面針毛狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)及其次生代謝產(chǎn)物活性成分研究奠定了基礎(chǔ)。